Summary
Bir yöntem olup, aynı anda antijenlere karşı yüz Faj gösterimli birleştirici sentetik antikor kütüphanelerinden, ölçeklenebilir, yüksek verimli seçimleri yürütmek için görsel eşliğinde tarif edilmektedir. Bu paralel yaklaşımı kullanarak, standart bağışıklık tahlillerinde işlevsel çeşitli antijenler için yüksek bir çekim ve özelliğe gösteren antikor fragmanları izole ettik.
Abstract
hem temel hem de klinik araştırma uygulamaları ihtiyaçlarını karşılamak antikorlar için talep yüksek olduğu ve dramatik gelecekte artacak. Ancak, geleneksel monoklonal teknolojileri bu göreve kadar yalnız olmadıklarını açıktır. Bu proteom tüm erişilebilir elemanlarına yüksek kalite ve yenilenebilir afinite reaktifler için talebi karşılamak için alternatif yöntemlerin geliştirilmesine yol açmıştır. Bu amaç doğrultusunda, faj-görüntülenen sentetik antikor kütüphanelerinden seçimleri yürütmek için yüksek kapasiteli yöntemleri farklı antijenleri içeren uygulamalar için geliştirilmiştir ve hızlı verim ve başarı için optimize edilmiş. Burada, bir protokol video gösterimi ile bir kılavuzu 96 kanal sıvı tutucu veya otomatik robot sistemi kullanarak hedefleri yüzlerce karşı yüksek çeşitlilik kütüphanelerinden Fab faj klonlarının paralel seçimi göstermektedir ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Bu protokol kullanılarak, tek bir kullanıcı antijenlerin yüzlerce oluşturmak,Paralel onlara antikorları seçmek ve 6-8 hafta içinde antikor bağlanmasını doğrulamak. Vurgulanan şunlardır: i) uygulanabilir bir antijen biçimi, ii) ön seçim antijen karakterizasyonu, iii) kritik özel ve yüksek afinite klonlarının seçimi etkileyen adımlar, ve iv) izleme seçim etkinliği ve erken evre antikor klon karakterizasyonu yolları. Bu yaklaşım ile, tek geçişli membran reseptörleri salgılanmış protein hormonları, ve çoklu alan hücre içi proteinler de dahil olmak üzere pek çok hedef sınıflarına sentetik antikor fragmanları (Fab'lar) elde edilmiştir. Bu fragmanlar, tam uzunluktaki antikorlar dönüştürülür ve yüksek bir çekim ve özelliğe arzettiği doğrulanmıştır. Dahası, Western blotting, ELISA, hücresel bağışıklık, immüno-çökeltme ve ilgili deneyler de dahil olmak üzere, standart bağışıklık tahlilleri, çeşitli işlevsel olduğu gösterilmiştir. Bu metodoloji antikor keşif hızlandırmak ve sonuçta amaç o hayata yakın bize getirecekf proteomu yenilenebilir, yüksek kaliteli antikorlar üreten.
Introduction
Post-genomik yaş başlaması ile karakterize ve proteinleri modüle kaliteli bağlayıcı reaktif durumu, yeni araştırma ve tedavi yollar açmak için esastır. Antikorlar, temel araştırma ve teşhis araçları ve potansiyel terapötik olarak hem akademik hem de endüstriyel araştırmacılara önemli olmaya devam etmektedir. Değil şaşırtıcı, özel antikorlar üretmek için geleneksel hibridoma teknolojileri güvenmek çoğu sözleşme antikor geliştirme firmaları, etkileyici bir büyüme olmuştur. Bununla birlikte, faj-görüntülenen antikor kütüphaneleri kullanılarak in vitro seçimi geleneksel teknolojiler sınırlamalar 1, 2 yüz benzersiz avantajlar ve başarı sunabilir güçlü bir alternatif teknoloji haline geliyor.
Araştırma araçları, üretmek için iki temel sorunlar olarak yüksek kaliteli antikorlar için önemli talep ışığında yenilenebilir antikorlar 1) Seçim çıktı ve 2) antijen av vardırailability. Grupların bir dizi şimdi verim ve antikor tanımlama oranını artırmaya yönelik in vitro seçim boru hatları tarif var. Bu açıklamalar detay tam uzunlukta ya üzerine seçerek dahil canlı yaklaşımların çeşitli kullanarak, 3,4 hedefler, veya yapısal etki 5,6,7 ilgili ya boncuk-tabanlı 6,8 veya 3,4 antijen immobilizasyon düzenleri tabanlı plaka. Buna ek olarak, gen sentezi teknolojileri 9 artan kabul maliyet etkin ve potansiyel olarak saflaştırılmış, tam uzunlukta antijenin yeterli miktarlarda elde etmede güçlükle hafifletmek, özellikle izole edilmiş alanlarının sistematik antijen üretimi yaptı. Tandem iki teknolojiyi kullanarak, kendi kendine yeten ve ölçeklenebilir antijen üretimi ve antikor seçimi boru hattı dile antijen alanların büyük kümeleri için antikorların paralel izolasyonunu sağlamak ve cha için reaktiflerin gelişimi kolaylaştırmak olacağını icat edildiyapısal ve işlevsel olarak ilgili proteinlerin bütün sınıfları racterizing.
Bu amaçla, eksprese antijen etki gen sentezi, antijenler ve ölçeklenebilir faj gösterimli antikor seçimleri yüksek verimlilik bakteriyel ifade silico tanımlanmasında çiftler geliştirilmiştir entegre bir boru hattı doğru. Bu boru hattı (lisans veya malzeme transferi anlaşması ile giderek mevcut antikor kütüphaneleri dahil) en yaşam bilimleri laboratuvarlarının mevcut sadece temel altyapı gerektirir, ama aynı zamanda bir endüstriyel ölçekte kullanım için otomasyona müsait. Bu protokol kullanılarak, afinite-etiketli antijen etki yüzlerce üretmek mümkündür ve rutin olarak bu antijenlerin çoğu son derece spesifik antikor fragmanları izole eder.
Faj ekran teknolojisi Fab, scFv ve özerk Fv etki ve a içeren rekombinant afinite reaktif biçimleri çok çeşitli gösterdi uyumluluk göstermiştirküçük 'alternatif çerçeveler' (tasarlanmış ankirin tekrar proteinleri (DARPINS), fibronektin (Fn), lipokalin etki ve daha 10) artan dizi. Bu yöntemler, kütüphanelerin diğer tiplerine adapte edilebilir kabul edilir, ancak Tartışma, antikorun ve antijenin Fab fragmanlarının izolasyonu için bu örnekteki sınırlıdır. Bu teknolojiyi kullanarak, küçük düşük nanomolar afinite ile Fab'ler, tam boy bir protein bağlama ve bağışıklık gibi bağışıklık tahlillerinde işlevsel olan birçok RNA bağlayıcı proteinler ve diğer başarılı seçilmiştir transkripsiyon faktör etki, SH2 etki alanları, de dahil olmak üzere protein alanlarının etiketli , immunopresipitasyon ve immunohistokimyasal. Önemlisi, rekombinant bağlayıcı klonlar tamamen yenilenebilir ve ifadeden yeniden üretilebilir ve böylece titiz klon doğrulama gider haklı, bakteriyel üretim sunan artan tutarlılık, tekrarlanabilirlik ve maliyet-etkililik yoluyla oluşturur.
Bu prot olarakocol ve eşlik eden video, immobilize edilmiş antijen sahaları kullanılarak faj görüntülemeli kütüphanelerinden antikor seçimi için temel yöntem gösterilmektedir. Diğer etiketler 11,12,13 ve seçim formatları da başarılı bir şekilde kullanılmıştır 13,14,2 rağmen, bu özel bir yöntem olup, mikro plakalar içinde pasif adsorpsiyonla da immobilize edilmiş GST-etiketli protein etki kullanmaktadır. Belirlenmesi ve doğrulama için özel zenginleştirilmiş klonal antikorlar izole yönelik seçim parametreleri paralel izleme seçimleri kurulumu ve yürütülmesi için kritik hususlar ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Antijen Nesil
Not: Antijen etki sentezlenmiş ve uygun bir IPTG uyarılabilir sentezleme konstruktu içine ticari satıcılardan çeşitli ile klonlanabilir.
- Kimyasal yetkili, T1-faj içine ifade yapıları Transform dayanıklı, BL21 E. kimyasal olarak kompetan hücreler 20 L ilave edildi, 96 PCR plaka buz üzerinde 1X KCM 20 ul DNA kodlayan 10 ng karıştırılarak coli hücreleri.
- 10 dakika boyunca oda sıcaklığında, 20 dakika süreyle buz üzerinde hücre / DNA karışımı inkübe ve daha sonra buz üzerine tekrar 2 dakika süreyle bir hava plaka conta ile, glukoz (SOC) ortamı ile önceden ısıtılmış süper uygun suyu 100 ul ile tahlisiye kapsayan önce ve 2.5 cm orbital sallayıcı içinde 200 rpm'de 1 saat boyunca 37 ° C'de çalkalanarak.
- Luria-Bertani (LB) karbenisilin ile desteklenmiş / agar plakaları (100 ug / ml) ile için kullanılan tek koloniler elde etmek için O / N büyümesi ile transforme edilmiş hücrelerin plaka 5 ulgliserol stokları üreten.
- 5 ul gliserol stoku 2YT / karbonhidrat ortam 1 ml aşılamak ve bir 2.5 cm orbital sallayıcı içinde 200 rpm'de çalkalanarak, 96 gözlü derin gözlü bloğu içinde 37 ° C'de 12 saat boyunca büyümektedir.
- NZY media15 inoküle bu kültürün bir 1:40 seyreltme ile (% 0.05 glukoz,% 2 laktoz ve 100 ug / ml karbenisilin ile desteklenmiş), daha sonra bir 2.5 cm x yörünge 30 ° C ve 200 rpm'de 6-8 saat için sallayın çalkalayıcı.
- Pelet bakteriler daha önce yayınlanmış protocols16,17 göre Ni-NTA reçinesi 100 ul ihtiva eden bir 96-çukurlu bir filtre plakası, yüksek verimlilik antijenik proteinlerin saflaştırılması ve.
- Bradford boya bağlama assay18 ile arıtılmış protein konsantrasyonunu belirlemek ve bir SDS-PAGE jeli üzerinde ayırma ve Coomassie boyası ile 10-50 ug görselleştirilmesi ile boyut ve saflık durumu hakkında karakterize (Bakınız Şekil 2).
NOT: Bu aşamada proteinler, protein birikiminin 19 değerlendirmek yöntemlerle karakterize edilebilir 20 katlanması.
Faj Kütüphanesi 2. Hazırlık ve Titrasyon
- T1 faj dirençli E. tek bir koloni almak 50 ug / ml tetrasiklin ile desteklenen 2YT ortamı 1 ml coli hücreleri.
- Hücre büyümesi, görsel olarak bir kez kurulduğunda, enfeksiyon için yeterli bir hücre hacmi sağlamak için 50 ug / ml tetrasiklin ile desteklenen 2YT daha büyük bir hacimde kültür seyreltik (kütüphane seyreltme başına genellikle 45 ul, aşağıya bakınız.).
- 30 dakika karıştırıldı ve topaklama için buz üzerinde enkübe otoklava% 20 PEG-8000, 1/5 hacim, 2.5 M NaCl (PEG-NaCI) ile depolama tamponu faj çökeltme kullanımı için kütüphane hazırlanması 12,000 x g'de santrifüj ile faj çökeltilmiştir.
- Süpernatant atılır ve tekrar süspansiyon t ayarlanması, 1 x PBS, pH 7.4,% 0.2 BSA ve% 0.05 Tween (PBT), uygun hacimde bir faj çökeltilmişO seçimler için uygun bir faj konsantrasyonu (eğer gerekli ise) yeterli bir literatür kapsama sağlamak için. Adım 2.9 ve Tartışma bakın.
- Steril, çok oyuklu bir plaka içerisinde 1x PBS pH 7.4 içinde 45 ul bir 5 ul faj kısım seyreltin karıştırın ve aynı tampon maddesi içinde 10 misli seyreltilmiş bir dizi oluşturmak.
- T1 faj dirençli D 45 ul, her bir faj bir seyreltinin 5 ul ekleyin. E. coli bir çok oyuklu bir plaka içerisinde log fazı büyümesinde hücreler (= 0.4-0.8 OD 600), hava alabilir bir contalı kapak ve bir 2.5 cm orbital sallayıcı içinde 30 dakika boyunca 200 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de inkübe edin.
- Plaka, 5 g / ml karbenisilin 100 ile takviye edilmiş bir önceden ısıtılmış agar plakası üzerine kuyuların herbirinden enfekte olmuş hücrelerin ul ve koloniler görünür olana kadar 37 ° C 'de O / N büyür.
- Aşağıdaki gibi toplam faj / ml hesaplayın:
En sulandırmak örnek x 200 x 10 i (i = maksimum num bir carbenicillin plaka üzerinde kolonilerin Faj / ml = sayıseyreltmelerin ber hangi kolonileri) belirgindir. - Aşağıdaki gibi kütüphane çeşitliliğinin kapsama sağlamak için, kaplanmış antijen kuyu sayısını belirlemek için, hesaplayın:
Kaplanmış antijen kuyuların sayısı gerekli =
İstenilen kat kapsama * kütüphane çeşitliliği
100 ul başına faj içinde
Faj-görüntülenen Kütüphaneler 3. Antikor Seçimi
3.1) Antijen Hareketsizleştirme
- Antijen kalitesini etkileyebilir ve dilüsyonları kolaylaştırmak için, 96 gözlü plakalar olmayan bağlanma için 100 x çalışma konsantrasyonlarda (örneğin, 500 ug / ml) ve kısım normalize stok antijen proteini plaka hazırlanması donma-erime döngülerinden kaçınmak için.
- PBS ile stok plakalarından seyreltilmesi ile seçimleri her turda bir gün önce hisse senedi protein çözümleri antijen kaplı tabak hazırlayın.
- Ceket 96 oyuklu GST-etiketli antijen proteini veya negatif kontrol, p 100 ul yüksek protein bağlanması polistiren plakalarrotein PBS içinde 5 ug / ml'de (GST BSA, nötravidin, vs.). Bir mikro-plaka karıştırıcısı üzerinde 250 rpm'de 4 ° de CO / K çalkalayın.
- Mikro kaplanmış protein çözeltisi çıkarın (1x PBS pH 7.4 içinde% 0.2 BSA) tampon maddesi bloke 200 ul antijen kaplı ve negatif seçim plakaları bloke eder ve 1-2 saat boyunca oda sıcaklığında 250 rpm'de çalkalanır.
- Bloke edildikten sonra,% 0.05 Tween (PT), ya elle ya da otomatik bir mikro yıkayıcısı kullanılarak tampon 1x PBS pH 7.4, 200 ul bloke protein kaplı plakaları dört kez yıkayın.
3.2) Kütüphane Ön temizleme ve Antijen-faj Kuluçka
- Olmayan kütüphanesi tüketmek (veya etiketi-) negatif kontrol proteini ya da serbest afinite etiketi ile kaplanmış kaplara bir dizi PBT tampon maddesi içinde hazırlanmış faj kütüphanesinden 100 ul (10 ila 12 faj) transferi yoluyla spesifik bağlanma faj gösterimli antikor fragmanı klonlar protein (örneğin GST) hedef sayısına eşit ve faj inkübe250 rpm'de çalkalanarak oda sıcaklığında 1-2 saat için yuvalar içinde.
Not: alternatif bir ya da negatif seçim için ek aracı olarak, inkübasyon daha da spesifik bir hedefin kurtarma etiket bağlayıcı bulunan klonları ortamdan uzaklaştırmak ve geliştirmek için fazla miktarda (5-25 uM), çözünür protein afinite etiketi (örneğin GST) varlığında gerçekleştirilebilir klonları bağlayıcı. - Antijen kaplı plakalara negatif seçim transfer faj süpernatan ve spesifik bağlama klonlarının yakalanması için 250 rpm'de çalkalanarak oda sıcaklığında 1-2 saat süre ile inkübe edilir.
- Bağlanmamış faj çıkarın ve mikrolevhanın kuyu yıkama, 8-15 kez PT tamponu ile elle veya bir mikroplaka yıkayıcı kullanırken. Elüsyonun hemen önce aşırı yıkama tamponu çıkarın.
3.3) Elüsyon, Enfeksiyon ve Phage Amplifikasyon
- Erken seçim gününde, T1 faj dirençli E. tek bir koloni almak 50 ug / ml tetrasiklin ile desteklenen ve 37 ° C'de wi büyümeye 2YT ortam 1 ml coli hücreleri2.5 cm'lik orbital çalkalayıcı veya eşdeğeri 200 rpm'de sallayarak inci.
- Hücre büyümesi kurulmuş ve gözle görülebilir bir kez 2YT (genellikle seçim başına 100 ul de), enfeksiyon için yeterli bir hücre hacmi sağlamak için 50 ug / ml tetrasiklin ile desteklenen ile ortamın hacmini arttırırlar.
- Daha sonra bağlı faj, 30 dakika boyunca 37 ° C'de yıkandı antijen tabağa, 100 ul ve sallayın elüt edilmesi için, 0,4-0,8 600 ulaşıldığında bir OD (yaklaşık 5-7 saat) kadar hücreler büyür.
- 1 10 x 10 hücre / ml'lik bir nihai konsantrasyona kadar M13K07 yardımcı faj eklenir ve 200 rpm'de çalkalanarak 45 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- 2YT 1.2 ml hücreleri aktarın 150 ug / ml karbenisilin ve 75 ug ile takviye / ml kanamisin 2.5 cm, 200 rpm'de çalkalanarak, 37 ° C'de, V-altlı ve büyümek O / N olan bir 96-iyice derin sağlam blok yörünge çalkalayıcı.
3.4) Faj hazırlanması ve Selec tekrarlanan yuvarlarsiyon
- Santrifüj ile pelet bakteriler, 4 ° C'de 15 dakika boyunca 4000 x g'de.
- 10X PBT 10/1 inci hacmi ile nötralize etmek ve karışımı, küçük bir tüp 96-çukurlu, steril mikro mavi kutu kopya plakalarda faj yüzer eşit hacimlerde karıştırın. Seçim tekrarlayın mermi 3-4 tur için (Adım 3.1.1 başlayarak) veya zenginleştirme görülünceye kadar negatif kontrol proteine göre (Bölüm 4. ve 7.).
Not: seçim erken turlarda önemli / tespit zenginleştirme beklenmemektedir zaman (yani 1 yuvarlar ve 2), (Şekil 3'te gösterildiği gibi, Bölüm 7 ve örnek sonuçları tarif edilmiştir), giriş ve çıkış faj titrelerinin ölçümü sağlamada yararlı olabilir en az faj (Tartışma tarif edilmiştir) başarılı seçimler için konsantrasyonlar ve bir araya ELISA daha uygundur.
Toplanmış ELISA ile 4. Karakterizasyon
- Ceket 96 oyuklu yüksek protein-bağlamaBölüm 3.1'de göre 2 ug / ml bir antijen proteini ya da negatif kontrol proteini (GST BSA, nötravidin gibi) GST-etiketli 100 ul polistiren plakaları ing ve 4 ° CO / N olarak çalkalanır.
- , Fazla antijen çıkarın mikro çalkalayıcı içinde 250 rpm'de, oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca çalkalanarak blokaj tamponu içinde 200 ul plaka blok ve her iki el ile ya da otomatik plaka yıkayıcı ile 200 ul PT tamponuyla dört kez yıkayın.
- (: 10-1: 1 seyreltilmiş PBT tamponu içinde 20), faj üst fazı, 100 ul uygulayın, 200 ul PT tamponu ile, sekiz kez oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 250 rpm'de sallamak ve plaka yıkanır.
- (: PBT tamponunda 5,000 1) 100 Anti-M13-HRP ul ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika için 200 rpm'de çalkalanır, daha sonra 200 ul PBS ile iki kez plaka altı 200 ul PT tamponuyla kez yıkayın.
- 1 100 ul uygulanır: 1 TMB substratı ve 5-15 dakika için geliştirme (ya da önemli bir renk gelişene kadar), daha sonra 1 MH 3 100 ul ilave etmek suretiyle reaksiyonu durdurun 4 ve 450 nm'de plaka okuma.
- Genel olarak, faj havuzları zenginleştirme> 2 (Bakınız Şekil 4) spesifik olmayan bağlanma karşı spesifik bağlanma oranı olarak mermi 3-4 gözlenebilir
NOT: Bu benzeşme etiketi protein yüksek mutlak bağlayıcı sinyal dikkat bilgilendirici etiket özel bağlayıcı (yerine hedef bağlayıcı değil) zenginleşmesine gösterir, ve negatif kontrol protein yüksek mutlak bağlayıcı sinyal "non-spesifik veya zenginleştirme gösterir yapışkan "bağlayıcı maddeler.
5. Klon Seçimi, Sıralama ve Karakterizasyonu
Tek Fab faj klonlarının 5.1) İzolasyon
- , Sıralama ve karakterizasyonu için bireysel klonlar izole T1 faj dirençli E. çoğaltılan faj havuzu 1/10 inci hacmini bulaştırmak için E. coli, bir yuvarlak dipli mikrotitrasyon plakasına büyüme log fazında hücreler (= 0.4-0.8 OD600), bir Breatha ile kapakble plaka contası ve 37 ° C'de 30 dakika süre ile, 200 rpm'de çalkalayarak kuluçkalayın.
- 2YT ortamı içinde 10-kat seri dilüsyonları hazırlayın ve ug / ml karbenisilin 100 ile takviye edilmiş ayrı agar plakaları üzerinde plaka.
- 1 x 10 9 M13K07 faj / ml ile takviye edilmiş 2YT / karbonhidrat ortamı 450 ul tek koloniler ve 200 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de inkübe mini tüp 96 çukurlu steril mikro kutu mavi O / N büyür.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 4,000 x g hızında eğirme Pelet bakteri.
- Yada (Bölüm 5.4 de tarif edildiği gibi) klonal faj süpernatan Fab faj klonlarının sıralama için kullanılabilir klonal direkt bağlanması (Bölüm 5.3 ve 21 de tarif edildiği gibi) olan temsil edici sonuçları Şekil gösterilmiştir hareketsiz antijenlere karşı özelliklerinin belirlenmesi için ELISA'lar 5.
Karakterizasyon için Fab klonlarının 5.2) sentezlenmesi
- Aşağıdaki uygun bir e klonlamaXPression vektörü (Tartışma), tek E. almak E. coli ifadesi ile dönüştürülmüş koloniler steril kürdan veya pipet kullanarak 200 rpm'de çalkalanarak 37 ° C'de 12-16 saat boyunca büyümeye bir 96 gözlü derin gözlü plaka içinde 2YT / karbonhidrat eden 1 ml'lik ortam ile de oluşturur. Bu, ya elle ya da otomatik bir koloni toplayıcısı ile yapılabilir.
- Studier et al metodoloji uyarınca bir 96 yuvalı derin bölmeli blok glikoz / laktoz / gliserol ile takviye NZY ortamı 1,5 ml büyüyen kültürün 40 ul transfer. 15
Not: Alternatif olarak, hücreler 1 mM IPTG eklenmesi ile meydana takviye olmayan ve protein ekspresyonu 3-4 saat (OD 0.8-1.0) için yetiştirilebilir. - Bir hava contası kültür blok (lar) kapatılır ve 200 rpm'de çalkalanarak 30 ° C'de 6-8 saat boyunca Fab klonlarından ifade eder. 15 dakika boyunca 4000 x g'de santrifüj plakalar, bakteriyel hücreler pelet liziz kadar -20 ° C 'de pelet folyo conta ile yüzer, kapak plakaları kaldırmak ve dondurulur.
- Liziz tamponu, 100 | il (Tris HCI 50 mM, 200 mM NaCI,% 1.25 Triton X-100, pH 1 mg / ml lizozim ve 10 U benzonaz / ml kültür ve proteaz inhibitörleri ile 8.0) ile toplanmıştır peletler ifade edilen Fab'ler kurtarmak ve 2 çalkalanarak 4 ° C 'de sa.
- 4 ° C'de 15 dakika boyunca 4000 x g'de santrifüj ile hücre artıkları çıkarın ve ELISA plakaları (Bölüm 5.3) ile özgüllük İlk özellik kazandırmaya kullanılmak üzere ham lizat supernatant toplamak.
Klon Fab ELISA Binding Doğrudan tarafından 5.3) Klon Karakterizasyonu
- Bunun yerine, bir 384 gözlü bir levhanın gözleri PBS içinde 2 ug / ml antijen, 30 ul aliquotting Bölüm 3.1'de tarif edildiği gibi antijenleri hareketsiz. 96 kanal-tabanlı dağıtım kafaları kullanırken plaka Quad-tabanlı antijen düzenleri reaktif transferini kolaylaştıracak. Bölüm 3.1 uyarınca yıkayın ve blok ELISA plakaları.
- Toplanan temizlendi lizatları Bölüm 5.2 eva immobilize antijen doğrudan uygulanabilirbağlanmasının luation. 200 rpm'de çalkalanarak oda sıcaklığında 15 dakika boyunca oyuk başına lizat 30 ul inkübe edin.
Not: Saflaştırılmış Fab klon proteini alternatif olarak tarif edildiği şekilde, PBT tamponu içinde 10 ug / ml'ye dilüe edilir ve antijeni veya negatif kontrol proteini (GST BSA gibi) ihtiva eden bloke edilmiş gözlere Her klon, 30 ul uygulanarak ve geliştirilerek kullanılabilen Aşağıda. Alternatif olarak, Fab faj ayrıca faj süpernatan 10 ul seyreltilmesiyle kullanılabilir 20 ul PBT tamponu (Bölüm 5.1'de tarif edilen) (1: 3) ve (Adımlar 4.4 tarif - 4.5), anti-M13-HRP antikorları ile bulgulanması - Fazla Lisatı çıkarın ve elle veya otomatik bir plaka PT tamponu 8x 100 ile ul yıkanır ve fazla tampon kaldırmak kullanarak kuyu yıkayın.
- 200 rpm'de çalkalanarak, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBT tamponu içinde sekonder anti-FLAG antikoru 5000 seyreltme: 1 30 ul inkübe edin.
- Yıkama, geliştirmek ve Bölüm 4.3 uyarınca ölçmek - 4.5.
NOT: Temsilcisi sonuçlarıgösteren spesifik ve spesifik olmayan hem de bağlama klonları, Şekil 5'te gösterilmiştir.
5.4) Klon Sıralama
- Tablo 2'de gösterildiği gibi, bir PCR ana karışımı hazırlayın.
- PCR bir levhanın gözleri içine uygun primerler ile hazırlanan PCR ana karışımı 20 ul uygun PCR şablonu (faj üst fazı veya yeniden süspansiyon haline tek, fajemid ihtiva eden bakterilerin koloni olarak) 2 ul ekle.
Not: Ayrı ana karışımlar, hem ağır hem hafif zincir genleri sekanslanması için gereklidir. - PCR Ayarlar - Tablo 2'de listelenen parametreler kullanılarak, PCR reaksiyonu şu koşullarda yürütülmüştür.
- 300 mil transilluminator'de DNA görselleştirme leke ve görüntüleme ile takviye edilmiş,% 1 agaroz jeli üzerinde yükleme boyası ile tamamlanmış reaksiyon 5 ul karıştırarak PCR reaksiyonunun başarılı olduğunu doğrulamak.
- 0.2 ihtiva eden steril su, 10 ul PCR ürün 2 ul ekleVe eksonükleaz ve karides alkalin fosfatazı her ul sıralama için hazırlık fazla primerler çıkarmak için 10 dakika boyunca 80 ° C'de enzim inaktivasyonunun, ardından 20 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
Otomatik Seçimleri için 6. Ölçeklendirme
6.1) Pipet-tabanlı Sıvı Taşıma
- Bir% 1 Hazırlama su içinde (ağırlık / hacim) bromofenol mavisi ve 0.45 mi filtre kullanılarak çözülmeyen partikülleri çıkartmak.
- (16 seyreltme toplam), su içinde% 1 bromofenol mavisi çözeltisi 1000 seyreltme, ve iki misli seri seyreltileri ile devam: plaka okuyucusu üzerinde absorbans doğrusal aralığını belirlemek için, bir 1 hazırlayın.
- Düz tabanlı 96 çukurlu bir levhanın her seyreltme oranından 100 ul aktarın ve 590 nm'de absorbans okundu. Arsa mutlak seyreltme faktörü karşı absorbans ve sonraki testler için lineer aralığı yüksek sonunda orta bir seyreltme seçin.
- Su veya fiili çözüm bromofenol mavisi ekleÜç 96 gözlü plakalara pipetle için yeterli hacim içinde önceki aşamada seçilen seyreltme, ayrıca rezervuar ölü hacmine bağlı olarak pipetle edilecektir.
- Bir analitik terazi üzerine su pipetle test hacmi verecek şekilde tek kanallı pipet kalibre su (100 ul, oda sıcaklığında, 100 mg ağırlığında).
- Kalibre pipet kullanarak, üç kopya halinde, 590 nm 'deki absorbans bir yassı dipli, 96 gözlü bir levhanın en az üç kuyu için boyalı çözeltinin Test hacim transferi ve okuyun.
- Bir analitik terazi üç boş düz tabanlı 96 kuyu plakaları tartılır ve onların kitleleri kaydedin.
- Hazneden üç 96 gözlü levhalar her birine ve üç kopya halinde, 590 nm'de absorbans ölçümü Pipet test hacmi.
- Her plaka tartın ve kütle farkı hesaplar.
- İlk olarak, (örn., +/-% 5) her bir çukuruna absorbans tolerans aralığında düzgün olup olmadığını değerlendirmek ve inci ile uyumlu olup olmadığınıkalibre Pipetman el-pipetleme ile elde e absorbansları. Belirli kanallar sürekli aşırı veya az teslim iseniz, (örneğin bakınız Şekil 6) onarım prosedürleri takip ve tüm kanallar üniforma birimleri teslim kadar değerlendirme prosedürü tekrarlayın.
- İkincisi, bir kez tüm kanallar kuyu başına, üniforma hacimleri teslim ortalama kütle farkı hesaplayarak bu hacmin doğruluğunu kontrol etmek teyit edilmiştir. Örneğin, 100 ul için mükemmel kalibre edilmiş sıvı işleyici grubu plaka başına su 9.60 g, ya da su, 0.10 g oyuk başına sağlayacaktır. Teslim gerçek hacmi sürekli üzerinde veya amaçlanan hacim altında ise, o zaman bir düzeltme faktörü, yani aslında 100 ul sunmak için 110 ul programlama, uygulanabilir.
NOT: Küçük hacimler için, örneğin, 10 ul ab sağlamak için, elle 96 oyuklu plakalara 90 su ul boyanmış çözelti içinde daha fazla bromofenol mavisi ve ön kısım on kat kullanımısorbances lineer aralıkta ölçülebilir ve sonbahar vardır.
6.2) Otomatik Plaka Yıkama
- Bölüm 3.1'de tarif edildiği gibi 96 ayrı kuyuların de (her bir durum için iki tabak test edilecek) mikro pozitif hedef ve negatif kontrol proteinleri hareketsiz.
- Oda sıcaklığında bir saat için bloke etme çözeltisi ile kuluçkaya yatırılması ile spesifik olmayan bağlanma yerleri bloke eder.
- 10 13 cfu özdeş 100 ul alikotları ekleme / Tüm plakalara tüm oyuklara PBT Fab faj çözeltisi bağlayıcı hedef ve 2 saat boyunca oda sıcaklığında hafif ajitasyon ile inkübe ml.
- Her bir durumda, enfeksiyon ve titrasyon ve ELISA için, bir plaka, bir plaka göre iki tabak yıkayın.
- (Bölüm 4'te tarif edildiği gibi), anti-M13 HRP antikoru ve kolorimetrik alt-tabaka ile ya da geliştirme ((M13K07 ilavesi) ve 7.2.1 olmayan Bölüm 3.3 de tarif edildiği gibi) bakteriler ve titrasyon direkt enfeksiyonu ile yıkama etkinliğini değerlendirmek.
- Faj titreleri from spesifik klonlann genellikle klon spesifik olarak bağlanan kendisine karşı bir hareketsiz hale getirilmiş proteine 10 5 -10 7 faj / ml aralığında sağlayacaktır. Negatif kontrol protein (örneğin, BSA) Bazı kalıntı bağlama hangi tehlikeye düşürebilecek, beklenen ve genellikle 10 -10 2 5 faj / ml gözlenir, ancak çok düşük titreleri (yani., <10 1) aşırı sıkı yıkama sinyal olabilir olduğu Bir seçim.
- Faj ELISA ile belirlenmiştir bağlanma için robotik yıkama kurulan el yıkama sonuçları (Şekil 7) denk ise, pozitif ve negatif kontrol proteinleri belirlemek için, mutlak bağlayıcı sinyalleri karşılaştırmak.
6.3) Plaka Yıkama atım
- Başlatmak için, test edilecek dekontaminasyon protokolünü çalıştırın.
NOT: En az iki kat toplam hat hacmini kullanarak ve başbakan ve 5 dakika içinde% 0.5 sodyum hipoklorit için yıkama kafasını emmek tavsiye, taze seyreltilmiş from ticari ağartıcı (tipik olarak% 6 sodyum hipoklorit). - Çizgiler kadar Başbakan ve steril (otoklav), su içinde 5 dakika boyunca yıkama kafasını ıslatın ve nihayet, Başbakan sistem hava dolu.
- Prime steril su ya da yıkama tamponu ile hatları.
- Bir zamanlar steril 96 kuyu mikroplağı yıkayın yıkama kaldırmak ve steril plaka mühür ile mühür. Bu ön-kirlenme kontrolü plaka.
- Kısım O 100 ul / K, 96 gözlü bir levhanın tüm oyuklara faj kültür süpernatanı ile yükseltilir.
- Bir kez faj içeren plaka yıkayın, daha sonra yıkama kaldırmak ve plastik veya folyo plaka mühür ile mühür. Bu kirlenme kontrolü plaka.
- Dekontaminasyon protokolü yürütmek test edilir. Bu örnekte, tekrar 6.3.1 ve 6.3.2 adımları.
- Kez steril mikroplağı yıkayın sonra yıkama ve mühür kaldırmak. Bu dekontaminasyon testi plaka.
- Log fazı E. Plaka 50 ul titrasyon plakaları E. coli; Bu ön-enfeksiyonu olanyon kontrol plakası.
- Ön-kirlenme, kirlenme ve dekontaminasyon 96 oyuklu plakalar açmak ve E. 100 ul her bir oyuk için yeni ipuçları kullanan tüm oyuklara log-faz büyüme aşamasında coli.
- Kapatın ve 200 rpm'de 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Levha 50, 10 cm 2YT / karbonhidrat plakalarına her 96 oyuklu plakanın rasgele üç kuyu enfekte olmuş hücrelerin ul ve 37 ° CO / N inkübe edin.
- 1 ml'lik 2YT artı oyuk başına 100 ug / ml karbenisilin içeren derin oyuklu plakalara her plakanın tüm oyuklara transfer enfekte hücreleri 50 ul ve 37 ° C 'de O / N büyür.
- Dekontaminasyon protokolünü tekrarlayın ve çizgiler kurumaya bırakın pulu.
Not: plakalar üzerinde ya da sıvı bir ortam içinde Resim O / N büyüme öncesi enfeksiyon kontrolü, ön-kirlenme kontrol veya dekontaminasyon test plakları üzerinde dikkat edilmelidir. Birçok koloniler ve büyüme kirlilik kontrolü plaka üzerinde dikkat edilmelidir; etkinliği hakkında değilse, hiçbir sonuçarındırma protokolü yapılabilir. İdeal olarak, dekontaminasyon plakaları hiçbir koloniler ve O / N plakalarının havuzlarına hiçbirinde O / N büyüme verecektir. dekontaminasyon protokolünün sıkılığı, yüksek ağartma konsantrasyonları artmış uzun süreleri ve ek döngülerini emmek olabilir.
7. Giriş / Çıkış Titrasyonları
7.1) Giriş Phage Titrasyonları
- Steril olarak filtreden geçirilmiş, PBS ile 50 ul faj 5 ul kısım seyreltin ve karıştırın.
- Çok kanallı bir pipet ya da 96 kanallı pipet kullanılarak 10, 10, steril olarak filtreden geçirilmiş, PBS içinde 10 kat seri seyreltme hazırlayın.
- T1 faj dirençli E. 45 ul içinde seyreltilmiş faj 5 ul inoküle büyüme (OD 0.6-0.8) ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca bir hava contası ile kaplı inkübe log fazında coli hücreleri.
- 100 ug / ml karbenisilin ve O / N inkübe ile takviye edilmiş LB / agar plaka ile enfekte olmuş hücrelerin Levha 5 ulT, 37 ° C'dir.
- faj konsantrasyon kolonileri Bölüm 2.8 ayrıntılı hesaplamalara göre göründükleri en seyreltilmiş örnekten tahmin edilebilir.
7.2) Çıkış faj Pitrations
- E. eklenerek levha bağlı faj elüsyon tarafta coli hücreleri, otoklave 2YT ortamı ile 50 ul faj ile enfekte edilmiş bir hücre 5 ul kısım seyreltik
- Çok kanallı bir pipet ya da 96 kanallı pipet kullanarak 10 6 otoklava 2YT ortamı içinde 10 kat seri seyreltme hazırlayın.
- Levha 5 ila 100 ug / ml karbenisilin ile desteklenmiş bir agar plaka üzerine enfekte olmuş hücrelerin ul ve 37 ° C 'de O / N inkübe edin.
- faj konsantrasyon kolonileri Bölüm 2.8 ayrıntılı hesaplamalara göre göründükleri en seyreltilmiş örnekten tahmin edilebilir.
NOT: Her iki durumda (yani da, giriş ve çıkış faj titreleri, hem tetrasiklin koloni numaraları ile karşılaştırılması (toplam cell sayı) ve kanamisin (yardımcı faj titre) de bilgilendirici olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada tarif edilen protokol paralel Birleşimsel faj gösterimli Fab kütüphanelerinden structurally- ve işlevsel olarak bağlı antijen alanlarının ikisinin de çeşitli antikor fragmanlarının izole edilmesi için kullanılmıştır. Antijen durumu ile ilgili sorunlar antikor seçiminde 23 için uygun olan eksprese antijen etki silico tanımlanmasında göre, pek çok durumda, atlatılabilir. Aynı laboratuar içinde antikor seçimi için (Şekil 1) bir antijen ifade bağlanması ile, seçime Kritik antijen parametrelerinin daha kolay bir şekilde kontrol edilebilir olan bir entegre boru hattının inşa edilmesi mümkün olmaktadır. Bir çok durumda, alan sınırlarının dikkat belirlenmesi antikor seçimleri başarılı kullanıma ifade ve 96 ya da 24 gözlü derin bölmeli plakalarda yüksek verimli ifadesinden yeterince saf bir antijenin yeterli miktarlarda izole edilmesini (Şekil 2) sağlar. Ardışık sırasındaseçim sürecinin mermi, özel olarak antijene bağlanan elüt faj konsantrasyonları ve fajın zenginleşmesi, bir ELISA tahlilinde, ya faj titrasyon (Şekil 3) veya faj havuzları ile (Şekil 4) ile izlenebilir. Bir bağlanma oranı (> 2), genellikle spesifik bağlama klonlarının varlığına işaret etmektedir. Tersine, bir düşük oran (<2) Seçim başarısızlık nedenini belirlemenize yardımcı olabilir. Örneğin, yüksek spesifik olmayan OD oranı <2 spesifik olmayan klonların (veya yapışkan bağlayıcı) olarak yetersiz çıkarılmasını ve seçim protokolünün daha fazla optimizasyon garanti edebilir. Zenginleştirme saptandığında Bununla birlikte, ayrı yüksek afinite klonlar daha sonra sıralama ve karakterizasyon için izole edilebilir. Klon kolorimetrik bağışıklık özelliği ve zenginleştirmek için bir ölçü, negatif kontrol proteini karşı hareketsiz hale getirilmiş antijene Fab faj veya Fab bağlanmasının elde karşılaştırılması (ta bağlanma oranını sağlar edilebilir bağlanmanegatif kontrol proteini veya afinite işareti proteiniyle) (Şekil 5) karşı RGet.
Ölçekleme ve bu yöntemin otomasyon sırasında, sıvı taşıma ünitesinin önemli fonksiyonları değerlendirmesi gerçek seçimleri sırasında kullanılan benzer çözümleri ile düzgün ve doğru çalışmasını sağlamak için yardımcı olabilir. çözümleri emici kromoforların kullanımı akıskanlar tekni˘gi özel kanallar (aspirasyon veya dağıtım) ya tıkalı ya da Şekil gösterildiği gibi kısmi hacim teslim sonuçlanan mühür kaybetmiş algılamak için yardımcı olabilir 6. Otomatik yıkama üniteleri de değişkenlik kaynağı olabilir ve dikkat gerektirir. bilinen bağlanma klonlannın kullanımı, dağıtma hızı, yıkama miktarı ve yıkama sayısı yıkama parametreleri optimize edilmektedir arka plan çıkarıldı bağlanma sırasında korunur bağlayıcı bu hedefe (Şekil 7) olmak üzere, hedef kontrol proteini arasındaki bağlanma karşılaştırılmasına olanak sağlamaktadır. Aşağıdakifaj çözümleri ile bir otomatik plaka yıkayıcı kullanımı, etkili dekontaminasyon protokolleri seçimleri veya farklı seçim prosedürleri ve sorun giderme / yorumlama kılavuzu Tablo 3'te verilmiştir ardışık turlarından çapraz kontaminasyon yokluğunu sağlamak için gereklidir.
Şekil 1. Genel Bakış -. Yüksek verim antijen üretimi ve antikor seçimi boru hattı Bu genel bir temsili antijen ve antikor üretimi seçimi boru hattının bir adım-adım görselleştirme gösterir. antijen etki alanı sınırları içinde silico kimlik kötü karakterize edilebilir proteinlerin etki üzerine gen sentezini, ifade ve seçimi sağlar. Ifade antijen etki hareketsizleştirilir ve co spesifik yüksek afiniteli antikor klonların havuzlarını izole etmek için kullanılırmbinatorial antikor kitaplığından ipliksi faj yüzeyi üzerinde görüntülenir. Bağımsız antijenlerden yıkanır ve büyütülmüş antikor faj havuzları daha sonra. Önceki karakterizasyon için tek bağlama klonlarının izolasyonu için negatif kontrol proteini karşı hareketsiz kılınmış hedef karşılaştıran ELISA bazlı deneylerde spesifik bağlanma klonları yuvarlak-silindir zenginleştirme izlemek için kullanılabilir , lütfen Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Afinite-etiketli antijenlerin Şekil 2. SDS-PAGE görselleştirme. Dile ve saflaştırılmış 6X-HIS-GST-etiketli antijen etki (5-10 kDa etki + 26 kDa KDV) başlangıçta antijenin siliko analizinde tespit temsili bir SDS-PAGE etki alanı sınırları. Protein alanları ifade Affi ile izoledilmekte arıtma boyutu tabanlı kimlik, yeterli verim ve faj-antikor seçimleri kullanımını etkinleştirmek için saflığını sağlamak için önce seçimleri SDS-PAGE ile karakterize edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. faj çıkış titreleri görselleştirilmesi. Faj çıkış titreleri düşük seyreltme belirlemek için çeşitli antibiyotikler (tetrasiklin, karbenisilin ve kanamisin) ile desteklenmiş agar ortamında 10-kat seyreltme serisi üzerinde faj ile enfekte edilmiş hücreleri kaplama ile belirlendiği koloniler olarak gözlenen ve antijeni hedef ve akıtılan bağlı faj sayısını tahmin edilebilir. Büyük görüntülemek için buraya tıklayınızBu rakamın r versiyonu.
Bir araya getirilmiş, ELISA ile negatif kontrol proteini ile hedef Şekil 4. Bağlama oranı. Zenginleştirme ilerlemesi özel hedefleri ve negatif kontrol proteinleri ve / veya izole edilmiş bir afinite etiketi iki karşı bireysel büyütülmüş yürütücüler tarama ile seçim, aşağıdaki mermi değerlendirilebilir. Arsa gösterilen paralel negatif kontrol proteini karşı kendi 96 ayrı antijenlere karşı 96 ayrı faj-antikor havuzlar bağlanması için zenginleştirme oranları bulunmaktadır. Her oran değeri, hedef ya da M 13 faj örtü proteini için spesifik bir HRP bağlı antikoru kullanılarak negatif kontrol proteini ya da faj havuzu bağlanmasını ölçmek iki absorbans ölçümleri elde edilir. 2 ya da daha büyük (kırmızı gösterildiği gibi, genellikle 2-10 ya da daha fazla kadar) ihtiva eden bir eşik oranı zenginleştirme bir gösterge olarak kullanılırve spesifik bağlama klonlarının olası varlığı. Lesser oranlar başarısızlığı veya protokol daha fazla optimizasyon garanti edebilir seçimi ile spesifik konuları delalet edebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. Doğrudan bağlanma klonal Fab faj veya Fab ELISA. (Fab faj veya Fab biçiminde olsun) 384 gözlü levhalar içine hareketsiz hale getirilmiş proteine karşı ELISA-tabanlı tahlil ile değerlendirilebilir tek klonların bağlanma. Fab faj veya Fab bir afinite etiketi M13 kaplama proteinine karşı ikincil bir HRP bağlı antikor kullanılarak tespit edilir bağlama. Antijen, negatif kontrol proteini ve antijen afinite etiketini (GST) hedef klonal Fab faj bağlanması için ham absorbans değerleri, belirli bi gösteren tasvir edilmiştirnders (A01, A04, A06), ve yapışkan bağlayıcı (A05).
Otomatik sıvı taşıma birimi tarafından dağıtılan hacimlerin Şekil 6. Değerlendirilmesi. Robotik veya manuel 96-kuyu pipetleme sistemleri tarafından tasarlanan hacimlerin tutarlı ve doğru teslimat boyalı çözümler ve plaka okuyucu kullanılarak değerlendirilebilir. Bu örnekte, ihtiva eden bir çözelti bromofenol mavisi 10 ul tek uçlu kutu kullanılarak iki 96 delikli plakanın tüm oyuklara pipetlendi sekans olup. Her oyuk enfekte E. yardımcı fajın ilavesinden 90 ul / oyuk DH 2, O, benzer içerir E. coli. 590 nm'de her bir plakanın absorbans üç kopya halinde okunur ve miktarlar, standart bir eğriden interpolasyon kalibre edilmiş bir tek kanal Pipetman kullanılarak hazırlanır. Birinci ve ikinci plaka üzerinde tek bir sıra teslim Birimleri gösterilmiştir. Köknar üzerinde unutmayınt plaka, iyi E04 hiçbir boyalı çözüm alır ve ikinci plaka üzerinde, bir çift hacim alır. Bu uç dokunmatik tutarlı teslimat için yeterli olmadığını gösterir, ve daha fazla optimizasyon gerektirir. , Üçlü absorbans ölçümleri için% 95 güven aralıkları gösterilmiştir.
Otomatik plaka yıkama Şekil 7. değerlendirilmesi. Bağlanmamış faj etkili temizleme yıkama koşullarını değiştirmek, hareketsizleştirilmiş pozitifliği (anti-FLAG antikoru) ve negatif (BSA) ile kontrol proteinlere bağlanarak Fab faj ölçmek için bir ELISA kullanılarak değerlendirilebilir. Bu örnekte, naif kitaplığı (PBT 10 ila 13 hücre / ml) benzer şekilde giriş faj elle, sekiz ya da on altı yıkama ile ya da robot kullanılarak kaldırılır. Immobilize anti-FLAG antikor bağlanma özel olarak BSA bağlanma Kalan faj, her koşulda boyunca aynıdır, indicBu düşük bir akış hızında bu doğacak her iki yöntem de eşit ve yeterince katıdır. Çift havuzdan alınan% 95 güven aralıkları gösterilmiştir.
| ÇÖZÜMLER | |||
| 2YT ortamı - 7.0 ve otoklava ayarlamak 1 L pH su ilave edilir. | maya özü | 10 g | |
| tripton | 16 g | ||
| NaCl | 5 g | ||
| NZY ortamı (1 L), | NZ Amin | 10 g | |
| maya özü | 5 g | ||
| 50X ZYM-5052 | 20 mi | ||
| 20 tuz stoku | 50 mi | ||
| 50x ZYM-5052 şeker stoku (1 L) | glikoz | 25 g | |
| laktoz | 100 g | ||
| gliserin | 250 mi | ||
| 20x tuz stoku (1 L) | Na 2 HPO 4 | 500 mM | |
| KH 2 PO 4 | 500 mM | ||
| NH4CI | 1M | ||
| Na 2 SO 4 | 100 mM | ||
| Carbenisilin (Carb): | 100 mg / ml suda. Filtre-sterilize. | ||
| Kanamisin (Kan): | 25 mg / ml suda. Filtre-sterilize. | ||
| Tetrasiklin (Tet): | 10 mg / ml suda. Filtre sterilize. | ||
| PEG-NaCI | PEG | ||
| NaCl | 2.5 M | ||
| 1x PBS (pH 7.2) | NaCl | 137 mM | |
| KCI | 3mM | ||
| Na 2 HPO 4 | 8 mM | ||
| KH 2 PO 4 | 1.5 mM | ||
| 1X KCM | KCI | 500 mM | |
| CaCl2 | 150 mM | ||
| MgCI2 | 250 mM | ||
| SOC ortamı | maya özü | 5 g / l | |
| tripton | 20 g / l | ||
| NaCl | 10 mM | ||
| KCI | 2.5 mM | ||
| MgSO 4 | 20 mM | ||
| Glikoz | 20 mM | ||
| Bloke etme tampon maddesi | PBS | 1x | |
| BSA | 0.20% | ||
| PBT tampon | PBS | 1x | |
| BSA | 0.20% | ||
| Tween | % 0.05 | ||
| PT tampon | PBS | 1x | |
| Tween | % 0.05 | ||
| Fosforik asit | H 3 P0 4 | 1M | |
Tablo 1. Medya ve Çözümleri.
| PCR MASTER-MIX SET-UP </ Strong> | |||
| Bileşen | reaksiyon başına uL | ||
| Su | 19.45 | ||
| 10x Taq tampon | 2.5 | ||
| dNTP (10 mM stok) | 0.675 | ||
| DMSO | 0.75 | ||
| Taq enziminin | 0.125 | ||
| İleri Astar (100 uM stok) | 0.25 | ||
| Ters astar (100 uM stok) | 0.25 | ||
| Ağır zincir Dizileme primerleri | |||
| M13 İleri primer | GTAAAACGACGGCCAGTACTCGAGGCTGAGCAAAGC | ||
| M13 Ters astar | CAGGAAACAGCTATGACGGGAAGTGTCCTTGACCA | ||
| Hafif Zincir Dizileme primerleri | |||
| M13 İleri primer | TGTAAAACGACGGCCAGTCTGTCATAAAGTTGTCACGG | ||
| M13 Ters astar | CAGGAAACAGCTATGACCCCTTGGTACCCTGTCCG | ||
| PCR AYARLARI | |||
| Adım 1. | 3.00 dakika boyunca 94 ° C | ||
| Adım 2. | 00:30 dakika boyunca 94 ° C | ||
| Adım 3. | 00:30 dakika boyunca 55 ° C | ||
| Adım 4. | 01:00 dakika boyunca 72 ° C | ||
| Adım 2 ve 24x tekrar dön | 2. adıma atlamak | ||
| Adım 5. | 72 07:00 dakika C ° | ||
| Adım 6. | |||
Tablo 2. PCR Master Mix ve Ayarlar.
| Dekontaminasyon sonuçlarının yorumlanması | |||
| Plaka | Beklenen karbenisilin titre | Değilse? | |
| Ön enfeksiyon kontrolü | 0 | Hücreler, pre-enfekte edilmiştir; hiçbir deney sonucuna varılabilir. | |
| Kirlilik kontrolü | çim | Yetersiz kirlenme, sonraki dekontaminasyon etkinliğini değerlendirmek edebilmek için; bu emme yerine faj çözeltisi içinde manifoldu daldırılması düşünün. | |
| Dekontaminasyon testi | 0 | Dekontaminasyon tam değil; zaman emmek artırmak, ağartma konsantrasyonyon ya da denemek SDS ve EtOH yıkar yerine. | |
Tablo yıkama dekontaminasyon 3. değerlendirilmesi. Dekontaminasyon etkinliğini belirlemek için, o yıkama fajla kirlenmiş göstermek için gerekli olan, ve dekontaminasyon protokolü başarıyla kirlenme olduğu elimine söyledi. Direnç carbenicillin görüşmek faj kullanarak, böyle bir testin beklenen sonuçlar gerçek sonuç beklenen sonuç farklı olmalıdır önerilerle birlikte listelenir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro antikor seçimleri yapılırken, seçim başarısı iki temel belirleyicileri üzerine seçilmesi için) iyi katlanmış antijenik hedefler izolasyon 1 ve 2) yüksek fonksiyonel çeşitlilik antikor kütüphanesinin fırsat. Bir çok durumda, iyi bir şekilde katlanmış, tam-boy proteinin yeterli miktarda bulunması sınırlayıcı olabilir. Bu sınırlamayı aşmak için bir yaklaşım, uygun bir afinite etiketine sahip bir bakteriyel ekspresyon vektörü içine sokulması için biyoinformatik analizi 22 tanımlanır ve sentezlenmiş etki kullanmaktır.
, Çözünürlüğü artırmak arılaştırılmasında ve kararsız etki stabilize etmek. 11 istenilen uç dizisi çok yönlü antijen nesil platform sağlar neredeyse sentezleme yeteneğini biyoteknoloji uygulamalarında kullanılan etiketlerin çeşitli vardır. GST-etiketli biçimi yaygın olmasına rağmen, başarılı sonuçlar daha önce olmuşhekzahistidin Fc, halo, maltoz bağlayıcı protein ve mevkiye-etiketler kullanılarak elde edilmesi ve sayısız diğer afinite etiketleri benzer bir platformda kullanım için en uygun hale getirilebilir inanılmaktadır. Ancak, afinite etiketleri downstream uygulamalar 11 yararlı ve istenmeyen olumsuz sonuçlara hem sahip olabilir ve iyice belirli bir formata dayalı bir boru hattı kurulması önce araştırılmalıdır.
Genellikle yeni kullanıcılar bir antikor kütüphanesinin kalitesini değerlendirmek için nasıl soruyu ve hiçbir basit bir cevap olsa, bir genel çeşitlilik, nispi ekran düzeyleri, doğası dahil (doğal veya sentetik olsun) birkaç anahtar özellikleri değerlendirmek için çalışmalısınız ve randomizasyon ölçüde (yani, dizileme ile belirlenen kütüphane içeriği karşı kütüphane tasarım) ve amaçlanan uygulamanın karşı antikor fizikokimyasal özellikleri. Bu protokol kapsamı dışında, daha detaylı Yapıları temizleme rağmenBu özelliklerin nt ve nasıl antikorların seçimini etkileyebilir burada 2,23 bulabilirsiniz. Kütüphane çeşitliliği konusundaki bilgilerin, özellikle, önemli seçimleri sırasında çeşitlilik yeterli kapsama sağlamak için edilir. Tipik haliyle, kütüphanede, her faj klonunun 100-1000 kopya sağlayan bir faj konsantrasyonu istenebilecektir ve kütüphanede mevcut olan herhangi bir gerçek pozitif bağlayıcı maddeler elde edilebilir sağlamalıdır. Ancak, faj, spesifik olmayan bir bağlanma önemli ölçüde üzerinde 10 ila 13 faj / ml ve çok farklı kütüphaneleri için yüzeyler artar mikroplakaya antijene başına tek bir oyuk daha yeterli kapsama sağlamak için gerekli olabilir. Giriş kitaplığı çok seyreltik Diğer taraftan, gerçek pozitif bağlayıcı saf derişimi, bugüne kadar geri kazanılan olmayacak KD (tipik olarak nM) altında olacaktır. Bu kısıtlamalar nedeniyle, faj kütüphaneleri genellikle seçimleri ilk tur 12-13 Ekim faj / ml'ye yeniden süspansiyon haline getirildi edilmelidir.0; Bu konsantrasyonda, bir faj, 100 L alikot 10 9 -10 10 çeşitlilik kitaplığı 1,000-100 kat kapsama temsil eder ve rutin çeşitli antijenlere karşı bağlanma klonları elde edilebilir. Daha az konsantrasyonlarda, ya da artan farklılıklar azından, (Bölüm 2.9 bakınız) ilk turda karşı seçilen antijen kuyu sayısını arttırmak gerekebilir. 1 yuvarlak müteakiben, ancak, kütüphane bağlayıcı olmayan çeşitliliğin en kaldırıldı; yuvarlak 1 çıkış çeşitliliğinin fazla kapsama tek kuyu ile en sık kolayca ulaşılabilir. 96 gözlü plakalar içinde paralel seçimleri durumda, bu ilk tur sonra sadece bir gerekli antijen seçme plakaları sayısını azaltabilir.
Zenginleştirme yeterli olmadığı durumlarda, özellikle seçim ilk turda endişe alanlarını belirlemek için yardımcı olurken gerçek seçimleri sırasında, faj titrasyonu, karakterize ve ilerlemeyi izlemek için nesnel ölçütler sunabilirtespit edilebilir. Bu protokol performansını belirlemek için seçimler ölçekleme sırasında özellikle yararlı olabilir. Genel olarak, giriş faj titreleri (yani, naif kütüphane veya yıkandı, faj amplifikasyon sonrası) potansiyel kontaminasyonu gösteren zayıf hücre büyümesi / düşük faj titreleri ile, (10 12 -10 13 faj / ml) mermi arasında nispeten sabit kalmalıdır ve / veya Bir önceki turda zayıf çıktı. Çıkış faj titreleri seçimi sonraki turlarda zenginleştirme sırasında artması bekleniyor olsa da, ilk iki turda 10 3 -10 5 kob / ml bir dizi bekleniyor. Bu aralıkta sapma gibi kontaminasyon veya aşırı yıkama darlığı gibi seçimi ile olası sorunları gösterebilir. Seçim sonraki turlarda (yani, 3 mermi ve 4), spesifik hedef antijeni bağlayan klonların zenginleştirme hedef antijen hem de olumsuz karşı faj havuzunun bağlayıcı ölçen toplanmış ELISA'larda üzerinden değerlendirilebilirKontrol proteini (Bölüm 4'e bakınız).
Seçim 3-4 turundan sonra (: 2 negatif kontrol proteini sinyal oranını: veya hedef protein üzerinde zenginleştirme bir hedef antijene ulaştığında plan proteinine kıyasla 1 ya da daha yüksek), enfekte olmuş bakteri hücreleri dizme için tek fagemit koloniler izole etmek için plakalanmıştır ilk karakterizasyonu ve klonlama gerekirse. Bu zamanda, ek karakterizasyonu önce Fab serbest Fab faj dönüştürmek için yüksek ölçüde tavsiye edilir. Fab faj faj süpernatan 10 ul seyreltilmesi ile başlangıç karakterizasyonu için kullanılabilir, ancak (Adımlar 4.4'de tanımlanan - 4.5), 20 ul PBT tamponu içinde ve anti-M13-HRP antikorları ile bulgulanması (Bölüm 5.1'de tarif edilen), bizim deneyim, faj parçacık ve erken dönüşüm yanlış pozitif olan sorunları ortadan kaldıran bağlama özellikleri kurtuluş üzerine klonların% 5-20 arası her yerde önemli ölçüde değiştirebilir. dönüşüm için kullanılan özel yöntem UNIQU bağlıdıre fajmid mimarisi ve dolayısıyla burada açıkça ele olmayacaktır. Bununla birlikte, en yaygın olarak kullanılan vektörler içinde, bu, genellikle, bir yetkili olmayan bastırıcı E için saflaştırılmış fajmid (veya fajmid havuz) 1) dönüşümü ile gerçekleştirilebilir örneğin HB2151 veya 55244 bir amber durdurma (TAG) kodon Fab ve hap protein Fab ve hap proteinler arasında bir amber durdurma kodonunun 2) sokulmasını baskılayıcı olmayan bir suşu çözünür antikor fragmanlarının ekspresyonunu sağlamak için müdahale eder veya E. coli suşu 3) uygun bir ifade vektörüne ayrı ayrı fajmid veya fajmid havuz) immunoglobülin genlerinin (klonlanmasıyla. Ayrıca seçimi ve karakterizasyonu düzene için, toplanmış klonlama yöntemleri bile, hem ifade lisatlan erken karakterizasyonu için kullanılan Fab-faj partiküllerinin ve yanlış-pozitif bağlama potansiyelini ortadan kaldırarak, ifade yapıları için topluca bağlayıcı klonlar dönüştürmek için etkili bir araç sunabilir Maliyet ve arınma çabasıilk olarak önlenebilir.
(24 de tarifedilmiş) Kütüphane F şirketinden izole edilmiş klonun antikor değişken alanları (Library of K yönelik primerler Malzemesi Tablo 2'ye bakınız bölgeler (CDR'ler) tamamlayıcı belirleyici PCR yolu ile büyütmek üzere, şablon olarak faj süpernatan 1-2 ul kullanılarak dizilebilir ). Bu primerler kullanılarak, ağır ve hafif zincir değişken bölgeleri, sırasıyla üç CDR içeren, ~ 700 ~ 500 bp'lik ürün sağlayacaktır. Primerler, en dizileme çekirdek tesislerinde bulunan standart primerler kullanılarak (Kısım 5.4.5 içerisinde tarif edildiği üzere) ürünleri temizleme sonra sıralı olabilir, öyle ki M13 olarak primerler için halkalaşma bölgelerini içerir. Alternatif olarak, E. doğrudan bir ekspresyon vektörüne klonlanmıştır ve dönüştürülmüş olan Fab faj havuzları E. coli ifadesi için tek koloniler izole edilebilir ve tek c için şablon olarak doğrudan kullanılmıştır 2YT 15 ul ve hücre süspansiyonu, 1-2 ul içinde yeniden süspanseUygun primerler kullanılarak PCR ile olony.
Otomatikleştirme seçimleri birkaç anahtar robotik fonksiyonların optimizasyonu ve doğrulama gerektirir. Genel olarak, pipet bazlı sıvı taşıma 96 kanallardan doğru ve tutarlı olmalıdır, plaka yıkama seçimi plaka adsorbe antijen veya bağlı Fab-faj sıyırma olmadan verimli bir şekilde bağlanmamış faj kaldırmanız gerekir. Mermi zenginleştirme ve etkili terörle seçimi ve aralarında daha sonraki seçimleri çapraz bulaşmayı önlemek için izin arasındaki plaka yıkama Etkili dekontaminasyon da gereklidir. Yüksek verimli seçim prosedürünü optimize etmek için, bu fonksiyonları değerlendirmek için basit yaklaşımlar daha önce kullanılmış ve protokol dahilinde aşağıda ve detaylı açıklanmıştır.
Bir sıvı dağıtım / aspirasyon kafasının tüm kanallar tarafından sunulan miktarlar tutarlılığını değerlendirmek için, renkli bir çözelti, düz tabanlı 96 kuyulu bir levha ve absorban için pipetleHer ce iyi bir plaka okuyucu üzerinde ölçtü. Böyle Bromophenol mavisi gibi bir kromofor teslim birimlerde farklı yüzey gerilimi ve uyum özelliklerinin etkilerini değerlendirmek için gerçek seçimler için kullanılan benzer boyama çözümleri için yararlıdır. Tüm kanallar tutarlı hacimlerinin dağıtılmasında olduğu doğrulandıktan sonra, toplam iletilen hacim doğruluk, her plakaya aktarıldı sıvının kütle ölçümü ile belirlenebilir.
Bağlanmamış klonları ortamdan uzaklaştırmak üzere levha yıkama otomasyonu öncelikle tampon tevzi edilecek ve yıkama sayısı kullanılabilir olan yıkama hızından optimizasyonu gerekir. Bu parametre, değerlendirme makul bir yöntem pozitif kontrol (spesifik Fab faj klonları bağlama) 1) antijen ya da bağlanmış faj adsorbe olup olmadığını belirlemek için dağıtım hızını ve / veya yıkama değişen sayısının etkisini değerlendirmek için aşırı sıkı yıkama ile ayrılmıştır olan kullanmaktadır ya da olmayan aynı kökenli proteinlere bağlanarak 2) spesifik olmayan aşırı due yeterince sıkı olmayan koşulları yıkamak için. Kalıntı / bağlanan faj bakteriye enfeksiyon ve tek koloni sayımı için kaplama ya da ELISA antikor afinite etiketleri veya faj kaplama proteinlerinin spesifik ikincil antikorlar kullanılarak ya da tespit edilir ve ölçülebilir. Negatif kontroller, yıkama yeterince sıkı değilse yüksek olabilir olmayan aynı kökenli / arka plan proteinleri, proteinlerin ya da spesifik bağlayıcı Fab faj hedef bağlayıcı Fab faj kalıntı seviyelerini değerlendirmek için kullanılır. Bu durumda, bağlayıcı ve bir pozitif kontrol olarak Fab faj üzerinde bir FLAG epitopu etiketi tanıyan bir anti-FLAG antikor spesifik olmayan bir kontrol olarak BSA hareketsiz kullanılmıştır. Biz bu teknikler eşit olup olmadığını göstermek için, bir orta akış hızında, el ile yıkama karşı robot kullanılarak sekiz ve on altı yıkama döngüleri karşılaştırdık. Alternatif, devam eden seçimler sırasında giriş ve çıkış faj titreleri (Bölüm 7 bakınız) ölçüm de yıkama parametreleri ince ayarlamalar yapmak için yardımcı olabilir. Son olarak, seçimler için kullanılan plaka pul dekontaminasyon önceki seçimlerden faj carry-over ortadan kaldırmak için etkili olmalıdır. Bizim tecrübelerimize göre, taze seyreltilmiş% 0.5 sodyum hipoklorit, hızlı, etkili ve ucuz. Böyle SDS gibi Deterjanlar da etkilidir ancak sistemden kaldırmak için çok daha kapsamlı bir yıkama gerektirir. Herhangi testler öncesinde sistemin reaktif uyumluluğunu kontrol edin. Dekontaminasyon değerlendirmek için, Tablo 3'e uygun sonuçlar fluidik sistemi tarafından işlenir Çözeltilerin kalan faj varlığı açısından test etmek ve yorumlar.
Özet olarak, bu protokol protein domainlerinin karşı in vitro seçimleri paralel olarak birleşimsel kütüphanelerden elde edilen Fab'ler izole edilmesi için bir büyütülebilir bir yöntem sağlar ve otomatik bir faj seçim sistemi doğrulanması için teknikler bulunmaktadır. Bu yöntem yeniden olmadığından kapsamlı hayvan tesisleri yaratabilir Maliyet ve altyapı engelleri azaltıldığınahayvanların bağışıklık kazandırma üzerine konur. Ayrıca, antikor-faj seçimi ile antijen nesil entegre ederek, seçim başarısını etkileyen kalite faktörleri daha kolay izlenir ve ayarlanır. Seçilmesi ve ilk karakterizasyonu antijen ifadesinden zaman çerçevesi 6-8 hafta sipariş açıkken, üretimin daha duyarlı sistem fark edilebilir. In vitro olarak seçimleri izole antikorlar, aynı zamanda, hem tekrar tekrar kolayca ve yeniden üretilebilir bir antikor yeniden üretmek için sentezleme konstruktunun sadece depolanmış DNA gerektiren (nedeniyle, genotip-fenotip bağlantı için) modifiye edilmiştir ve yenilenebilir. Sonunda bu protokol, özel tasarlanmış, robotik seçim sistemini kullanan bir yarı-manuel veya tam otomatik bir yaklaşım kullanılarak yapılabilir göstererek, verim hem küçük akademik ve endüstriyel laboratuvarlarına ölçeklenebilir ve erişilebilir olabilir.
Yukarıda tarif edilen yüksek verimli yöntemleri ve Kütüphane F sentetik antikor kütüphanesi 24 Kullanımı in vitro bağışıklık de dahil olmak üzere bağışıklık çeşitli uygulamalar içinde işlevsel olması - ve in situ eksprese edilen proteinler. Herhangi bir seçimi için başarı oranları antijen hedefleri kalitesi (saflık, foldedness, mono- yayılganlığı vs.) yanı sıra, antikor kütüphane kalitesi ve çeşitlilik hem bağlı olacaktır, ancak, bu 25-80 bir yerde gözlemlenmiştir antijenlerin% durumunda yüksek verimli bir seçimi için bağlayıcılar sağlayacaktır. Önemli bir şekilde, bu hedef fonksiyonunu modüle etme yetenekleri ile klonlar aynı zamanda sık sık seçilebileceğini belirtmek gerekir. Bu kütüphane, böylece geniş tabanlı ile afinite belirteç maddeleri üretimi için alternatif bir yaklaşım olarak, bu boru hattının öneminin altını çizerek, potansiyel terapötik uygulama 25 için, bu antikorlar müsait hale tam olarak bir insan çerçevesi kullanılarak inşa edilirdeğer.
Özetle, sağlamlık ve bu protokolde sunulan yaklaşımın çok yönlülüğü neredeyse tüm üyelerine afinite reaktiflerin üreten uzun vadeli hedefe ulaşmada bir araç olarak uygulanabilir optimizasyon, sanayileşme ve bu teknolojinin nihai yaygın kullanımı yardımcı devam edecek İnsan proteom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz NIH Ortak Fonu kabul etmek istiyorum - Protein Yakalama Reaktifler Programı Rekombinant Antikor Ağ antikor seçimi ve karakterizasyonu boru hattı ve robotik seçim platformunun finansman alımı için Yenilik Kanada Vakfı gelişimini finansmanı için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATERIALS | |||
| New Brunswick Innova44 stackable incubator shaker | Eppendorf | M1282-0004 | |
| Liquidator 96 channel manual benchtop pipetting system | Anachem Ltd | LIQ-96-200 | |
| Microplate shaker | VWR | 12620-926 | |
| ThermoScientific Sorvall ST-40 benchtop centrifuge | Thermo Product | 75004525 | |
| ELx405 Select Deep Well Microplate Washer | Biotek | ELX405USD | |
| Custom High Throughput Automated Phage Selection Robot | S&P Robotics | ||
| Plastic conical Falcon tube: 50 ml | VWR | 21008-178 | |
| Plastic conical Falcon tube: 15 ml | VWR | 89039-668 | |
| Axygen 1.7 ml microcentrifuge tubes | Corning | MCT-175-L-C | |
| 96-well/384-well Maxisorp plate | Sigma | M9410-1CS | |
| Corning 96-well V-bottom deep-well block | Corning | 3960 | |
| Axygen Mini-tube 96-well sterile microplate blue box | Corning | AXY-MTS-06-C-R-S | |
| Breathable adhesive plate sealing film | VWR | 60941-084 | |
| REAGENTS | |||
| Name | Company | Catalog Number | |
| polyethylene glycol | Bioshop | PEG800.1 | |
| yeast extract | Bioshop | YEX401.1 | |
| bio-tryptone | Bioshop | TRP402.1 | |
| N-Z amine | Sigma | C7290 | |
| glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| lactose | Bioshop | LAC234 | |
| glycerol | Bioshop | GLY001.500 | |
| carbenicillin | Bioshop | CAR544.10 | |
| kanamycin | Bioshop | KAN201.25 | |
| tetracycline | Bioshop | TET701.25 | |
| Tween 20 | Bioshop | TWN510.500 | |
| monobasic potassium phophate | Bioshop | PPM302.1 | |
| dibasic sodium phosphate | Anachemia | 84486-440 | |
| sodium chloride | Bioshop | SOD001.10 | |
| potassium chloride | Bioshop | POC308.1 | |
| calcium chloride | Bioshop | CCL302.500 | |
| magnesium sulphate | EMD | MX0070-1 | |
| magnesium chloride | Bioshop | MAG510.500 | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-1KG | |
| Na2SO4 | Bioshop | SOS513.500 | |
| agar | Bioshop | AGR001.500 | |
| SybrSafe DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
| phosphoric acid | Acros Organics | 201140010 | |
| lysozyme | Bioshop | LYS702.25 | |
| benzonase | Novagen | 71205 | |
| Triton X-100 | Bioshop | TRX506.500 | |
| protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11 836 170 001 | |
| Ni-NTA resin | Qiagen | 1018240 | |
| 1,000x helper phage (M13K07) stock (1013 phage per ml) | NEB | N0315S | |
| HRP conjugated M13-specific antibody (anti-M13-HRP). | GE Healthcare | 27-9241-01 | |
| TMB substrate: mix equal volumes of TMB and H2O2 peroxidase substrate | KPL | 50-76-00 | |
| dNTPs | Biobasic | DD0056 | |
| Taq polymerase | Genscript | E00007 | |
| Exonuclease | GE Healthcare | EZ0073X-EZ | |
| Shrimp alkaline phosphatase | GE Healthcare | E70092Z-EZ |
References
- Winter, G., Milstein, C. Man-made antibodies. Nature. 349, 293-299 (1991).
- Miersch, S., Sidhu, S. S. Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations. Methods. 57, 486-498 (2012).
- Schofield, D. J., et al. Application of phage display to high throughput antibody generation and characterization. Genome Biol. 8, R254 (2007).
- Hust, M., et al. A human scFv antibody generation pipeline for proteome research. J. Biotechnol. 152, 159-170 (2011).
- Colwill, K., Graslund, S. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat. Methods. 8, 551-558 (2011).
- Mersmann, M., et al. Towards proteome scale antibody selections using phage display. Nat. Biotechnol. 27, 118-128 (2010).
- Pershad, K., et al. Generating a panel of highly specific antibodies to 20 human SH2 domains by phage display. Protein Eng. Des. Sel. 23, 279-288 (2010).
- Turunen, L., Takkinen, K., Soderlund, H., Pulli, T. Automated panning and screening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries. J Biomol. Screen. 14, 282-293 (2009).
- Hughes, R. A., Miklos, A. E., Ellington, A. D. Gene synthesis: methods and applications. Methods Enzymol. 498, 277-309 (2011).
- Boersma, Y. L., Pluckthun, A. DARPins and other repeat protein scaffolds: advances in engineering and applications. 22, 849-857 (2011).
- Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 523-533 (2003).
- Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
- Fellouse, F. A., et al. High-throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries. J. Mol. Biol. 373, 924-940 (2007).
- Paduch, M., et al. Generating conformation-specific synthetic antibodies to trap proteins in selected functional states. Methods. 60, 3-14 (2013).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41, 207-234 (2005).
- Huang, H., Sidhu, S. S. Studying binding specificities of peptide recognition modules by high-throughput phage display selections. Methods Mol. Biol. 781, 87-97 (2011).
- McLaughlin, M. E., Sidhu, S. S. Engineering and analysis of peptide-recognition domain specificities by phage display and deep Sequencing. Methods Enzymol. 523, 327-349 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- den Engelsman, J., et al. Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development. Pharm. Res. 28, 920-933 (2011).
- Lavinder, J. J., Hari, S. B., Sullivan, B. J., Magliery, T. J. High-throughput thermal scanning: a general, rapid dye-binding thermal shift screen for protein engineering. J. Am. Chem. Soc. 131, 3794-3795 (2009).
- Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. Making antibodies in bacteria. in Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. Howard, G. C., MR, K. aser , CRC Press. Boca Raton, Florida. 151-172 (2013).
- Acton, T. B., et al. Preparation of protein samples for NMR structure, function, and small-molecule screening studies. Methods in Enzymology. 483, 23-47 (2011).
- Mahon, C. M., et al. Comprehensive interrogation of a minimalist synthetic CDR-H3 library and its ability to generate antibodies with therapeutic potential. J. Mol. Biol. 425, 1712-1730 (2013).
- Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J. Mol. Biol. 425, 803-811 (2013).
- Bradbury, A. R., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nat. Biotechnol. 29, 245-254 (2011).
