Summary
Ondersteunde lipide dubbellagen en natuurlijke membraan deeltjes zijn handig systemen die de eigenschappen van celmembranen kunnen benaderen en diverse analytische strategieën worden opgenomen. Hier laten we een werkwijze voor het bereiden microarrays samengesteld ondersteunde lipide-bilaag beklede SiO2 parels, fosfolipide vesicula of natuurlijke membraan deeltjes.
Abstract
Lipide dubbellaag membranen de plasmamembranen van cellen en definiëren de grenzen van subcellulaire organellen. In de natuur, deze membranen zijn heterogene mengsels van vele soorten lipiden, membraan-gebonden eiwitten bevatten en zijn versierd met koolhydraten. In sommige experimenten, is het wenselijk om de biofysische en biochemische eigenschappen van de lipide bilaag van die van de natuurlijke membraan ontkoppelen. Dergelijke gevallen oproep voor het gebruik van modelsystemen zoals reus vesicles, liposomen of ondersteunde lipide bilagen (SLBs). Arrays van SLBs zijn bijzonder aantrekkelijk voor toepassing bij het aftasten nabootsen cel-cel interacties. Hier beschrijven we een nieuwe werkwijze voor het vormen SLB arrays. Submicron diameter SiO2 kralen worden eerst bekleed met lipide bilagen bolvormig SLBs (SSLBs) vormen. De kralen worden vervolgens gestort op een scala aan micro-gefabriceerde submicron-diameter microwells. De bereiding techniek maakt gebruik van een "trekker" naar het substraatoppervlak te reinigen, terwijl leaving achter SSLBs die zich hebben gevestigd in microwells. Deze methode vereist geen chemische modificatie van de microwell substraat, noch het bijzonder gericht op liganden op SSLB. Microwells worden bezet door enkele parels omdat de goed diameter is afgestemd op net groter is dan de kraal diameter. Typisch, meer 75% van de putten bezet, terwijl de rest leeg blijven. In buffer SSLB arrays weer stabiliteit op lange termijn van meer dan een week. Meerdere soorten SSLBs kan in een array geplaatst door seriële afzetting en de arrays kunnen worden gebruikt voor detectie, waarvan we aantonen Door die interactie van choleratoxine met ganglioside GM1. We tonen ook dat fosfolipide vesicula zonder kraal ondersteunt en biomembranen uit cellulaire bronnen kunnen bekleed worden met dezelfde methode en celspecifieke membraanlipiden kunnen worden geïdentificeerd.
Introduction
Lipide dubbellaag membranen essentieel die in de natuur. Cellulaire plasmamembranen en organel membranen bestaan uit lipide bilagen die een aantal moleculen die nodig zijn voor het leven nemen. Veel levensverlengende processen plaatsvinden op het oppervlak van cellen of worden gemedieerd door moleculen geassocieerd met lipide bilaag membranen. In feite zijn veel geneesmiddelen doelprocessen of moleculen aangetroffen op of in membranen 1,2. Het is daarom noodzakelijk om analytisch processen, zoals chemische reacties of niet-covalente binding gebeurtenissen die zich voordoen op membraanoppervlakken onderzoeken. Omdat natuurlijke membranen moeilijk te isoleren en / of interface met sensoren kan zijn, veel onderzoekers in dienst vereenvoudigd model membranen analytische studies uit te voeren. Een aantal model membraansystemen worden beschreven in de literatuur, van grote blaasjes die kunnen tientallen tot honderden micron in diameter liposomen de nanodeeltjes 3,4. Alternlatief, vlakke lipide bilagen afgezet op vaste dragers, bijvoorbeeld, ondersteund lipide bilagen (SLBs), kan worden gevormd op een aantal verschillende oppervlakken en zijn op grote schaal gebruikt in de biofysische, biochemische en analytische toepassingen 5. Koppeling SLBs elektrische of optische materialen stelt onderzoek membraan biochemie en biofysica door het gebruik van verschillende analytische technieken. Fluorescentie microscopie 6, elektrochemie 7, 8 optische spectroscopie, scanning probe microscopie 9, oppervlakte plasmon resonantie 10 en massaspectrometrie 11 zijn allemaal gebruikt om de structuur en eigenschappen van SLBs bestuderen.
SLB arrays bieden extra flexibiliteit bij het ontwerpen van sensoren voor multiplex assays 12,13. Andere toepassingen gebruiken SLB arrays om de kruising die zich vormt tussen immuuncellen 14 na te bootsen. Bereidingswijzen voor SLB arrays hebben varieerde van microfluIDIC benaderingen 15 aan degenen die fysieke barrières tussen aangrenzende SLB plekken in dienst. 16 Andere groepen hebben gebruikt drukmethodes 17, fotochemische patronen 18 en diverse nanoengineering benaderingen 19 tot SLB arrays te maken.
In dit artikel en de bijbehorende video tonen we een methode voor het vormen van SLB arrays door het storten van SLB-gecoate SiO 2 kralen in besteld arrays van microwells 20. We verwijzen naar de SLB-gecoate SiO 2 kralen als sferische ondersteund lipidendubbellagen (SSLBs). Deze techniek is een uitbreiding van eerdere werk dat arrays van fosfolipideblaasjes en biomembranen afkomstig van natuurlijke bronnen 21, waaruit we tonen ook bijvoorbeeld resultaten gemaakt. Andere werkwijzen voor arraying biomembraan deeltjes of blaasjes hebben zich op patronen van specifieke targeting liganden op oppervlakken die associëren met aanvullende liganden die op het blaasje oppervlak. Voorbeelden omvatten biotine-avidine vereniging 22,23 en DNA hybridisatie regelingen 24. Onze aanpak vereist slechts een microwell reeks zonder targeting of erkenning groepen nodig. De grootte van SSLBs wordt bepaald door de diameter van de SiO2 kraal dragers, die lage poly-dispersiteit heeft. Door het afstemmen van de microputjes diameter net groter is dan de diameter SSLB slechts een SSLB regelt in elk microputje. Een poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) zuigmond verwijdert vervolgens van het oppervlak alle SSLBs die niet worden geïmmobiliseerd in microwells. De microputjes en de resulterende SSLB arrays met hoge dichtheid (~ 10 5 SSLBs / mm 2) met 3 urn hart-op-hart afstand en zeshoekige periodiciteit. Door serieel afzetten SSLBs verschillende lipidesamenstellingen, is het mogelijk om multicomponent arrays met willekeurig geplaatste SSLBs maken. Om het registrerende vermogen van SSLB arrays tonen gebruikten we de interactie van choleratoxine (CTx) met ganglioside (GM1) opgenomen in de SSLBs. Metnatuurlijke membraan deeltjes konden we celspecifieke lipiden detecteren multicomponent arrays met membraanmateriaal twee verschillende celtypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Microfabrication van Microwell Array Ondergrond
- Begin met een 4 inch siliciumwafel 100 nm thermisch gegroeid oxide.
- Spin SPR-955 0.7 fotolak op de wafer bij 4.000 rpm gedurende 30 seconden.
- Bak op een verwarmingsplaat bij 115 ° C gedurende 90 sec.
- Expose fotolak.
- Gebruik een masker 1 urn aangebrachte gaten in een hexagonale array met een 3 micrometer periode waarin de matrix omvat een 2 mm x 2 mm gebied te creëren.
- Expose wafer in een i-lijn stepper met een stapgrootte van 6 mm en een blootstelling van 200 mJ / cm 2.
- Bak op een verwarmingsplaat bij 115 ° C gedurende 90 sec.
- Ontwikkelen met behulp van een spin ontwikkelaar om 2 plassen CD-26 op de wafer te storten voor een totale ontwikkelingstijd van 90 sec.
- Grondig spoelen met ultrapuur DI water en droog met N2.
- Ets het oxide in een reactief ionen etser gedurende 6 min bij 50 sccm Ar, 25 sccm CF4 en 50 sccm CHF3 flovleugel bij een druk van 75 mTorr.
- Ets silicium in een ICP diepe sleuf reactieve ionen etser gedurende 2 minuten met 63 sccm C 4F 8, 27 sccm SF6, 40 sccm Ar en 10 sccm O2 stromen onder een druk van 14 mTorr.
- Spoel in aceton, methanol en isopropanol te verwijderen weerstaan.
- Breng in een bad van H 2 SO 4: H 2 O 2 01:01 gedurende 10 minuten om het oppervlak schoon.
- Grondig spoelen met ultrapuur DI water en droog met N2.
- Stort 1080 Å van Al 2 O 3 door atomic layer deposition bij 250 ° C.
2. Bereiding van poly (dimethylsiloxaan) Rakel
- Indien mogelijk, werken in een cleanroom. Anders werken in het schoonste milieu mogelijk.
- Het verkrijgen van een plastic petrischaal (of andere schone wegwerp container) met ≥ 13 mm zijden.
- In dit gerecht, uitgieten 5 g PDMS verharder, gevolgd door 50 g PDMS base agent (of iets met een 01:10 verhouding die meestal zal vullen de petrischaal). Meng grondig met een wegwerp plastic pipet of staaf.
- Verwijder luchtbellen door het plaatsen van de gemengde PDMS in een kamer met een vacuüm lijn, het toepassen van vacuüm tot bubbels komen uit mengsel (ongeveer 30 min).
- Indien niet reeds in de petrischaal, giet PDMS petrischaal, het vermijden van creatie van luchtbellen.
- Cure 's nachts op een kookplaat bij> 50 ° C (hogere warmte minder lang werkt ook).
- Met nieuwe / schoon scheermesje, knip voorzichtig een rechthoekig stuk ongeveer 2,5 x 2,5 cm, waardoor bovenkant zo schoon mogelijk. Schil met een schone pincet. Snij een rand (tot 1.5 cm) door te drukken op scheermesje in een beweging, aan de bovenkant zo scherp mogelijk te maken (dit zal de rand gebruikt in de rakel proces).
- Schoon met aceton, methanol, isopropanol, en ultrapuur DI-water, en daarna föhnen met schoon stikstofgas. Bewaren in een schone petrischaal.
3. Bereiding van blaasjes
- Verzamel lipide voorraadoplossingen van 25 mg / ml ei-fosfatidylcholine (PC) en 1 mg / ml 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N - (lissamine rhodamine B sulfonyl) ammoniumzout (Rho-DPPE) in chloroform en een 0,5 mg / ml voorraadoplossing van monosialoganglioside GM1 in chloroform / methanol (2:1 v / v).
- In een klein glazen flesje maak een mengsel dat resulteert in 97 mol% PC, 2 mol% GM1 en 1 mol% Rho-DPPE door toevoeging 18,9 gl 25 mg / ml PC, 39,6 gl 0,5 mg / ml GM1 en 7,9 pl 1 mg / ml Rho-DPPE met glazen spuiten.
- Opmerking:. Het aanvullend materiaal voor Nair et al. 25 bevat een uitstekend aanpasbare Excel-spreadsheet voor de berekening van de bedragen van de lipiden die nodig is om blaasjes van een gewenste samenstelling te creëren.
- Plaats flacon in een vacuümexsiccator en verwijder het oplosmiddel door waarbij de flacon onder vacuüm gedurende 6 uur.
- Voeg een waterige oplossing van 0,1M NaCl. Voeg 0,5 ml van de 0,1 M NaCl-oplossing aan de flacon met de gedroogde lipide film.
- Laat de waterige lipide mengsel een nacht rusten.
- Kort Vortex een vesicle suspensie te maken, dan ultrasone trillingen gedurende 20 min in een badsonicator bij kamertemperatuur.
- Extrusie van de vesicle suspensie door een polycarbonaat membraan met 100 nm poriegrootte. Passeer het blaasje schorsing door het filter 17x.
- Bewaar de geëxtrudeerde blaasjes in een glazen flesje bij 4 ° C.
4. Vorming van Sferische Ondersteunde lipidendubbellagen
- Verzamel 700 nm diameter SiO 2 kralen. De kralen worden in gedestilleerd water met een voorraad concentratie van 1,4 x 10 11 kralen / ml.
- In een 1,5 ml Eppendorf buisje stelt een 1 ml kraal suspensie met een concentratie van 1,5 x 10 10 kralen / ml door toevoeging van 107 ul van kralen stockoplossing aan 893 ui 0,1 M NaCl.
- Vortex de schorsing om te verzekeren het goed mixed.
- Centrifugeer de suspensie bij 1700 xg gedurende 20 min gooi het supernatant daarna. Resuspendeer de kralen in 1 ml 0,1 M NaCl. Herhaal deze stap tweemaal om de kralen grondig te wassen.
- De SSLBs vormen, in een 1,5 ml Eppendorf tube 25 ul van de SiO2 kralensuspensie 200 ui 1 mg / ml vesicle suspensie. Vortex het mengsel en laat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. In dit stadium moet de SSLB concentratie 1,7 x 10 9 SSLBs / ml.
- Centrifugeer bij 1700 xg gedurende 20 min aan de SSLBs pellet. De pellet moet roze verschijnen als gevolg van het scheuren van vesicles met Rho-DPPE op de kralen.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer in 225 ul fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH = 7.4. Herhaal de stappen 4,6-4,7 nog twee keer aan een unruptured blaasjes uit de SSLB schorsing verwijderen.
Vergadering van SSLB Array 5.
- Cleave wafer van microwell arrays resulteert in rechthoekige stukken met 4-6 micRowell arrays per stuk.
- Vortex meng de SSLB schorsing, dan plaats 10 ul van SSLB schorsing voor elke microwell array. Lest rust gedurende 1 uur te laten SSLBs om zich te vestigen aan de oppervlakte.
- Was voorzichtig de microwell serie chip met PBS uit een spuitfles, vervolgens onder te dompelen in een bad PBS bereid in een ondiepe schaal.
- Terwijl ondergedompeld, plaats voorzichtig het PDMS zuigmond flush op de microwell serie chip en schuif deze langs de oppervlakte 5x om SSLBs die niet worden geïmmobiliseerd in microwells verwijderen.
- Pak de microwell-array chip met een pincet en schud in de PBS bad om overtollig SSLBs verwijderen.
- Verwijder snel de chip uit het bad rakel en plaats in een frisse PBS bad tot verder gebruik. Zorg ervoor dat de bovenkant van de chip natte aan de SSLBs behouden blijft.
Opmerking: Het samenstel hierboven beschreven werkwijze kan worden gebruikt om arrays van natuurlijke membraan deeltjes creëren, zoals myeline deeltjes geïsoleerd uit muizenhersenen of phospholipid blaasjes zonder de SiO 2 kraal ondersteunt. Dit werk is beschreven in Wittenberg et al.. 21 en representatieve resultaten worden hieronder getoond.
6. Choleratoxine Bindingsassay
- Bereid een 2 mg / ml oplossing van runderserumalbumine (BSA) in PBS.
- Bereid een oplossing met de gewenste concentratie van Alexa 488-geconjugeerde cholera toxine B-subeenheid in PBS met 2 mg / ml BSA.
- Verwijder de SSLB matrix chip van de PBS bad en lont weg het grootste deel van de PBS-oplossing met behulp van een laboratorium te vegen. Vertrekken net genoeg PBS op de chip te houden van de SSLB matrix gehydrateerd.
- Om niet-specifieke binding te voorkomen, voeg 200 ul van 2 mg / ml BSA oplossing voor de SSLB matrix chip. Laat gedurende 1 uur in een vochtige doos rust.
- Met een micropipet, verwijdert 200 pi oplossing van de bovenkant van de SSLB matrix chip.
- Voeg 200 ul van cholera toxine oplossing voor de SSLB matrix chip en laat rusten gedurende 1 uur in een vochtige doos.
- Was voorzichtig de SSLB serie chip met PBS uit een spuitfles aan een ongebonden cholera toxine te verwijderen.
- Wick overtollige PBS met behulp van een laboratorium te vegen. Voordat beeldvorming deksel chip met een 24 mm x 40 mm dekglas.
- Afbeelding arrays met een rechtopstaande microscoop met filter sets geschikt voor de fluoroforen van belang.
- Analyseer de fluorescentie-intensiteit van individuele SSLBs in een array met behulp van de geautomatiseerde analyse van deeltjes in functie van ImageJ software.
- Compileren gemiddelde fluorescentie-intensiteit van individuele SSLBs in histogrammen dat de intensiteiten van SSLBs gevonden op een bepaalde serie te vatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Als SiO2 korrels worden gemengd met een oplossing van vesicles bestaande uit fosfolipiden, fluorescente lipiden en andere lipiden zoals gangliosiden, de vesicles scheuren op de SiO2 kraal oppervlakken SSLBs vormen, zoals schematisch weergegeven in figuur 1a. Na het wassen van de SSLBs, is een druppel SSLB oplossing geplaatst op een microwell array, en de kralen zijn bezinken naar de oppervlakte. (Figuur 1B1) Dit kan ook worden gedaan met een suspensie van fosfolipide vesicula of natuurlijke membraan, die worden getoond in figuur 1b2. Een fluorescentiebeeld van fosfolipide vesicula geadsorbeerd aan een microtiterplaat matrix substraat wordt getoond in Figuur 1B3. Dan is de PDMS rakel is gemaakt om zachtjes glijden over het oppervlak aan om eventuele SSLBs (Figuur 1C1), blaasjes of natuurlijke membraan deeltjes (Figuur 1C2) die niet vestigen in microwells verwijderen. Dit resulteert in een SSLB array waarin elkemicrowell bevat maximaal een SSLB (figuur 1d1) of een array waar meerdere blaasjes of natuurlijke membraan deeltjes zijn in elk microwell (figuur 1D2). Een afbeelding van een microarray uit fluorescent gemerkte vesicles is getoond in figuur 1D3.
.. Figuur 1 Vorming van SSLBs en SSLB reeks montage (a) Illustratie van een SSLB samengesteld uit 3 soorten lipiden op een SiO 2 kraal: ei PC (zwart), Rho-DPPE (rood) en GM-1 (blauw). (B1-d1) Werkwijze stroom voor montage van een SSLB matrix geeft SSLBs verspreid op een microwell array (b1), gebruik van een PDMS rakel op het oppervlak van SSLBs duidelijk niet geïnstalleerd in microputjes (c1) en de uiteindelijke SSLB array (d1 ). (B2-d2 (B3) een fluorescentiebeeld van fosfolipide vesicula geadsorbeerd op een microtiterplaat substraat overeenkomt met de afbeelding in (b2). (D3) een fluorescentiebeeld van een microarray uit fosfolipide vesicula die overeenkomt met de afbeelding in (d2). Aangepast van referenties 20 en 21 en worden met toestemming van de American Chemical Society.
Individuele SiO 2 kralen steunen voor SSLBs in microwells werden afgebeeld met scanning elektronen microscopie (SEM) van zowel de schuine bovenaanzicht en dwarsdoorsnede perspectieven. Een bovenaanzicht van een gebied ongeveer 15 pm x 15 pm is weergegeven in figuur 2a en in figuur 2b een dwarsdoorsnede van een kraal geïmmobiliseerd in eenmicrowell. De lichtere laag coating de microwell is 100 nm van Al 2 O 3 afgezet door atomic layer deposition afstemmen het goed diameter zodat de putten zijn staat van de opvang slechts enkele kralen.
Figuur 2. Scanning elektronenmicroscopie foto van SSLB arrays. (A) Een elektronen microfoto van een 15 mm x 15 mm stippellijn geeft SSLB kraal dragers geïmmobiliseerd in microwell arrays. (B) Een 700 nm diameter SSLB in een microwell. De microwell coating Al 2 O 3, die afgezet om de microputjes krimpen zodat alleen individuele korrels binnen past. Aangepast uit referentie 20 en worden met toestemming van de American Chemical Society.
Zodra de SSLB arrays worden bereid, kunnen deze worden afgebeeld door fluorescentiemicroscopie.
Achtereenvolgende afzetting van verschillende SSLBs werd gebruikt om arrays met meer dan een type SSLB, waarbij de identiteit van afzonderlijke SSLBs werd bepaald door de afwezigheid of aanwezigheid van een toxine receptor (GM1) en de binding van choleratoxine (CTx). Het assemblageproces is hetzelfde als voor een SSLB type, maar werd een tweede maal uitgevoerd met een andere SSLB identiteit. De beginconcentratie van SSLBs was 10x lager aan de bezetting van het eerste type SSLB verminderen en om meer vacatures te worden ingenomen door het tweede type SSLB. In de figuren 3c-3e is een SSLB array met twee soorten SSLBs weergegeven. All van de SSLBs bevatten fluorescerende Rho-DPPE (figuur 3c), maar slechts enkele van de SSLBs bevatten GM1, een ganglioside dat de receptor voor de B-subeenheid van CTx. Bij blootstelling aan groen fluorescerend Alexa 488-geconjugeerde CTx, alleen de SSLBs met GM1 fluoresceren in het groene kanaal (figuur 3d). Bij de rode en groene beelden worden samengevoegd, is het mogelijk te bepalen welke SSLBs bevatten GM1 (geel) en die niet (rood) (figuur 3e).
Figuur 3. Fluorescentie beeldvorming van SSLB arrays. (A) Een 100 urn x 100 urn gebied met 936 Rho-DPPE-gemerkte ei PC SSLBs. (B) Een helderveld en fluorescentie overlay met een SSLB met 76% van de microwells bezet. (Ce) Een SSLB array met SSLBs dat Rho-DPPE bevatten(C) een fractie die bevatten ook GM1, die gebonden is aan Alexa-488 geconjugeerd CTx (d). (E) Fusie van rode en groene kanalen waar colocalized fluorescentie duidt op de aanwezigheid van GM1 op de SSLB. De blauwe cirkels geven SSLBs dat alleen fluoresceren rood, dwz ontbreekt GM1. Aangepast uit referentie 20 en worden met toestemming van de American Chemical Society.
Fluorescentie gegevens SSLB arrays werd geanalyseerd door meting van de intensiteit van individuele SSLBs in een afbeelding. De SSLB intensiteit gegevens van arrays werden gecompileerd in histogrammen. Figuur 4a toont een dergelijk histogram van de analyse van Rho-DPPE fluorescentie van een SSLB reeks uitsluitend uit SSLBs met ei PC en 1 mol% Rho-DPPE samengesteld. De gegevens in Figuur 4a werden verworven door het analyseren van de afbeelding in figuur 3a. We vonden de SSLB arrays te robuust en stabiel zijn voor ten minste een week in de koelkast eennd ondergedompeld in buffer. De arrays niet verliest geen fluorescentie-intensiteit, noch de bezetting van de arrays te wijzigen in de loop van een week (figuur 4b).
Figuur 4. (A) Histogram toont de verdeling van fluorescentie-intensiteiten voor de SSLB matrix figuur 3a. De gemiddelde intensiteit voor elke SSLB in de array werd gebruikt om het histogram stellen. De volle lijn is een Gaussische fit aan de gegevens. (B) De gemiddelde bezettingsgraad reeks (zwarte cirkels) en fluorescentie-intensiteit (rode vierkanten) voor een SSLB serie gevolgd in de loop van een week. Aangepast uit referentie 20 en worden met toestemming van de American Chemical Society.
We maakten arrays uit SSLBs met variërende concentraties GM1 (0, 0,5, 1 and 2 mol%) en blootgesteld ze een vaste concentratie van CTx en arrays met SSLBs met concentraties van GM1 en blootgesteld hen variërende concentraties CTx. De latere experiment werd gebruikt om het evenwicht dissociatieconstante (Kd) bepalen GM1/CTx binding. De SSLB arrays met verschillende GM1 concentratie werden blootgesteld aan 50 nM Alexa-488 gelabeld CTx 1 uur daarna gewassen en afgebeeld. De intensiteit histogrammen voor SSLB arrays met 0,5-2 mol% GM1 blootgesteld aan 50 nM Alexa 488-geconjugeerde CTx is te zien in figuur 5a Figuur 5b toont de lineaire afhankelijkheid van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit op GM1 concentratie.. Wanneer de concentratie van GM1 in SSLBs wordt vastgesteld op 2 mol% en SSLB arrays worden blootgesteld aan CTx variërend van 16 pM tot 158 nM, de binding reactie volgt sigmoïdale curves zoals getoond in figuur 5c. De curven fit om deze gegevens zijn gebaseerd op twee verschillende modellen van bindingen: de Langmuir isotherm (Vgl. 1) en de Hill-Waud modusl (Vgl. 2). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
(1)
(2)
Hierbij is F de fluorescentie-intensiteit bij een bepaalde CTx concentratie, F max is de fluorescentie-intensiteit als bindend is verzadigd, [CTx] is de CTx concentratie, K D en K H zijn de dissociatie constanten van de Langmuir en Hill-Waud past, respectievelijk , en n coöperativiteit coëfficiënt in de Hill-Waud model. De coöperatief coëfficiënt (n) schat de hoeveelheid multivalente binding, waarbij n groter is dan eeneen aan dat elk CTx bindt meerdere GM1. De concentratie van CTx 0.5 x F max is de KD of K H voor de GM1/CTx interactie. In onze experimenten hebben we berekend een Kd van 1,6 ± 0,2 nM en K H van 1,4 ± 0,2 nM met een n waarde van 1,3, wat aangeeft coöperatieve binding. De dissociatieconstanten voor de GM1/CTx interactie variëren sterk in de literatuur, met een zeer 5 orden van grootte van 4:05 tot 370 nM 26,27.
Figuur 5. CTx/GM1 bindingsbepalingen op SSLB arrays. (A) Histogrammen van de fluorescentie-intensiteit van afzonderlijke SSLBs binnen SSLB arrays. De matrices bevatten SSLBs met 0,5, 1 of 2 mol% GM1 en werden blootgesteld aan 50 nM Alexa 488-geconjugeerde CTx. Degetrokken lijnen zijn Gaussische past. (B) Plot van de distributie betekent van (a) als een functie van GM1 concentratie. (C) Binding krommen die het verdeelorgaan uit arrays die SSLBs met 2 mol% GM1 na blootstelling aan Alexa-488 geconjugeerd CTx variërend van 16 pM tot 158 nM. De lijnen zijn fit voor de Langmuir isotherm (rood) en Hill-Waud (blauw) bindende modellen. De fout bars in (bc) vertegenwoordigen de standaarddeviaties van de verdelingen van fluorescentie-intensiteit die overeenkomt met elk gegevenspunt. Aangepast uit referentie 20 en worden met toestemming van de American Chemical Society.
Zoals eerder vermeld, is het ook mogelijk om arrays te vormen met biomembraan materiaal afkomstig van natuurlijke bronnen 21. De arrays worden gevormd op dezelfde wijze, door het dispergeren membraan deeltjes op een microwell substraat vervolgens reinigen het bovenoppervlak van de rakel achter membraan deeltjes in de microfoon verlatenRowells. Figuur 6 toont voorbeelden van myeline en neuronale lipid raft microarrays. In figuur 6a zijn myeline partikels gelabeld met de lipofiele fluorofoor FM1-43. Lipide rafts is bekend dat verrijkt cholesterol en gangliosiden zoals GM1; dus Alexa 488-geconjugeerde CTx bindt sterk aan lipide raft microarrays zoals in figuur 6b, terwijl fluorescent gelabelde streptavidine (SAPE) niet binden aan de matrix. (Figuur 6c) Wij ontwierpen ook streep arrays door het leveren van myeline en lipid raft deeltjes tot de microwell substraat met een microfluïdische chip met 250 pm-brede kanalen. Na deeltje levering, werd de microfluïdische chip los van de microwell substraat en de zuigmond proces uitgevoerd zoals gewoonlijk. De streep arrays werden vervolgens blootgesteld aan een fluorescerend anti-oligodendrocyten IgM antilichaam (IgM O4), die sulfatide in myeline bindt. (Figuur 7) De myeline en lipid raft streep microarrays in figuur 7 worden getoond bij toenemende vergroting op het hoogste niveau van vergroting, is het snel duidelijk dat IgM O4 bindt alleen de myeline microarrays omdat sulfatide ontbreekt in de lipide rafts.
Figuur 6. Myeline deeltje en neuronale lipid raft deeltje arrays. (A) Een myeline deeltje microarray waarbij het myeline fluorescerende deeltjes worden gemaakt door de lipofiele fluorofoor FM1-43. De stippellijn geeft de rand van de array gebied. (B) Lipid vlot microarray tonen CTx binding aan de lipid raft deeltjes. (C) Lipid vlot microarray blootgesteld aan fluorescerende streptavidine-phycoerythrine (SAPE) weinig tot geen specifieke binding tonen. Aangepast uit referentie 21 en worden met toestemming van de American Chemical Society.
Figuur 7. Multicomponent arrays gevormd door microfluïdische levering van myeline en neuronale vlot membranen. (A) Fluorescentie beeld na myeline en vlotten werden afgezet via microfluïdische kanalen op de microarray substraat. De linker en rechter strepen bevatten myeline en de middelste streep bevat neuronale vlot membranen. De membranen worden gekleurd met FM1-43, die alle lipide materiaal etiketten. De schaal bar is 250 micrometer. (B) Fluorescentie beeld van dezelfde drie strepen na het aanbrengen van de PDMS zuigmond en incubatie met IgM O4. De schaal bar is 250 micrometer. (Ce) Vergrote beelden van de drie strepen weergegeven dat IgM O4 bindt alleen de myeline microarrays: (c) links streep en (e) rechts streep. De schaal bars in panels ce zijn 30 um. Aangepast uit referentie 21 en worden met toestemming van de American Chemical Society.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit werk wordt aangetoond dat monodisperse SiO2 kralen bekleed met ondersteunde lipide bilagen kan worden bekleed in microwell arrays zonder dat targeting liganden op lipide dubbellagen of het substraatoppervlak, en de arrays kunnen worden gebruikt voor het karakteriseren van toxine-lipide interacties. De dissociatieconstante we berekend CTx/GM1 binding steekt gunstig, gezien de grote verschillen van waarden in de literatuur, een eerder rapport van Winter et al.. Waar colloïdale samenvoegen van lipiden beklede parels werd gebruikt om een dissociatieconstante van ongeveer berekenen 30 nM. Door toepassing van de gegevens naar de Hill-Waud bindend model, hebben we vastgesteld dat de CTx/GM1 interactie is waarschijnlijk meerwaardig, wat overeenkomt met eerdere rapporten 28. De B (ganglioside binding) subeenheid van CTx bestaat als een pentameer, met elk van de vijf eenheden die binden aan een molecuul GM1 29; dus is het niet verwonderlijk dat meer dan een subunit gebonden kan worden gegeven de diffusive mobiliteit van GM1 in SLBs 30.
Arrays van chemisch gefunctionaliseerde kralen zijn gebruikt in andere analytische studies 31. Bij deze soorten experimenten worden typisch parels geïmmobiliseerd in microputjes die in het einde van geëtste optische vezels. Multiplex fluorescentie assays kunnen in deze configuratie worden uitgevoerd door mengen subpopulaties van kralen en tegelijkertijd te immobiliseren op het uiteinde van de optische vezel 32. In onze multiplex assay (fig. 3c-3e), we geïmmobiliseerde optisch gecodeerde SSLBs sequentieel omdat lipiden op SSLBs vrij in oplossing kan worden overgedragen van de ene soort naar de andere SSLB 33. Hoewel dit voegt extra stappen in de bereiding van SSLB arrays, niet overdreven tijdrovend en is de meest efficiënte aanpak voor lipiden gefunctionaliseerde kralen. We hebben ook ruimtelijk gecodeerd arrays door het afzetten verschillende SSLB populaties in aangrenzende microwell arrays, en er is geen waarneembare cross-talk tussen de arrays 20. Tot monster-voorbereiding te verkorten, kan SSLB arrays worden voorbereid op voorhand en gebruikt indien gewenst. Wij testten de stabiliteit van matrices in de loop van een week en vonden geen significante afbraak van de arrays in termen van fluorescentie-intensiteit, hetgeen aangeeft dat de hoeveelheid lipide materiaal op de SSLBs niet verandert met de tijd. Ook heeft de array bezetting niet veranderen in de tijd, wat suggereert dat zodra SSLBs geïmmobiliseerd zijn, ze niet los te maken van de microwells (figuur 4b).
Naast de parels bekleed met kunststof lipide bilagen, hebben we ook deze methode arrays natuurlijke membraan deeltjes 21 te creëren. In dit werk hebben we geïmmobiliseerde myeline deeltjes afgeleid van muizenhersenen en neuronale membraan deeltjes, zoals lipide-raft fractie. We konden de matrices om celspecifieke oppervlak membraan moleculen herkennen aan antilichaam binding (figuren 6 en 7). Bovendien, als de grootte van de microputjes werd gereduceerd tot nanoschaal en het bovenoppervlak van de array bekleed met goud, konden we oppervlakplasmaresonantie gebruiken bewaken binding van antilichamen tegen myeline membraan deeltjes zonder het gebruik van fluorescente labels. Het belangrijkste verschil tussen het gebruik SSLB en blaasjes of natuurlijke membraan deeltjes matrices gevormd is dat bij SSLBs de exacte hoeveelheid membraanmateriaal in elk microputje bekend omdat slechts een kraal past in elk putje. Met blaasjes of natuurlijke membraan deeltjes, is er geen manier om de hoeveelheid materiaal in elk microwell, anders dan de beginconcentratie van blaasjes of deeltjes passen regelen. De well-to-well variabiliteit van het aantal blaasjes is niet erg groot in vergelijking met de verdeling van vesicle diameter 21.
Ten slotte kan deze methode div hebbenERSE toekomstige toepassingen. Junesch en collega's hebben een trekker gebruikt om nanodeeltjes tijdens colloïdale lithografie nanofabricage 34 verwijderen. Membraan arrays kunnen worden gevormd om cel-cel contacten na te bootsen om cellulaire focale adhesie 35 onderzoeken of onderzoekt de binding van membraan-kromming sensing eiwitten 36. Bovendien zou het gebruik van poreuze kralen opneming van transmembraan eiwitten in de lipide bilagen 37 of lokale afgifte van opgeslagen lading cellen gekweekt op een biomembraan matrix substraat vergemakkelijken. De microwell platform wordt gefabriceerd door fotolithografie, die zorgt voor ontwerpflexibiliteit. Hier onze arrays had zeshoekige geometrie, maar vierkant, lineair, of andere geometrieën kunnen worden gecreëerd met verschillende scala periodiciteit en microwell dimensies aan de ruimtelijke effecten van focale adhesie te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen openbaar te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies aan SHO van de National Institutes of Health (R01 GM092993), de National Science Foundation (NSF LOOPBAAN Award en DBI 0.964.216), de Office of Naval Research (ONR) Young Investigator Program en de Minnesota Partnership Award voor Biotechnologie en Medical Genomics. Apparaat fabricage werd uitgevoerd bij de Nanofabrication Centrum Universiteit van Minnesota (NFC), dat wordt ondersteund door de NSF door de National Nanotechnology Infrastructure Network. Dit werk werd ondersteund door subsidies aan MR van de National Institutes of Health (NS048357, R21 NS073684), de National Multiple Sclerosis Society (CA1060A11), de Applebaum, Hilton, Peterson en Sanford Stichtingen en de familie McNeilus. De auteurs willen Hyungsoon Im bedanken voor hulp bij illustraties en Shailabh Kumar voor hulp bij scanning elektronenmicroscopie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 inch silicon wafers | University Wafer | 425 | |
| Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist | MicroChem | SPR955-CM | |
| Shipley MICROPOSIT CD-26 developer | MicroChem | CD-26 | |
| i-line stepper | Canon | 2500 i3 stepper | |
| Vision 320 reactive ion etcher | Advanced Vacuum | Vision 320 RIE | |
| Deep trench reactive ion etcher | Plasma Therm | SLR-770 | |
| Atomic layer depostion system | Cambridge NanoTech | Savannah | |
| Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Egg phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt | Avanti Polar Lipids | 810158C | |
| Monosialoganglioside GM1 | Avanti Polar Lipids | 860065P | |
| Silica beads | Bangs Laboratories | SS03N/4666 | Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter. |
| Cholera toxin B-subunit, Alexa 488-conjugate | Molecular Probes | C-34775 | |
| Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate | R&D Systems | NL1326R | |
| FM1-43 | Molecular Probes | T-3136 | |
| Eppendorf MiniSpin centrifuge | Fisher Scientific | 05-401-09 |
References
- Drews, J. Drug discovery: A Historical Perspective. Science. 287 (5460), 1960-1964 (1126).
- Cooper, M. A. Advances in Membrane Receptor Screening and Analysis. J. Mol. Recognit. 17 (4), 286-315 (2004).
- Voskuhl, J., Ravoo, B. J. Molecular Recognition of Bilayer Besicles. Chem. Soc. Rev. 38 (2), 495-505 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (1002).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid Supported Lipid Bilayers: From Biophysical Studies to Sensor Design. Surf. Sci. Rep. 61 (10), 429-444 (2006).
- Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early Steps of Supported Bilayer Formation Probed by Single Vesicle Fluorescence Assays. Biophys. J. 83 (6), 3371-3379 (2002).
- Krysinski, P., Zebrowska, A., Michota, A., Bukowska, J., Becucci, L., Moncelli, M. R. Tethered Mono- and Bilayer Lipid Membranes on Au and Hg. Langmuir. 17 (13), 3852-3857 (2001).
- Li, L., Wang, H. F., Cheng, J. X. Quantitative Coherent anti-Stokes Raman Scattering Imaging of Lipid Distribution in Coexisting Domains. Biophys. J. 89 (5), 3480-3490 (2005).
- Richter, R. P., Brisson, A. R. Following the Formation of Supported Lipid Bilayers on Mica: A Study Combining AFM, QCM-D, and Ellipsometry. Biophys. J. 88 (5), 3422-3433 (2005).
- Dahlin, A., Zäch, M., Rindzevicius, T., Käll, M., Sutherland, D. S., Höök, F. Localized Surface Plasmon Resonance Sensing of Lipid-Membrane-Mediated Biorecognition Events. J. Am. Chem. Soc. 127 (14), 5043-5048 (2005).
- Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. Phase Separation of Lipid Membranes Analyzed with High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry. Science. 313 (5795), 1948-1951 (2006).
- Groves, J. T., Boxer, S. G. Micropattern Formation in Supported Lipid Membranes. Acc. Chem. Res. 35 (3), 149-157 (2002).
- Bally, M., Bailey, K., Sugihara, K., Grieshaber, D., Vörös, J., Stadler, B. Liposome and Lipid Bilayer Arrays Towards Biosensing Applications. Small. 6 (22), 2481-2497 (2010).
- Groves, J. T., Dustin, M. L. Supported Planar Bilayers in Studies on Immune Cell Adhesion and Communication. J. Immunol. Methods. 278 (1-2), 19-32 Forthcoming.
- Yang, T. L., Jung, S. Y., Mao, H. B., Cremer, P. S. Fabrication of Phospholipid Bilayer-Coated Microchannels for On-Chip Immunoassays. Anal. Chem. 73 (2), 165-169 (2001).
- Groves, J. T., Ulman, N., Boxer, S. G. Micropatterning Fluid Lipid Bilayers on Solid Supports. Science. 275 (5300), 651-653 (1997).
- Hovis, J. S., Boxer, S. G. Patterning and Composition Arrays of Supported Lipid Bilayers by Microcontact Printing. Langmuir. 17 (11), 3400-3405 (2001).
- Yee, C. K., Amweg, M. L., Parikh, A. N. Direct Photochemical Patterning and Refunctionalization of Supported Phospholipid Bilayers. J. Am. Chem. Soc. 126 (43), 13962-13972 (2004).
- Kelly, C. V., Craighead, H. G. Nanofabrication for the Analysis and Manipulation of Membranes. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1356-1366 (2012).
- Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Oh, S. H. High-Density Arrays of Submicron Spherical Supported Lipid Bilayers. Anal. Chem. 84 (19), 8207-8213 (2012).
- Wittenberg, N. J., et al. Facile Assembly of Micro- and Nanoarrays for Sensing with Natural Cell Membranes. ACS Nano. 5 (9), 7555-7564 (2011).
- Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels. Angew. Chem. Int. Ed. 42 (45), 5580-5583 (2003).
- Kalyankar, N. D., et al. Arraying of Intact Liposomes into Chemically Functionalized Microwells. Langmuir. 22 (12), 5403-5411 (2006).
- Dahlin, A. B., Jonsson, M. P., Höök, F. Specific Self-Assembly of Single Lipid Vesicles in Nanoplasmonic Apertures in Gold. Adv. Mater. 20 (8), 1436-1442 (2008).
- Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using Patterned Supported Lipid Membranes to Investigate the Role of Receptor Organization in Intercellular Signaling. Nat. Protoc. 6 (4), 523-539 (2011).
- Kuziemko, G. M., Stroh, M., Stevens, R. C. Cholera Toxin Binding Affinity and Specificity for Gangliosides Determined by Surface Plasmon Resonance. Biochemistry. 35 (20), 6375-6384 (1996).
- Moran-Mirabal, J. M., Edel, J. B., Meyer, G. D., Throckmorton, D., Singh, A. K., Craighead, H. G. Micrometer-Sized Supported Lipid Bilayer Arrays for Bacterial Toxin Binding Studies Through Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Biophys. J. 89 (1), 296-305 (2005).
- Shi, J. J., Yang, T. L., Kataoka, S., Zhang, Y. J., Diaz, A. J., Cremer, P. S. GM1 Clustering Inhibits Cholera Toxin Binding in Supported Phospholipid Membranes. J. Am. Chem. Soc. 129 (18), 5954-5961 (2007).
- Gill, D. M. The Arrangement of Subunits in Cholera Toxin. Biochemistry. 15 (6), 1242-1248 (1021).
- Weng, K. C., Kanter, J. L., Robinson, W. H., Frank, C. W. Fluid Supported Lipid Bilayers Containing Monosialoganglioside GM1: A QCM-D and FRAP study. Colloid Surface B. 50 (1), 76-84 (1016).
- Walt, D. R. Fibre Optic Microarrays. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 38-50 (2010).
- Bake, K. D., Walt, D. R. Multiplexed Spectroscopic Detections. Annu. Rev. Anal. Chem. 1 (1), 515-547 (2008).
- Kundu, J., Levin, C. S., Halas, N. J. Real-Time Monitoring of Lipid Transfer Between Vesicles and Hybrid Bilayers on Au Nanoshells Using Surface Enhanced Raman Scattering (SERS). Nanoscale. 1 (1), 114-117 (2009).
- Junesch, J., Sannomiya, T., Dahlin, A. B. Optical Properties of Nanohole Arrays in Metal-Dielectric Double Films Prepared by Mask-on-Metal Colloidal Lithography. ACS Nano. 6 (11), 10405-10415 (2012).
- Wu, M., Holowka, D., Craighead, H. G., Baird, B. Visualization of Plasma Membrane Compartmentalization with Patterned Lipid Bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (38), 13798-13803 (2004).
- Hatzakis, N. S., Bhatia, V. K., Larsen, J., Madsen, K. L., Bolinger, P. Y., Kunding, A. H., Castillo, J., Gether, U., Hedegard, P., Stamou, D. How Curved Membranes Recruit Amphipathic Helices and Protein Anchoring Motifs. Nat. Chem. Biol. 5 (11), 835-841 (2009).
- Roizard, S., Danelon, C., Hassaine, G., Piguett, J., Schulze, K., Hovius, R., Tampe, R., Vogel, H. Activation of G-Protein-Coupled Receptors in Cell-Derived Plasma Membranes Supported on Porous Beads. J. Am. Chem. Soc. 133 (42), 16868-16874 (2011).
