Summary
Bicouches lipidiques supportées et des particules de la membrane sont des systèmes physiques avantageuses qui peuvent rapprocher les propriétés des membranes des cellules et être incorporés dans une variété de stratégies d'analyse. Nous démontrons ici un procédé pour préparer des microréseaux composées de bicouches lipidiques supportées revêtu de SiO 2, des perles ou des particules des vésicules de phospholipides membranaires naturelles.
Abstract
Membranes bicouches lipidiques forment les membranes plasmiques des cellules, et définissent les limites des organites subcellulaires. Dans la nature, ces membranes sont des mélanges hétérogènes de nombreux types de lipides, contiennent des protéines membranaires et sont décorées avec des hydrates de carbone. Dans certaines expériences, il est souhaitable de découpler les propriétés biophysiques et biochimiques de la bicouche lipidique de celles de la membrane naturelle. Ces cas nécessitent l'utilisation de systèmes modèles tels que vésicules géantes, des liposomes ou des bicouches lipidiques supportées (BLP). Les tableaux de BLP sont particulièrement attrayants pour les applications de détection et imitant les interactions cellule-cellule. Nous décrivons ici une nouvelle méthode pour former des tableaux SLB. Submicronique diamètre SiO 2 perles sont d'abord revêtus de bicouches lipidiques pour former BLP sphériques (SSLBs). Les billes sont ensuite déposés dans une matrice de micro-puits de micro-fabriqué sous-micron de diamètre. La technique de préparation utilise un "raclette" pour nettoyer la surface du substrat, tandis que leaving derrière SSLBs qui se sont installés dans des micropuits. Ce procédé ne nécessite aucune modification chimique du substrat de micropuits, ni aucun des ligands de ciblage particulier sur la SSLB. Les micropuits sont occupés par des billes uniques parce que le diamètre du puits est réglée pour être juste supérieur au diamètre du bourrelet. En règle générale, plus de 75% des puits sont occupés, tandis que le reste demeure vide. Dans tampon tableaux SSLB affichent une stabilité à long terme de plus d'une semaine. Plusieurs types de SSLBs peuvent être placés dans un tableau unique par dépôt en série, et les matrices peuvent être utilisées pour la détection, dont on démontre par la caractérisation de l'interaction de la toxine cholérique avec le ganglioside GM1. Nous montrons également que les vésicules de phospholipides sans supports de talon et des membranes biologiques à partir de sources cellulaires peuvent être disposés avec la même méthode et les lipides membranaires spécifiques de cellules peuvent être identifiées.
Introduction
Membranes bicouches lipidiques sont des structures essentielles dans la nature. Les membranes plasmiques et les membranes cellulaires des organites sont composées de bicouches lipidiques incorporant un certain nombre de molécules qui sont nécessaires à la vie. De nombreux procédés de survie se produisent sur la surface de cellules ou sont médiées par des molécules associées aux membranes bicouches de lipides. En fait, de nombreux procédés pharmaceutiques ou des molécules cibles se trouvent sur ou dans les membranes 1,2. Il est donc nécessaire d'étudier analytiquement les processus, tels que des réactions chimiques ou des événements de liaison non covalentes qui se produisent sur les surfaces de la membrane. Les membranes naturelles peuvent être difficiles à isoler et / ou l'interface de capteurs, de nombreux chercheurs utilisent des membranes modèles simplifiés de réaliser des études analytiques. Un certain nombre de systèmes de membrane modèle sont décrits dans la littérature, allant de vésicules géantes qui peuvent être des dizaines à des centaines de microns de diamètre à des liposomes de dimensions nanométriques 3,4. Alterntivement, des bicouches lipidiques planes déposés sur des supports solides, à savoir, soutenus bicouches lipidiques (BLP), peuvent être formées sur un certain nombre de surfaces différentes et ont été largement utilisés dans des applications biophysiques, biochimiques et d'analyse 5. Couplage BLP avec des matériaux électriques ou optiques permet l'étude de la biochimie et de la biophysique de la membrane grâce à l'utilisation de différentes techniques d'analyse. Microscopie de fluorescence 6, 7 électrochimie, la spectroscopie optique 8, la microscopie à sonde de balayage 9, la résonance plasmonique de surface 10, et la spectrométrie de masse 11 ont tous été utilisés pour étudier la structure et les propriétés de BLP.
Tableaux SLB offrent plus de polyvalence dans la conception de capteurs pour les essais multiplex 12,13. D'autres applications utilisent des tableaux SLB pour imiter la jonction qui se forme entre les cellules immunitaires 14. Méthodes de préparation pour les tableaux SLB ont varié de microfluidic atteint près de 15 pour ceux qui emploient des barrières physiques entre les parcelles adjacentes SLB. 16 autres groupes ont utilisé des méthodes d'impression 17, 18 et structuration photochimique diverses approches nanogénie 19 pour créer des tableaux SLB.
Dans le présent document vidéo d'accompagnement et nous démontrons une méthode pour former des réseaux par dépôt SLB SLB-SiO 2 revêtues perles en ensembles ordonnés de micropuits 20. Nous nous référons aux SLB-revêtus de SiO 2 perles en bicouches sphériques soutenues lipidiques (SSLBs). Cette technique est une extension des travaux antérieurs qui a créé des tableaux de vésicules de phospholipides et les membranes biologiques dérivés de sources naturelles 21, à partir de laquelle nous montrons aussi par exemple des résultats. D'autres procédés pour rangeant particules de biomembrane ou vésicules se sont appuyés sur les modes de ligands de ciblage spécifiques sur des surfaces qui s'associent avec des ligands complémentaires contenues sur la surface des vésicules. Les exemples incluent la biotineassociation avidine 22,23 et systèmes d'hybridation d'ADN 24. Notre approche ne nécessite qu'un réseau de micro-puits sans ciblage ou de reconnaissance des groupements nécessaires. La taille de SSLBs est défini par le diamètre des supports de SiO 2 de perles, qui ont une faible poly-dispersité. En ajustant le diamètre de microtitration à un peu plus grand que le diamètre SSLB, un seul SSLB se dépose dans chaque micropuits. Un poly (diméthyl siloxane) (PDMS) racloir enlève ensuite la surface de tous les SSLBs qui ne sont pas immobilisés dans des micropuits. Les puits et les tableaux SSLB résultantes ont haute densité (~ 10 5 SSLBs / mm 2) avec 3 pm espacement centre à centre et la périodicité hexagonale. En déposant en série avec SSLBs compositions lipidiques différentes, il est possible de créer des tableaux à plusieurs composants avec SSLBs positionnées de manière aléatoire. Afin de démontrer la capacité de détection de réseaux SSLB, nous avons utilisé l'interaction de la toxine cholérique (CTx) avec un ganglioside (GM1) incorporés dans les SSLBs. Avecparticules membranaires naturelles, nous avons pu détecter des lipides spécifiques des cellules dans des tableaux à plusieurs composants contenant des matières de la membrane à partir de deux types de cellules différents.
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Protocol
1. Microfabrication de Microwell tableau Substrat
- Commencez avec une tranche de 4 pouces de silicium de 100 nm d'oxyde à croissance thermique.
- Spin SPR-955 0,7 résine photosensible sur la tranche à 4000 tpm pendant 30 secondes.
- Cuire au four sur une plaque chauffante à 115 ° C pendant 90 secondes.
- Exposer résine photosensible.
- Utiliser un masque qui permettra de créer une um trous disposés suivant un réseau hexagonal avec une période de 3 um, où la matrice comprend une zone de 2 mm x 2 mm.
- Exposer la plaquette à un photorépéteur en ligne en utilisant une taille de pas de 6 mm et d'une exposition de 200 mJ / cm 2.
- Cuire au four sur une plaque chauffante à 115 ° C pendant 90 secondes.
- Développer l'aide d'un développeur de spin de déposer deux flaques de CD-26 sur la tranche pour une durée totale de développement de 90 sec.
- Rincez abondamment à l'eau ultra-pure de DI et sec avec N 2.
- Graver l'oxyde dans un graveur ionique réactive pour 6 min 50 sccm d'Ar, 25 sccm de CF 4, et 50 sccm de CHF 3 floaile à une pression de 75 mTorr.
- Graver le silicium dans une tranchée profonde ICP graveur ionique réactive pendant 2 min à 63 sccm de C 4 F 8, 27 sccm de SF6, 40 sccm d'Ar et 10 sccm d'O 2 qui s'écoule à une pression de 14 mTorr.
- Rincer à l'acétone, le méthanol et l'isopropanol pour éliminer résister.
- Placer dans un bain de H 2 SO 4: H 2 O 2 01 heures 01 pendant 10 minutes pour nettoyer la surface.
- Rincez abondamment à l'eau ultra-pure de DI et sec avec N 2.
- Déposer 1080 Å de Al 2 O 3 par dépôt de couches atomiques à 250 ° C.
2. Préparation de poly (diméthyl) Raclette
- Si possible, travailler en salle blanche. Travailler autrement dans l'environnement le plus propre possible.
- Obtenir un plat en plastique Petri (ou un autre récipient propre et jetable) avec ≥ 13 mm de côté.
- Dans ce plat, verser 5 g d'agent de durcissement PDMS, puis 50 g de PDMS base agent (ou quoi que ce soit avec un rapport de 1:10 qui la plupart du temps de remplir la boîte de Pétri). Mélanger soigneusement avec une pipette en plastique à usage unique ou d'une tige.
- Enlever les bulles en plaçant les PDMS mélangés dans une chambre avec une ligne de vide, le vide est appliqué jusqu'à ce que les bulles sortent du mélange (environ 30 min).
- S'il n'est pas déjà dans la boîte de Pétri, versez PDMS en boîte de Pétri, en évitant la création de bulles d'air.
- Cure nuit sur une plaque chauffante à> 50 ° C (chaleur plus élevée pour moins de temps travaille aussi).
- Avec la nouvelle lame propre / de rasoir, découpez soigneusement un morceau rectangulaire d'environ 2,5 x 2,5 cm, en gardant surface supérieure aussi propre que possible. Peler avec une pince propres. Coupez un bord (jusqu'à 1,5 cm) en appuyant sur la lame de rasoir en un seul mouvement, pour faire le bord supérieur aussi nette que possible (ce sera le bord utilisé dans le processus de raclette).
- Nettoyez avec de l'acétone, le méthanol, l'alcool isopropylique et de l'eau déminéralisée ultra-pure, puis sécher avec de l'azote gazeux propre. Stocker dans une boîte de Petri propre.
3. Préparation de vésicules
- Recueillir lipidiques solutions de stockage de phosphatidylcholine à 25 mg / ml oeuf (PC) et 1 mg / ml de 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N - (lissamine rhodamine B sulfonyl) de sel d'ammonium (Rho-DPPE) dans le chloroforme et un ml de solution à 0,5 mg / stock de monosialoganglioside GM1 dans le chloroforme / méthanol (2:1 v / v).
- Dans un flacon de petit verre faire un mélange qui résulte en 97% en moles de PC, de 2% en moles GM1 et 1% en moles de Rho-DPPE en ajoutant 18,9 pi de 25 mg / ml de PC, 39,6 ul de 0,5 mg / ml GM1 et 7,9 ul d' 1 mg / ml de Rho-DPPE en utilisant des seringues en verre.
- Remarque:. Le matériel supplémentaire pour Nair et al 25 contient une excellente feuille de calcul Excel personnalisable pour calculer les quantités de lipides nécessaires à la création des vésicules de toute composition souhaitée.
- Placer le flacon dans un dessiccateur à vide et éliminer le solvant en laissant le flacon sous vide pendant 6 heures.
- Faire une solution aqueuse de 0,1M NaCl. Ajouter 0,5 ml de la solution 0,1 M de NaCl dans le flacon contenant le film lipidique séché.
- Laisser le mélange de lipides aqueuse au repos pendant une nuit.
- Brièvement mélange vortex pour créer une suspension de vésicules, suivi d'une sonication pendant 20 min dans un bain de sonication à température ambiante.
- Extruder la suspension de vésicules à travers une membrane de polycarbonate de 100 nm de taille de pores. Passez la suspension de vésicules à travers le filtre de 17x.
- Stocker les vésicules extrudes dans un flacon en verre à 4 ° C.
4. Formation de bicouches lipidiques sphériques pris en charge
- Recueillir 700 nm de diamètre SiO 2 perles. Les perles sont livrés dans de l'eau distillée à une concentration de l'action de 1,4 x 10 11 billes / ml.
- Dans un tube Eppendorf de 1,5 ml préparer une suspension de billes de 1 ml avec une concentration de 1,5 x 10 billes / ml 10 par addition de 107 ul de solution de langue bourrelet à 893 ul de 0,1 M de NaCl.
- Vortex la suspension pour s'assurer qu'il est bien mixe.
- Centrifuger la suspension à 1700 g pendant 20 min, puis jeter le surnageant. Remettre en suspension les billes dans 1 ml de 0,1 M de NaCl. Répétez cette étape deux fois plus de se laver les perles.
- Pour former les SSLBs, dans un tube Eppendorf de 1,5 ml ajouter 25 ul de la suspension de billes de SiO 2 de 200 ul de 1 mg / ml de suspension de vésicules. Vortex le mélange et laisser reposer pendant 1 heure à température ambiante. A ce stade, la concentration devrait être SSLB 1,7 x 10 9 / ml SSLBs.
- Centrifugeuse à 1700 g pendant 20 min pour sédimenter les SSLBs. Le culot doit apparaître rose en raison de la rupture de vésicules avec Rho-DPPE sur les billes.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension dans 225 ul de phosphate (PBS), pH = 7,4. Répétez les étapes 4.6 à 4.7 deux fois de plus pour enlever les vésicules non rompues de la suspension SSLB.
5. Assemblée des SSLB tableau
- Plaquette Cleave de réseaux de micro-puits résultant en morceaux rectangulaires avec 4-6 microrowell tableaux par pièce.
- Vortex mélanger la suspension SSLB, puis placez 10 pi de SSLB suspension sur chaque réseau de puits. De peur reste pendant 1 heure pour permettre SSLBs pour régler à la surface.
- Lavez délicatement la puce de réseau de micro-puits avec du PBS à partir d'une bouteille de lavage, puis plonger dans un bain de PBS préparé dans un plat peu profond.
- Bien que submergé, placez doucement la PDMS chasse raclette sur la puce de réseau de micro-puits et faites glisser doucement le long de la surface 5x pour enlever SSLBs qui ne sont pas immobilisés dans des micropuits.
- Saisissez la puce de réseau de micropuits avec des pincettes et secouez-la délicatement dans le bain de PBS pour éliminer tout excès SSLBs.
- Enlever rapidement la puce du bain raclette et placer dans un bain de PBS frais jusqu'à utilisation ultérieure. Assurez-vous que la surface supérieure de la puce reste humide pour préserver les SSLBs.
Remarque: La méthode d'assemblage décrite ci-dessus peut être utilisée pour créer des matrices de particules de membrane naturels, comme des particules de la myéline isolés à partir de cerveau de souris, ou phovésicules spholipid sans SiO 2 supports de perles. Ce travail est décrit en détail dans Wittenberg et al. 21 et des résultats représentatifs sont présentés ci-dessous.
6. Toxine cholérique essai de liaison
- Préparer une solution à 2 mg / ml d'albumine de sérum bovin (BSA) dans du PBS.
- Préparer une solution à la concentration souhaitée de l'Alexa 488 conjugué à la toxine cholérique sous-unité B dans du PBS avec 2 mg / ml de BSA.
- Retirez la puce de réseau SSLB du bain de PBS et évacuer plus de la solution PBS en utilisant un laboratoire essuyer. Laisser juste assez de PBS sur la puce de garder le tableau SSLB hydratée.
- Pour éviter la liaison non spécifique, ajouter 200 ul de 2 mg / ml de solution de BSA à la puce de réseau SSLB. Laisser reposer pendant 1 heure dans une boîte humidifiée.
- Avec une micropipette, enlever 200 pi de solution à partir du haut de la puce de réseau SSLB.
- Ajouter 200 pi de solution de la toxine du choléra à la puce de réseau SSLB et laisser reposer pendant 1 heure dans une boîte humidifiée.
- Lavez délicatement la puce de réseau SSLB avec du PBS à partir d'une bouteille de lavage pour éliminer toute toxine cholérique non lié.
- Wick l'excès de PBS en utilisant un laboratoire essuyer. Avant imagerie puce de couverture avec un glissement de 24 mm de couverture x 40 mm.
- tableaux de l'image avec un microscope droit en utilisant un filtre fixe approprié pour les fluorophores d'intérêt.
- Analyser l'intensité de fluorescence de SSLBs individuels d'un tableau à l'aide de la fonction d'analyse de particules automatisé de logiciels ImageJ.
- Compiler intensités moyennes de SSLBs individuels de fluorescence en histogrammes qui résument les intensités des SSLBs trouvés sur un réseau donné.
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Representative Results
Lorsque des billes de SiO 2 sont mélangées avec une solution de vésicules composées de phospholipides, des lipides et d'autres lipides fluorescents tels que les gangliosides, les vésicules se rompent sur les surfaces de SiO 2 de talon pour former SSLBs, comme représenté schématiquement sur la figure 1a. Après lavage des SSLBs, une goutte de solution SSLB est placé sur une matrice de micro-puits, et les billes sont laisse décanter à la surface. (Figure 1b1) Ceci peut également être fait avec une suspension de vésicules de phospholipides ou de particules de membrane naturels, qui sont représentés sur la figure 1b2. Une image de fluorescence de vésicules de phospholipide adsorbé sur un substrat à réseau de micropuits est représenté sur la Figure 1b3. Ensuite, la raclette PDMS est fait glisser doucement sur la surface pour enlever les SSLBs (figure 1c1), vésicules ou des particules de membrane naturelle (figure 1c2) qui n'ont pas s'installer dans des micropuits. Il en résulte une matrice dans laquelle chaque SSLBmicropuits contient au plus un SSLB (figure 1d1) ou un tableau où de multiples vésicules ou des particules de membrane naturelle sont dans chaque puits (figure 1d2). Une image d'un micro-réseau composée de vésicules marquées par fluorescence est représentée sur la Figure 1d3.
.. Figure 1: Formation de SSLBs et SSLB ensemble de réseau (a) Illustration d'un SSLB composée de 3 types de lipides sur SiO 2 perle: oeuf PC (noir), Rho-DPPE (rouge) et GM1 (bleu). (B1-d1) Enchaînement des opérations pour le montage d'un réseau SSLB montrant SSLBs éparpillés sur un réseau de micro-puits (b1), l'utilisation d'une raclette PDMS pour dégager la surface de SSLBs pas réglé dans des micropuits (c1), et la dernière gamme SSLB (d1 ). (B2-d2 (B3) une image de fluorescence de vésicules de phospholipide adsorbé sur un substrat de micro-puits correspondant à l'illustration de (b2). (D3) une image de fluorescence d'un micro-réseau composée de vésicules phospholipidiques correspondant à l'illustration de (d2). Adapté de références 20 et 21 et utilisé avec la permission de l'American Chemical Society.
Individuels SiO 2 perles de soutien pour SSLBs dans micropuits ont été imagées par microscopie électronique à balayage (MEB) à la fois du haut-angle de vue et perspectives transversales. Une vue de dessus d'une zone d'environ 15 um x 15 um est représenté sur la figure 2a, tandis que la figure 2b représente une vue en coupe transversale d'une seule bille immobilisée dans unepuits. Le revêtement de la couche plus légère micropuits est de 100 nm de Al 2 O 3 déposé par dépôt de couche atomique pour régler le diamètre du puits de sorte que les puits sont capables de recevoir uniquement des perles individuelles.
Images de microscopie électronique Figure 2. Numérisation de tableaux SSLB. (A) Une micrographie électronique d'un 15 mm zone x 15 mm montrant SSLB supports pour motifs immobilisés dans des réseaux de micro-puits. (B) un diamètre de 700 nm dans un seul SSLB micropuits. Le revêtement de micropuits est Al 2 O 3, qui est déposé à rétrécir la cupule de sorte que seules les billes individuelles peuvent s'adapter à l'intérieur. Adapté de la référence 20 et utilisé avec la permission de l'American Chemical Society.
Une fois que les matrices SSLB sont préparés, ils peuvent être imagées par microscopie à fluorescence.
Dépôt séquentiel de différents types de SSLBs a été utilisée pour créer des matrices avec plus d'un type de SSLB, où l'identité de SSLBs individuelles a été déterminé par l'absence ou la présence d'un récepteur de la toxine (GM1) et sa liaison de la toxine cholérique (CTx). Le processus d'assemblage est le même que pour un seul type SSLB mais a été effectuée une seconde fois avec une identité différente SSLB. La concentration de départ était de SSLBs 10x plus faible afin de réduire l'occupation du premier type de SSLB et pour permettre à davantage de postes à être occupées par le deuxième type de SSLB. Dans les figures 3c à 3e, un tableau SSLB avec deux types de SSLBs est signalée. All des SSLBs contient fluorescent rouge Rho-DPPE (Figure 3c), mais seulement quelques-unes des SSLBs contient GM1, un ganglioside qui est le récepteur de la sous-unité B de la CTx. Lorsqu'il est exposé à fluorescence verte Alexa 488-conjugué CTx, seuls les SSLBs contenant GM1 fluorescence dans le canal vert (Figure 3d). Lorsque les images rouge et verte sont fusionnés, il est possible de déterminer quels SSLBs contiennent GM1 (jaune) et qui ne sont pas (rouge) (figure 3e).
Figure 3. Imagerie par fluorescence de tableaux SSLB. (A) A 100 um x 100 um zone contenant 936 Rho-DPPE marqués SSLBs oeuf PC. (B) Un fond clair et fluorescence superposition montrant une SSLB avec 76% des micro-puits occupés. (Ce) Un tableau contenant SSLB SSLBs qui contiennent Rho-DPPE(C), dont une fraction contient également GM1, qui est lié par l'Alexa-488 conjugué CTx (d). (E) les concentrations de canaux rouge et vert où fluorescence colocalisés indique la présence de GM1 sur le SSLB. Les cercles bleus indiquent SSLBs que seul fluorescence rouge, c'est à dire dépourvu GM1. Adapté de la référence 20 et utilisé avec la permission de l'American Chemical Society.
les données de fluorescence à partir de matrices SSLB a été analysé par mesure de l'intensité de SSLBs individuelles dans une image. Les données d'intensité à partir de SSLB tableaux ont été compilés dans des histogrammes. Figure 4a montre un histogramme à partir de cette analyse de la Rho-DPPE fluorescence à partir d'une matrice composée uniquement de SSLB SSLBs contenant de PC d'oeuf et 1% en moles de Rho-DPPE. Les données de la figure 4a ont été acquis par l'analyse de l'image de la figure 3a. Nous avons trouvé les tableaux SSLB pour être robuste et stable pour au moins une semaine au réfrigérateur unee immergée dans un tampon. Les tableaux n'ont pas perdu de l'intensité de fluorescence, ni ne l'occupation des tableaux changent au cours d'une semaine (figure 4b).
Figure 4. (A) Histogramme montrant la distribution des intensités de fluorescence pour la matrice SSLB représenté sur la figure 3a. L'intensité moyenne pour chaque SSLB dans la matrice a été utilisé pour compiler l'histogramme. La ligne continue est un ajustement gaussien aux données. (B) moyenne gamme occupation (cercles noirs) et de l'intensité de fluorescence (carrés rouges) pour un tableau SSLB surveillés au cours d'une semaine. Adapté de la référence 20 et utilisé avec la permission de l'American Chemical Society.
Nous avons fait des matrices composées d'SSLBs avec des concentrations variables de GM1 (0, 0,5, 1, unnd 2 mol%) et les expose à une concentration fixe de CTx ainsi que des tableaux avec des SSLBs avec des concentrations de GM1 et leur exposition à des concentrations variables de CTx. L'expérience a ensuite été utilisée pour déterminer la constante de dissociation à l'équilibre (Kd) pour la liaison GM1/CTx. Les tableaux SSLB avec concentration variable GM1 ont été exposées à 50 nM Alexa-488 marqué CTx pendant 1 heure puis lavé et imagée. L'intensité des histogrammes pour les tableaux SSLB avec 0,5 à 2% en moles GM1 exposées à 50 nM Alexa 488 CTx conjugué peut être vu dans la Figure 5a Figure 5b montre la dépendance linéaire de l'intensité de fluorescence moyenne de la concentration de GM1.. Lorsque la concentration de GM1 dans SSLBs est fixée à 2% en moles et les réseaux sont exposés à SSLB CTx allant de 16 pM à 158 nM, la réponse suit des courbes sigmoïdes de liaison comme le montre la figure 5c. Les courbes d'ajustement à ces données sont basées sur deux modèles de fixation différents: l'isotherme de Langmuir (équation 1) et le mode Hill-Waudl (équation 2). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
(1)
(2)
Où F est l'intensité de fluorescence à une concentration CTx donné, F max est l'intensité de fluorescence lors de la liaison est saturée, [CTx] est la concentration CTx, K D et K H sont les constantes de dissociation de la Langmuir et Hill-Waud correspond, respectivement , et n est le coefficient de coopérativité dans le modèle de Hill-Waud. Le coefficient de coopérativité (n) estime la quantité de liaison multivalent, où n supérieur à unon indique que chaque molécule se lie CTx plus d'un GM1. La concentration de CTx à 0,5 x F max est le K D ou K H pour l'interaction GM1/CTx. Dans nos expériences, nous avons calculé une K D de 1,6 ± 0,2 nM et K H de 1,4 ± 0,2 nM avec une valeur de n de 1,3, ce qui indique liaison coopérative. Les constantes de dissociation pour l'interaction GM1/CTx varient largement dans la littérature, allant de plus de cinq ordres de grandeur à partir de 16 heures 05 à 370 nM 26,27.
Figure 5. CTx/GM1 essais sur les tableaux SSLB liaison. (A) Les histogrammes de l'intensité de fluorescence de SSLBs individuelles à l'intérieur des tableaux SSLB. Les tableaux contenus SSLBs avec 0,5, 1 ou 2% en mole GM1 et ont été exposés à 50 nM Alexa 488-conjugué CTx. Lalignes continues sont des ajustements gaussiens. (B) tracé du moyen de distribution à partir de (a) en fonction de la concentration de GM1. (C) des courbes de liaison montrant la répartition des moyens de tableaux contenant SSLBs avec 2% en moles GM1 après exposition à l'Alexa-488 conjugué CTx variant de 16 pM à 158 nM. Les lignes sont des crises à l'isotherme de Langmuir (rouge) et Hill-Waud (bleu) des modèles de fixation. Les barres d'erreur dans (bc) représentent les écarts-types des distributions d'intensité de fluorescence correspondant à chaque point de données. Adapté de la référence 20 et utilisé avec la permission de l'American Chemical Society.
Comme mentionné précédemment, il est également possible de former des réseaux avec un matériau de biomembrane dérivé de sources naturelles 21. Les réseaux sont formés de la même manière, en dispersant des particules membranaires sur un substrat de micropuits, puis nettoyer la surface supérieure de la raclette pour laisser les particules de la membrane dans le microRowells. Figure 6 montre des exemples de la myéline et neuronales puces radeaux lipidiques. Sur la figure 6a, les particules de la myéline sont marqués avec le fluorophore lipophile FM1-43. Les radeaux lipidiques sont connus pour être enrichi en cholestérol et des gangliosides, tels que GM1; ainsi, Alexa 488 conjugué CTx se lie fortement aux puces de radeaux lipidiques comme le montre la figure 6b, tandis que la streptavidine marquée par fluorescence (SAPE) ne se lie pas au tableau. (Figure 6c) Nous avons également créé des réseaux de bande en fournissant des particules de la myéline et des lipides radeau sur le substrat de micropuits avec une puce microfluidique avec 250 chaînes um-larges. Après administration de particules, la puce microfluidique a été détachée du substrat de micropuits et le processus de raclette réalisée comme d'habitude. Les tableaux de bandes ont ensuite été exposées à un anticorps fluorescent anti-oligodendrocytes IgM (IgM O4), qui se lie sulfatide trouvé dans la myéline. (Figure 7) La myéline et radeaux lipidiques bande microarrays de la figure 7 sont représentées à des niveaux croissants de grossissement, et, au plus haut niveau de grossissement, il est évident que les IgM O4 se lie uniquement à des puces à ADN en raison de la myéline sulfatide est absente dans les radeaux lipidiques.
Figure 6. Myéline particules et tableaux radeau de particules lipidiques neuronales. (A) Une puce à ADN de la myéline de particules où les particules de la myéline sont rendues fluorescentes par le fluorophore lipophile FM1-43. La ligne en pointillés indique le bord de la zone de matrice. (B) des lipides radeau microarray montrant liaison CTx aux particules radeaux lipidiques. (C) radeaux lipidiques microarray exposé à fluorescent streptavidine-phycoérythrine (SAPE) montrant peu ou pas de liaison non spécifique. Adapté de la référence 21 et utilisé avec la permission de la Chemical Soc américaineiety.
Figure 7. Tableaux multi-composants formés par livraison microfluidique de la myéline et des membranes neuronales radeau. (A) Image de fluorescence après la myéline et des radeaux ont été déposés par l'intermédiaire de canaux microfluidiques sur le substrat de puce à ADN. Les bandes de gauche et de droite contiennent la myéline et la bande du milieu contient les membranes neuronales radeau. Les membranes sont colorées avec FM1-43, qui marque tout le matériel lipidique. La barre d'échelle est de 250 um. (B) Image de fluorescence des trois mêmes bandes après l'application de la raclette PDMS et incubation avec IgM O4. La barre d'échelle est de 250 um. (CE) des images agrandies des trois bandes montrant que IgM O4 se lie uniquement aux puces de la myéline: (c) raie à gauche et (e) raie droite. Les barres d'échelle en pes groupes spéciaux CE sont 30 um. Adapté de la référence 21 et utilisé avec la permission de l'American Chemical Society.
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Discussion
Dans ce travail, nous montrons que monodisperses SiO 2 perles enrobées avec les bicouches lipidiques en charge peuvent être disposés en rangées de puits de microtitration, sans la nécessité de ligands de ciblage sur les bicouches lipidiques ou la surface du substrat, et les matrices peuvent être utilisées pour la caractérisation des interactions de toxine-lipide. Le nous constante de dissociation calculée pour la liaison CTx/GM1 compare favorablement, compte tenu de la grande disparité des valeurs dans la littérature, avec un rapport précédent par Winter et al., Où l'assemblage colloïdale de perles de lipides revêtu a été utilisée pour calculer une constante de dissociation d'environ 30 nM. En ajustant les données pour le modèle de liaison Hill-Waud, nous avons déterminé que l'interaction CTx/GM1 est multivalent probable, ce qui concorde avec les rapports précédents 28. Le B (liaison ganglioside) sous-unité de CTx existe sous la forme d'un pentamère, avec chacune des cinq unités capables de se lier à une molécule GM1 29; ainsi, il n'est pas surprenant que plus d'une sous-unité peut être lié donné la diffmobilité usive de GM1 dans BLP 30.
Les tableaux de perles chimiquement fonctionnalisés ont été utilisées dans d'autres études analytiques 31. Dans ces types d'expériences, les billes sont immobilisées dans des micropuits typiquement créées dans l'extrémité de fibres optiques gravées. Essais de fluorescence multiplex peuvent être réalisées dans cette configuration en mélangeant des sous-populations de billes et les immobiliser simultanément sur l'extrémité de la fibre optique 32. Dans notre test multiplex (figures 3c-3e), nous immobilisée SSLBs optiquement codées séquentiellement parce lipides sur SSLBs libres en solution peuvent être transférés d'un type de SSLB à l'autre 33. Bien que cela ajoute des étapes supplémentaires dans la préparation des tableaux SSLB, il ne consomme trop de temps et est l'approche la plus efficace pour les billes de lipides fonctionnalisés. Nous avons également codé spatialement tableaux en déposant différentes populations SSLB dans des réseaux de micro-puits adjacents, et il n'y a pas cros observables-talk entre les réseaux 20. Pour réduire les temps de préparation de l'échantillon, les tableaux SSLB peuvent être préparés à l'avance et utilisés lorsque cela est souhaité. Nous avons testé la stabilité des matrices, au cours d'une semaine et on a trouvé aucune dégradation significative des matrices en termes d'intensité de fluorescence, ce qui indique que la quantité de matière lipidique sur les SSLBs ne change pas avec le temps. En outre, le taux d'occupation du tableau ne change pas au fil du temps, ce qui suggère qu'une fois SSLBs sont immobilisés, ils ne se détachent pas de la cupule (figure 4b).
En plus des billes recouvertes d'bicouches lipidiques synthétiques, nous avons également utilisé ce procédé pour créer des matrices de particules membranaires naturelles 21. Dans ce travail, nous avons immobilisé particules de myéline dérivées de cerveau de souris, ainsi que des particules de la membrane neuronale, tels que la fraction lipidique radeau. Nous avons pu utiliser les tableaux pour identifier membrane des molécules de surface spécifiques des cellules par l'anticorps binding (figures 6 et 7). Par ailleurs, lorsque la taille de la cupule a été réduite à l'échelle nanométrique et de la surface supérieure de la matrice a été revêtue avec de l'or, nous avons été en mesure d'employer la résonance de plasmon de surface pour contrôler la liaison des anticorps à des particules de la membrane de myéline sans l'utilisation de marqueurs fluorescents. La principale différence entre l'utilisation et SSLB vésicules membranaires ou des particules naturelles pour former des matrices est que, dans le cas d'SSLBs la quantité exacte de matériau de membrane dans chaque micropuits est connue car seulement une seule bille peut se loger dans chaque puits. Avec des vésicules membranaires ou des particules naturelles, il n'existe aucun moyen pour contrôler la quantité de matière dans chaque puits, sauf pour ajuster la concentration à partir de vésicules ou de particules. Cependant, la variabilité du puits à puits du nombre de vésicules n'est pas très grande par rapport à la distribution des diamètres de vésicules 21.
Enfin, ce procédé peut avoir des divers applications futures. Junesch et ses collègues ont utilisé une raclette pour enlever nanoparticules pendant colloïdale lithographie nanofabrication 34. matrices de membranes peuvent être formées afin d'imiter des contacts cellule-cellule à étudier adhésion focale cellulaire 35 ou d'examiner la liaison de membrane de détection des protéines courbure 36. En outre, l'utilisation de billes poreuses faciliterait l'inclusion de protéines transmembranaires dans des bicouches lipidiques 37 ou la livraison de la cargaison locale stockée à des cellules en culture sur un substrat de réseau de biomembrane. La plate-forme de micro-puits est fabriqué par photolithographie, ce qui permet une grande souplesse de conception. Voici nos tableaux ont géométrie hexagonale, mais carré, linéaire, ou autres géométries peuvent être créés avec divers choix de périodicité et micropuits dimensions pour étudier les effets spatiaux d'adhésion focale.
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Disclosures
Les auteurs n'ont aucun intérêt financier concurrents à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par des subventions à SHO des National Institutes of Health (R01 GM092993), la National Science Foundation (NSF Career Award et DBI 0.964.216), l'Office of Naval Research (ONR) Programme du jeune chercheur et le Prix du partenariat Minnesota pour la biotechnologie et génomique médicale. fabrication de l'appareil a été réalisée à l'Université du Minnesota nanofabrication Center (NFC), qui reçoit le soutien de la NSF à travers le Réseau National Nanotechnology Infrastructure. Ce travail a également été soutenue par des subventions à M. de la National Institutes of Health (NS048357, R21 NS073684), la National Multiple Sclerosis Society (CA1060A11), la Applebaum, Hilton, Peterson et Sanford fondations et la famille McNeilus. Les auteurs tiennent à remercier Hyungsoon Im à l'aide d'illustrations et de Shailabh Kumar d'assistance à la microscopie électronique à balayage.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 inch silicon wafers | University Wafer | 425 | |
| Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist | MicroChem | SPR955-CM | |
| Shipley MICROPOSIT CD-26 developer | MicroChem | CD-26 | |
| i-line stepper | Canon | 2500 i3 stepper | |
| Vision 320 reactive ion etcher | Advanced Vacuum | Vision 320 RIE | |
| Deep trench reactive ion etcher | Plasma Therm | SLR-770 | |
| Atomic layer depostion system | Cambridge NanoTech | Savannah | |
| Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Egg phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt | Avanti Polar Lipids | 810158C | |
| Monosialoganglioside GM1 | Avanti Polar Lipids | 860065P | |
| Silica beads | Bangs Laboratories | SS03N/4666 | Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter. |
| Cholera toxin B-subunit, Alexa 488-conjugate | Molecular Probes | C-34775 | |
| Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate | R&D Systems | NL1326R | |
| FM1-43 | Molecular Probes | T-3136 | |
| Eppendorf MiniSpin centrifuge | Fisher Scientific | 05-401-09 |
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