Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

היווצרות של microarrays Biomembrane עם שיטת הרכבה מבוססת מגב

Published: May 8, 2014 doi: 10.3791/51501
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 3,4, 1,2
1Department of Electrical and Computer Engineering, University of Minnesota, 2Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota, 3Department of Neurology, Mayo Clinic College of Medicine, 4Department of Immunology, Mayo Clinic College of Medicine

Summary

bilayers שומנים נתמך וחלקיקי קרום טבעיים הם מערכות נוחים שיכול להתקרב למאפיינים של קרום תא ולהיות משולבות במגוון רחב של אסטרטגיות אנליטיות. כאן אנו מדגימים שיטה להכנת microarrays המורכב של SiO 2 חרוזים נתמכים שומנים מצופים bilayer, שלפוחית ​​פוספוליפידים או חלקיקי קרום טבעיים.

Abstract

קרומי bilayer שומנים מהווים את קרום הפלזמה של תאים ולהגדיר את הגבולות של אברונים subcellular. בטבע, קרומים אלה תערובות הטרוגנית של סוגים רבים של שומנים, מכילים חלבוני קרום הנכנס ומעוצבים עם פחמימות. בניסויים מסוימים, רצוי לנתק את מאפייני biophysical או ביוכימי של bilayer שומנים מאלה של הקרום הטבעי. מקרים כאלה קוראים לשימוש במערכות מודל כגון שלפוחית ​​ענקית, ליפוזומים או bilayers נתמכת שומנים (SLBs). מערכים של SLBs הם אטרקטיביים במיוחד ליישומי חישה ומחק תאי תאי אינטראקציות. כאן אנו מתארים שיטה חדשה ליצירת מערכי SLB. 2 חרוזים SiO submicron בקוטר הם מצופים ראשון עם bilayers שומנים ליצירת SLBs הכדורי (SSLBs). אז חרוזים מופקדים לתוך מערך של microwells submicron בקוטר מפוברק מיקרו. טכניקת ההכנה משתמשת "מגב" כדי לנקות את שטח המצע, בעוד leavinגרם מאחורי SSLBs שהתמקם microwells. שיטה זו לא דורשת שינוי כימי של מצע microwell, ולא כל ligands מיקוד מיוחד על SSLB. Microwells תפוס על ידי חרוזים בודדים בגלל הקוטר גם הוא מכוון להיות גדול יותר מקוטר חרוז. בדרך כלל, יותר 75% מהבארות שנכבשו, ואילו השאר יישאר ריק. במאגר מערכי SSLB להציג יציבות לטווח הארוך של יותר משבוע אחד. סוגים שונים של SSLBs יכולים להיות ממוקמים במערך יחיד בתצהיר סדרתי, והמערכים יכולים לשמש לחישה, שאנחנו מדגימים על ידי המאפיינים את האינטראקציה של רעלן הכולרה עם ganglioside GM1. כמו כן, אנו מראים כי שלפוחית ​​פוספוליפידים ללא תומך חרוז וbiomembranes ממקורות סלולריים יכולה להיות מסודרת עם באותה השיטה וניתן לזהות שומני קרום תא ספציפי.

Introduction

קרומי bilayer שומנים הם מבנים חיוניים בטבע. ממברנות פלזמה נייד וקרומים אברון מורכבים מbilayers שומנים המשלבים מספר המולקולות שאינן הכרחיים לחיים. תהליכי חיים מקיימים רבים מתרחשים על פני השטח של תאים או מתווכים על ידי מולקולות הקשורות לממברנות שומנים בדם bilayer. למעשה, תהליכים רבים תרופות יעד או מולקולות נמצאים על או בקרומי 1,2. לכן, יש לחקור בצורה אנליטית תהליכים, כגון תגובות כימיות או אירועים המחייבים noncovalent המתרחשים על פני שטח של קרום. מכיוון שקרומים טבעיים יכולים להיות קשים לבודד ו / או ממשק עם חיישנים, חוקרים רבים להעסיק ממברנות מודל פשוטות לבצע מחקרים אנליטיים. מספר מערכות קרום מודל מתוארים בספרות, החל משלפוחית ​​ענקית שיכולים להיות עשרות עד מאות מיקרונים בקוטר ליפוזומים עם ממדים ננומטריים 3,4. Alternatively, bilayers שומנים מישוריים שהופקד על תמיכה מוצקה, כלומר, נתמך bilayers שומנים (SLBs), יכול להיווצר במספר המשטחים השונים והיה בשימוש נרחב ביישומי biophysical, ביוכימיות, ואנליטיות 5. צימוד SLBs עם חומרים חשמליים או אופטיים מאפשר חקירה לביוכימיה וביופיסיקה קרום באמצעות השימוש בטכניקות אנליטיות שונות. מיקרוסקופ פלואורסצנטי 6, אלקטרוכימיה 7, ספקטרוסקופיה אופטית 8, בדיקה סריקה מיקרוסקופית 9, plasmon משטח התהודה 10, וספקטרומטריית מסת 11 כולם הועסקו כדי לחקור את המבנה והמאפיינים של SLBs.

מערכי SLB להציע צדדיות נוספת בעיצוב של חיישנים עבור מבחני זמנית 12,13. יישומים אחרים להשתמש במערכי SLB לחקות את הצומת שיוצרת בין תאים חיסוניים 14. שיטות הכנה למערכי SLB השתנו מmicrofluidic גישות 15 לאלה שמעסיקים מחסומים פיזיים בין טלאי SLB הסמוכים. 16 קבוצות אחרות השתמשו בשיטות הדפסה 17, דפוסים פוטו 18 וnanoengineering השונות גישות 19 ליצור מערכי SLB.

במאמר זה ובוידאו המצורף אנו מדגימים שיטה ליצירת מערכי SLB ידי הפקדת SiO 2 חרוזים מצופים SLB למערכים מסודרים של microwells 20. אנו מתייחסים לSiO 2 חרוזים מצופים SLB כbilayers הכדורית נתמכת שומנים (SSLBs). טכניקה זו היא הרחבה של עבודה קודמת שיצרו מערכים של שלפוחית ​​פוספוליפידים וbiomembranes נגזר ממקורות טבעיים 21, שממנו אנחנו גם להראות תוצאות ירושלים. שיטות אחרות לעריכת חלקיקי biomembrane או שלפוחית ​​יש לסמוך על דפוסים של ligands מיקוד הספציפי על משטחים שמקשרים עם ligands המשלים הכיל על פני השטח של השלפוחית. דוגמאות כוללות יוטיןעמותת avidin 22,23 וערכות הכלאת DNA 24. הגישה שלנו דורשת רק מערך microwell ללא moieties מיקוד או הכרה הכרחי. הגודל של SSLBs מוגדר על ידי הקוטר של תומך חרוז SiO 2, שיש לי poly-dispersity נמוך. על ידי כוונון קוטר microwell רק גדול יותר מאשר קוטר SSLB, רק SSLB אחת ישקע לתוך כל microwell. מגב פולי (dimethylsiloxane) (PDMS) ואז מסיר מעל פני השטח כל SSLBs שאינם משותקים בmicrowells. יש לי microwells ומערכי SSLB תוצאת צפיפות גבוהה (~ 10 5 SSLBs / 2 מ"מ) עם 3 מיקרומטר מרווח ומחזוריות משושה מרכז למרכז. באופן סדרתי הפקדת SSLBs עם קומפוזיציות שומנים שונות, אפשר ליצור מערכי multicomponent עם SSLBs ממוקם באופן אקראי. כדי להדגים את יכולת החישה של מערכי SSLB, השתמשנו באינטראקציה של רעלן הכולרה (CTX) עם ganglioside (GM1) שולב SSLBs. עםחלקיקי קרום טבעיים, שהיינו מסוגלים לזהות שומני תא ספציפי במערכי multicomponent מכילים חומר קרום משני סוגי תאים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Microfabrication של תשתית מערך microwell

  1. התחל עם פרוסות סיליקון 4 אינץ' עם של תחמוצת מבוגרת תרמית 100 ננומטר.
  2. ספין SPR-955 0.7 photoresist על פרוסות סיליקון ב4,000 סל"ד במשך 30 שניות.
  3. אופים על פלטה חמה ב115 מעלות צלזיוס במשך 90 שניות.
  4. לחשוף photoresist.
    1. השתמש במסיכה שתיצור 1 מיקרומטר חורים מסודרים במערך משושה עם 3 מיקרומטר תקופה שבה המערך משתרע על שטח מ"מ x 2 2 מ"מ.
    2. לחשוף רקיק בצעד i-קו באמצעות גודל צעד של 6 מ"מ וחשיפה של 200 mJ / 2 סנטימטר.
  5. אופים על פלטה חמה ב115 מעלות צלזיוס במשך 90 שניות.
  6. לפתח באמצעות מפתח ספין להפקיד 2 שלוליות של CD-26 על פרוסות סיליקון לזמן פיתוח כולל של 90 שניות.
  7. לשטוף ביסודיות עם מים ultrapure DI ויבשים עם N 2.
  8. לחרוט תחמוצת בחרט תגובתי יון ל6 דקות עם 50 SCCM של Ar, 25 SCCM של 4 CF, ו50 SCCM של 3 CHF פלואגף בלחץ של 75 mTorr.
  9. לחרוט סיליקון בחרט תגובתי יון עמוק תעלת ICP עבור 2 דקות עם 63 SCCM של 4 C F 8, 27 SCCM של SF 6, 40 SCCM של Ar, ו10 SCCM של O 2 זורם בלחץ של 14 mTorr.
  10. יש לשטוף באצטון, מתנול, וisopropanol להסיר להתנגד.
  11. מקום באמבטיה של H 2 SO 4: H 2 O 2 01:01 ל10 דקות כדי לנקות את השטח.
  12. לשטוף ביסודיות עם מים ultrapure DI ויבשים עם N 2.
  13. להפקיד 1,080 Å של Al 2 O 3 על ידי בתצהיר שכבה אטומי ב250 ° C.

2. הכנה של פולי (dimethylsiloxane) מגב

  1. במידת האפשר, לעבוד בחדר נקי. אחרת לעבוד בסביבה הנקיה ביותר האפשרית.
  2. השג צלחת פטרי מפלסטיק (או מיכל חד פעמי נקי אחר) עם ≥ צדדים 13 מ"מ.
  3. , במנה שישפוך את 5 סוכן ריפוי PDMS גרם, ואחריו 50 bas PDMS גרםסוכן דואר (או כל דבר עם יחס 1:10 שבעיקר ימלא את צלחת פטרי). מערבבים היטב עם טפטפת פלסטיק חד פעמי או מוט.
  4. הסר בועות על ידי הצבת PDMS המעורבת בתא עם קו ריק, החלת ואקום עד בועות יצאו מהתערובת (כ 30 דקות).
  5. אם לא כבר בצלחת פטרי, לשפוך PDMS בצלחת פטרי, הימנעות יצירה של בועות אוויר.
  6. לרפא לילה על פלטה חמה ב> 50 מעלות צלזיוס (חום גבוה יותר עבור פחות זמן גם עובד).
  7. עם סכין גילוח חדש / נקי, לחתוך בזהירות חתיכה כ 2.5 x 2.5 סנטימטר מלבני, שמירה על משטח עליון נקיים ככל האפשר. לקלף עם מלקחיים נקיים. לקצץ את קצה אחד (עד 1.5 סנטימטר) על ידי לחיצה על סכין גילוח בתנועה אחת, כדי להפוך את הקצה עליון חד ככל האפשר (זה יהיה בקצה המשמש בתהליך המגב).
  8. נקי עם אצטון, מתנול, אלכוהול איזופרופיל, ומים די ultrapure, ולאחר מכן מכה יבשה בגז חנקן נקי. אחסן בצלחת פטרי נקייה.

3. הכנת שלפוחית

  1. לאסוף פתרונות שומנים המניה של phosphatidylcholine ביצת 25 מ"ג / מיליליטר (PC) ו1 מ"ג / מיליליטר 1,2-dipalmitoyl-SN-glycero-3-phosphoethanolamine-N - (rhodamine lissamine B sulfonyl) מלח אמוניום (Rho-DPPE) בכלורופורם ו0.5 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות של monosialoganglioside GM1 בכלורופורם / מתנול (2:1 V / V).
  2. בבקבוקון זכוכית קטנה לעשות תערובת כי התוצאות במחשב 97% mol, 2% mol% mol Rho-DPPE GM1 ו1 על ידי הוספת 18.9 μl של 25 מחשב מ"ג / מיליליטר, 39.6 μl של 0.5 מ"ג / מיליליטר GM1 ו7.9 μl של 1 מ"ג / מיליליטר Rho-DPPE באמצעות מזרקים זכוכית.
  3. הערה:. החומר המשלים עבור Nair et al 25 מכיל גיליון אלקטרוני של Excel להתאמה אישית מצוין לחישוב הסכומים של שומנים הנדרשים כדי ליצור שלפוחית ​​של כל הרכב רצוי.
  4. הנח בקבוקון בייבוש ואקום ולהסיר הממס על ידי השארת הבקבוקון תחת ואקום במשך 6 שעות.
  5. הפוך תמיסה מימית של 0.1M NaCl. הוסף 0.5 מיליליטר של פתרון M NaCl 0.1 לבקבוקון המכיל את סרט שומנים בדם היבש.
  6. אפשר תערובת השומנים המימית לנוח למשך הלילה.
  7. תמהיל בקצרה מערבולת כדי ליצור השעיה שלפוחית, אז sonicate עבור 20 דקות בsonicator אמבטיה בטמפרטורת חדר.
  8. Extrude ההשעיה השלפוחית ​​דרך קרום פוליקרבונט עם 100 גודל נקבובית ננומטר. לעבור את ההשעיה השלפוחית ​​דרך 17x המסנן.
  9. אחסן את שלפוחית ​​extruded בבקבוקון זכוכית ב 4 ° C.

4. כינונה של bilayers שומנים נתמכים כדורי

  1. לאסוף 700 2 חרוזים SiO קוטר ננומטר. חרוזים מסופקים במים מזוקקים עם ריכוז מניות של 1.4 x 10 11 מיליליטר / חרוזים.
  2. בצינור 1.5 מיליליטר Eppendorf להכין השעיה חרוז 1 מיליליטר עם ריכוז של 1.5 x 10 10 מיליליטר / חרוזים ידי הוספת 107 μl של פתרון מניות חרוז ל893 μl של 0.1 M NaCl.
  3. מערבולת ההשעיה כדי להבטיח שהוא גם מיילXED.
  4. צנטריפוגה ההשעיה ב1,700 XG עבור 20 דקות לאחר מכן לבטל את supernatant. Resuspend את החרוזים 1 מיליליטר של 0.1 M NaCl. חזור על פעולה זו עוד פעמיים כדי לשטוף ביסודיות את החרוזים.
  5. כדי ליצור את SSLBs, בצינור 1.5 מיליליטר Eppendorf להוסיף 25 μl של ההשעיה חרוז SiO 2 200 μl של 1 מ"ג / מיליליטר השעיה שלפוחית. מערבולת את התערובת ולתת לעמוד במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. בשלב זה ריכוז SSLB צריך להיות 1.7 x 10 9 מיליליטר / SSLBs.
  6. צנטריפוגה ב 1,700 XG עבור 20 דקות עד גלולה SSLBs. גלולה אמורה להופיע ורוד בשל הקרע של שלפוחית ​​עם Rho-DPPE בחרוזים.
  7. בטל supernatant ו resuspend ב 225 פוספט μl סליין (PBS), pH = 7.4. חזור על שלבי 4.6-4.7 עוד פעמיים כדי להסיר את כל שלפוחית ​​unruptured מהשעית SSLB.

5. עצרת של מערך SSLB

  1. רקיק קליב של מערכי microwell וכתוצאה מחתיכות מלבניות עם 4-6 מיקרופוןמערכי Rowell ליחידה.
  2. מערבולת לערבב את ההשעיה SSLB, ואז למקם 10 μl של ההשעיה SSLB על כל מערך microwell. שמא מנוחה לשעה 1 כדי לאפשר SSLBs להתיישב על פני השטח.
  3. לשטוף בעדינות את שבב מערך microwell עם PBS מבקבוק לשטוף, ואז להשקיע באמבטית PBS שהוכנה בצלחת רדודה.
  4. אמנם מתחת למים, מניח בעדינות את סומק PDMS מגב על שבב מערך microwell ועדינות חלק אותו על פני השטח 5x כדי להסיר SSLBs שאינם משותקים בmicrowells.
  5. גריפ שבב מערך microwell עם פינצטה ובעדינות לנער באמבטיה PBS להסיר כל SSLBs עודף.
  6. להסיר במהירות את השבב מאמבטית המגב ומניח באמבט PBS טרי עד לשימוש נוסף. ודא שהמשטח העליון של השבב נותר לח כדי לשמר את SSLBs.

הערה: שיטת ההרכבה שתוארה לעיל יכולה לשמש ליצירת מערכים של חלקיקי קרום טבעיים, כמו חלקיקי מיאלין מבודדים ממוח עכבר, או פושלפוחית ​​spholipid ללא תומך חרוז SiO 2. עבודה זו מתוארת בפירוט וביטנברג ואח'. 21 ותוצאות נציג מוצגות להלן.

6. Assay עקידת רעלן כולרה

  1. הכן פתרון 2 מ"ג / מיליליטר של אלבומין בסרום השור (BSA) ב-PBS.
  2. הכן פתרון עם ריכוז רצוי של אלקסה 488 מצומדות רעלן הכולרה B-למקטע ב-PBS עם 2 מ"ג / מיליליטר BSA.
  3. הסר את שבב מערך SSLB מאמבטית PBS ופתיל משם את רוב פתרון PBS באמצעות מעבדה לנגב. השאר מספיק PBS על השבב כדי לשמור על מערך SSLB התייבשות.
  4. כדי למנוע ספציפי מחייב, להוסיף 200 μl של 2 מ"ג / מיליליטר פתרון BSA לשבב מערך SSLB. תן מנוחה לשעה 1 בתיבת humidified.
  5. עם micropipette, להסיר 200 μl של פתרון מהחלק העליון של שבב מערך SSLB.
  6. הוסף 200 μl של פתרון רעלן הכולרה לשבב מערך SSLB ולתת מנוחה לשעה 1 בתיבת humidified.
  7. לשטוף בעדינות את שבב מערך SSLB עם PBS מבקבוק לשטוף כדי להסיר כל רעלן הכולרה מאוגד.
  8. PBS משם העודף וויק באמצעות מעבדה לנגב. לפני ההדמיה כיסוי שבב עם תלוש לכסות x 40 מ"מ 24 מ"מ.
  9. מערכי תמונה עם מיקרוסקופ זקוף באמצעות מסנן קובע מתאימים לfluorophores של עניין.
  10. נתח את עוצמת הקרינה של SSLBs הבודד במערך באמצעות פונקצית ניתוח חלקיקים האוטומטית של תוכנת ImageJ.
  11. לקמפל עוצמות הקרינה ממוצעת מSSLBs הבודד לתוך היסטוגרמות המסכמות את העוצמות של SSLBs לציין במערך נתון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאשר 2 חרוזים SiO מעורבבים עם תמיסה של שלפוחית ​​המורכבת מפוספוליפידים, שומני ניאון ושומנים אחרים כגון gangliosides, שלפוחית ​​הקרע במשטחי חרוז SiO 2 כדי ליצור SSLBs, כפי שמוצגת באופן סכמטי באיור 1 א. לאחר שטיפת SSLBs, ירידה של פתרון SSLB מושם על מערך microwell, והחרוזים מותר להתיישב על פני השטח. (איור 1B1) זה יכול להיעשות גם עם השעיה של שלפוחית ​​פוספוליפידים או חלקיקי קרום טבעיים, המוצגים באיור 1B2. תמונת הקרינה של שלפוחית ​​פוספוליפידים נספחת למצע מערך microwell מוצגת באיור 1B3. ואז מגב PDMS עשוי להחליק בעדינות על פני השטח כדי להסיר כל SSLBs (איור 1c1), שלפוחית ​​או חלקיקי קרום טבעיים (איור 1c2) שלא להתיישב microwells. התוצאה היא מערך SSLB שבו כלmicrowell מכיל לכל היותר אחד SSLB (1d1 איור) או מערך שבו שלפוחית ​​מרובה או חלקיקי קרום טבעיים נמצאים בכל microwell (1d2 איור). תמונה של microarray המורכב מהשלפוחית ​​שכותרתו fluorescently מוצגת ב1d3 איור.

איור 1
.. איור 1 כינונה של אסיפת מערך SSLBs וSSLB (א) איור של SSLB המורכב מ 3 סוגים של שומנים בחרוז SiO 2: מחשב ביצה (שחור), Rho-DPPE (אדום) וGM1 (כחול). (ב 1-D1) זרימת תהליך להרכבה של מערך SSLB מראה SSLBs מפוזר על מערך microwell (ב 1), שימוש במגב PDMS כדי לנקות את פני השטח של SSLBs לא התמקם microwells (ג 1), ואת מערך SSLB הסופי (ד 1 ). (B2-D2 (ב 3) תמונת הקרינה של שלפוחית ​​פוספוליפידים על adsorbed מצע microwell המתאים לאיור ב( ב 2). (D3) תמונת הקרינה של microarray המורכב משלפוחית ​​פוספוליפידים המתאימות לאיור ב( D2). מעובד מתוך אזכור 20 ו21 ושימוש באישור של האגודה האמריקנית לכימיה.

SiO 2 חרוזים בודדים תומכים לSSLBs בmicrowells הם צילמו עם מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) משתי העליון המבט בזווית ופרספקטיבת חתך. מבט מלמעלה של אזור כ 15 מיקרומטר x 15 מיקרומטר מוצג באיור 2 א, בעוד שהאיור 2b מראה תצוגת חתך של חרוז אחד משותקת בmicrowell. שכבת ציפוי קלה microwell היא של אל 2 100 ננומטר O 3 שהופקד על ידי תצהיר שכבה אטומי כדי לכוון את הקוטר כל כך טוב שהבארות הן מסוגלת להכיל רק חרוזים בודדים.

איור 2
תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים איור 2. סריקה של מערכי SSLB. (א) מיקרוסקופ אלקטרונים של אזור x 15 מ"מ 15 מ"מ מראה תומך חרוז SSLB המשותק במערכי microwell. (ב) בקוטר 700 ננומטר אחת SSLB בmicrowell. ציפוי microwell הוא אל 2 O 3, אשר מופקד על מנת לכווץ את microwell כך שרק חרוזים בודדים יכולים להתאים בפנים. מעובד מתוך התייחסות 20 ושימוש באישור של האגודה האמריקנית לכימיה.

ברגע שמערכי SSLB מוכנים, הם יכולים להיות הדמיה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. איור 3 מציג אזור עם 550 microwells ו416 SSLBs לשיעור תפוסה של 76%.

בתצהיר רציף סוגים שונים של SSLBs של נעשה שימוש כדי ליצור מערכים עם יותר מסוג אחד של SSLB, שבו זהותו של SSLBs הבודד נקבעה על ידי ההיעדרות או נוכחות של הקולטן רעלן (GM1) ו המחייב של רעלן הכולרה (CTX). תהליך ההרכבה היה זהה לסוג SSLB בודד אלא בוצע בפעם שנייה עם זהות SSLB שונה. הריכוז התחלתי של SSLBs היה 10x נמוך יותר כדי להפחית את התפוסה של הסוג הראשון של SSLB ולאפשר ליותר משרות פנויות להיות כבושים על ידי הסוג השני של SSLB. ב3c-3E דמויות, מערך SSLB עם שני סוגים של SSLBs מוצג. אלl של SSLBs להכיל ניאון אדום Rho-DPPE (איור 3c), אבל רק חלק מSSLBs להכיל GM1, ganglioside שהוא קולטן עבור B-המקטע של CTx. כאשר נחשף לפלואורסצנטי ירוק CTx 488 מצומדות אלקסה, רק SSLBs מכיל GM1 לזרוח בערוץ הירוק (3d איור). כאשר התמונות האדומות וירוקות מתמזגים, ניתן לקבוע איזה SSLBs להכיל GM1 (צהוב) ואשר לא (אדום) (3 'איור) אין.

איור 3
איור 3. דימות פלואורסצנטי של מערכי SSLB. (א) x 100 אזור מיקרומטר 100 מיקרומטר המכיל 936 SSLBs מחשב ביצה שכותרת Rho-DPPE. (ב) כיסוי brightfield והקרינה מראה SSLB עם 76% מmicrowells הכבושים. (CE) מערך SSLB מכיל SSLBs המכיל Rho-DPPE(ג), חלק קטן מהם מכיל גם GM1, שהוא מחויב CTx Alexa-488 מצומדות (ד). (ה) מיזוג של ערוצים אדומים וירוקים שבו הקרינה colocalized מעידה על קיומו של GM1 על SSLB. העיגולים הכחולים מצביעים SSLBs שרק לזרוח אדום, כלומר חסרי GM1. מעובד מתוך התייחסות 20 ושימוש באישור של האגודה האמריקנית לכימיה.

נתוני הקרינה ממערכי SSLB נותחו על ידי מדידת עוצמת SSLBs פרט בתמונה. נתוני עוצמת SSLB ממערכים לוקטו להיסטוגרמות. תרשים 4 א מציג היסטוגרמה אחת כזו מהניתוח של הקרינה Rho-DPPE ממערך SSLB המורכב אך ורק של SSLBs מכיל מחשב ביצה וmol% 1 Rho-DPPE. הנתונים בתרשים 4 א נרכשו על ידי ניתוח התמונה באיור 3 א. מצאנו מערכי SSLB להיות חזקים ויציבים למשך שבוע אחד לפחות, כאשר בקירורnd שקוע במאגר. המערכים לא לאבד את כל עוצמת הקרינה, וגם לא התפוסה של המערכים לשנות במהלך שבוע אחד (איור 4).

איור 4
איור 4. (א) היסטוגרמה המציגה את התפלגות עוצמות הקרינה למערך SSLB שמוצג באיור 3 א. העצמה הממוצעת עבור כל SSLB במערך הייתה בשימוש כדי לקמפל את ההיסטוגרמה. הקו המוצק הוא גאוס לנכון את הנתונים. (ב) ממוצע תפוסת מערך (עיגולים שחורים) ועוצמת הקרינה (ריבועים אדומים) עבור מערך SSLB במעקב במשך שבוע אחד. מעובד מתוך התייחסות 20 ושימוש באישור של האגודה האמריקנית לכימיה.

עשינו מערכים מורכבים מSSLBs עם ריכוזים שונים של GM1 (0, 0.5, 1nd 2% mol) וחשף אותם לריכוז קבוע של CTx כמו גם מערכים עם SSLBs עם ריכוזים של GM1 וחשף אותם לריכוזים שונים של CTx. הניסוי מאוחר יותר שימש כדי לקבוע את קבוע דיסוציאציה שיווי המשקל (KD) לGM1/CTx מחייב. מערכי SSLB עם ריכוז GM1 שונה נחשפו ל50 ננומטר-Alexa 488 CTx שכותרתו עבור שעה 1 ולאחר מכן שטפה וצלמה. עוצמת היסטוגרמות עבור מערכי SSLB עם 0.5 - 2% mol GM1 נחשפו ל50 ננומטר Alexa CTx 488 מצומדות שניתן לראות באיור 5 א 'איור 5 מראה את התלות ליניארית של עוצמת הקרינה ממוצעת על ריכוז GM1.. כאשר הריכוז של GM1 בSSLBs קבוע ב -2% mol ומערכי SSLB נחשפים לCTx החל 16 PM ל158 ננומטר, התגובה מחייבת כדלקמן עקומות sigmoidal כפי שמוצגת באיור 5 ג'. העקומות לנכון במידע זה מבוססות על שני מודלים שונים מחייבים: איזותרמה אנגמיור (1 Eq.) ומצב היל-ואודl (Eq. 2). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

משוואת 1 (1)

משוואה 2 (2)

כאשר F הוא את עוצמת הקרינה בריכוז CTx נתון, F המקסימום הוא עוצמת הקרינה כאשר מחייבים רווי, [CTx] הוא ריכוז CTX, K D ו-K H הם קבועי הדיסוציאציה מאנגמיור והיל-ואוד מתאים, בהתאמה , וn הוא מקדם cooperativity במודל היל-ואוד. מקדם cooperativity (n) מעריך את הסכום מחייב ערכי, שבו n הגדול מאחד מצביע על כך שכל מולקולת CTx נקשר יותר מפעם אחת GM1. הריכוז של CTx ב0.5 מקסימום F x הוא K D או K H לאינטראקציה GM1/CTx. בניסויים שלנו חישבנו K D של 1.6 ± 0.2 ננומטר ו-K H של 1.4 ± 0.2 ננומטר עם ערך n של 1.3, המציין מחייבים שיתוף פעולה. קבועי דיסוציאציה לאינטראקציה GM1/CTx להשתנות במידה רבה בספרות, החל ב -5 סדרי גודל מ4:05 ל370 ננומטר 26,27.

איור 5
איור 5. CTx/GM1 מחייב מבחני על מערכי SSLB. (א) היסטוגרמות של עוצמת הקרינה של SSLBs הבודד בתוך מערכי SSLB. המערכים הכילו SSLBs עם% mol 0.5, 1 או 2 GM1 ונחשפו ל50 ננומטר Alexa CTx 488-מצומדות.קווים מוצקים הם המתאימים גאוס. (ב) מגרש של הפצת פירוש מ( א) כפונקציה של ריכוז GM1. (ג) עקומות עקידה המציגות את התפלגות משמעות ממערכים המכילים SSLBs עם 2% mol GM1 לאחר החשיפה לCTx Alexa-488 מצומדות שונה מ16 PM ל158 ננומטר. הקווים הם מתאים לאיזותרמה אנגמיור (אדום) והיל-ואוד (הכחול) מודלים המחייבים. הברים השגיאה ב( BC) מייצגים את סטיות התקן של ההפצות של עוצמת הקרינה המתאימה לכל נקודת נתונים. מעובד מתוך התייחסות 20 ושימוש באישור של האגודה האמריקנית לכימיה.

כפי שהוזכר קודם לכן, אפשר גם ליצירת מערכים עם חומר biomembrane נגזר ממקורות טבעיים 21. המערכים נוצרים באותה הדרך, על ידי פיזור חלקיקי קרום על מצע microwell, ולאחר מכן לנקות את המשטח העליון עם המגב להשאיר מאחור חלקיקי קרום במיקרופוןrowells. איור 6 מציג דוגמאות של מיאלין וmicroarrays רפסודת שומנים העצבי. באיור 6 א, חלקיקי מיאלין מסומנים עם fluorophore lipophilic FM1-43. רפסודות שומנים בדם ידועות להיות מועשר בכולסטרול וgangliosides כגון GM1; וכך, Alexa 488 מצומדות CTx נקשר חזק microarrays רפסודת שומנים בדם, כפי שמוצג באיור 6 ב, בעוד streptavidin שכותרתו fluorescently (SAPE) לא להיקשר המערך. (איור 6 ג) אנחנו גם יצרנו מערכי פס על ידי אספקת חלקיקי מיאלין ורפסודת שומנים למצע microwell עם שבב microfluidic עם 250 ערוצים מיקרומטר רחבים. לאחר לידת חלקיקים, שבב microfluidic היה מנותק ממצע microwell ותהליך המגב מתבצע כרגיל. מערכי הפס לאחר מכן נחשפו לנוגדן פלואורסצנטי אנטי oligodendrocyte IgM (IgM O4), אשר נקשר sulfatide מצא במיאלין. (איור 7) microarray פס המיאלין ורפסודת שומנים בדםים באיור 7 מוצגים ברמות גוברת של הגדלה, וברמה הגבוהה ביותר של הגדלה, זה ברור ממבט ראשון שIgM O4 נקשר רק לmicroarrays המיאלין בגלל sulfatide נעדר מרפסודות השומנים בדם.

איור 6
איור 6. חלקיקי המיאלין ומערכי חלקיקי רפסודת שומנים עצביים. (א) microarray חלקיקי מיאלין שבו חלקיקי מיאלין ניתנים ניאון על ידי fluorophore lipophilic FM1-43. הקו המקווקו מציין את קצה שטח המערך. (ב) microarray רפסודה ליפידים מראה CTx מחייב את חלקיקי רפסודת שומנים בדם. (ג) microarray רפסודה ליפידים נחשף לstreptavidin-phycoerythrin ניאון (SAPE) מראה לא מעט על מנת ספציפי מחייב. מעובד מתוך התייחסות 21 ושימוש באישור של אגודה האמריקנית לכימיה Society.

איור 7
איור 7. מערכי multicomponent שהוקמו על ידי משלוח microfluidic של מיאלין וקרומים רפסודה עצביים. (א) תמונה פלואורסצנטי לאחר המיאלין ורפסודות הופקדה דרך ערוצי microfluidic על מצע microarray. פסי ימין ועל השמאל להכיל המיאלין והפס האמצעי מכיל ממברנות רפסודה עצביות. קרומי מגואלות FM1-43, אשר תוויות כל חומר השומנים בדם. סרגל קנה המידה הוא 250 מיקרומטר. (ב) תמונה פלואורסצנטי של אותו שלושת הפסים לאחר החלת מגב PDMS ודוגרים עם IgM O4. סרגל קנה המידה הוא 250 מיקרומטר. תמונות (CE) מוגדלים משלושה הפסים מראים כי IgM O4 נקשר רק לmicroarrays מיאלין: (ג) פס שמאל ופס ימני (ה). הברים בקנה מידה בעמ 'ce anels הוא 30 מיקרומטר. מעובד מתוך התייחסות 21 ושימוש באישור של האגודה האמריקנית לכימיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעבודה זו אנו מראים כי SiO 2 חרוזים monodisperse מצופים bilayers שומנים נתמכים ניתן ערוכים למערכי microwell ללא צורך במיקוד ligands על bilayers השומנים או פני המצע, והמערכים יכולים לשמש לאפיון אינטראקציות רעלן שומנים בדם. אנו קבועים דיסוציאציה שמחושבים לCTx/GM1 מחייב משווה לטובה, בהתחשב בפער הרחב של ערכים בספרות, בדו"ח קודם של חורף et al., שם הרכבה colloidal של חרוזים מצופים שומנים בדם שימשה לחישוב קבוע דיסוציאציה של כ 30 ננומטר. על ידי התאמת הנתונים למודל המחייב היל-ואוד, קבענו כי האינטראקציה CTx/GM1 צפויה ערכית, שמסכים עם דיווחים קודמים 28. B למקטע (ganglioside המחייב) של CTx קיים כpentamer, עם כל אחת מחמש היחידות המסוגלות מחייב מולקולת GM1 29; וכך, אין זה מפתיע כי למקטע אחד או יותר עשוי להיות מחויב נתון הבדלניידות usive של GM1 ב30 SLBs.

מערכים של חרוזים כימיים פונקציונליות כבר בשימוש במחקרים אנליטיים אחרים ביום 31. בסוגים אלה של ניסויים, חרוזים הם משותקים בדרך כלל בmicrowells שנוצר בסופו של סיבים אופטיים חרוטים. ניתן לבצע מבחני הקרינה זמנית בתצורה זו על ידי ערבוב אוכלוסיות של חרוזים ולשתק אותם בו זמנית על הקצה של הסיב האופטי 32. ב assay זמנית (איורים 3C-3E), אנחנו משותקים SSLBs אופטי מקודד ברצף בגלל שומנים בSSLBs החופשי בפתרון יכולים להיות מועברים מסוג אחד של SSLB ל33 אחר. אמנם זה מוסיף שלבים נוספים בהכנת מערכי SSLB, זה לא יותר מדי זמן רב והיא הגישה היעילה ביותר לחרוזים פונקציונליות שומנים בדם. יש לנו גם מקודדים מרחבית מערכים ידי הפקדת אוכלוסיות SSLB שונות במערכי microwell סמוכים, ואין CROs הנצפהs-שיחה בין המערכים 20. כדי לקצר את זמן הכנת המדגם, ניתן להכין מערכי SSLB מראש ומשמשים בעת הצורך. בדקנו את היציבות של מערכים במהלך שבוע אחד ולא מצאתי שום השפלה משמעותית של המערכים במונחים של עוצמת הקרינה, אשר מציינת כי כמות חומר על השומנים SSLBs אינה משתנה עם זמן. כמו כן, תפוסת המערך אינה משתנה לאורך זמן, מה שמצביע על כך שפעם אחת SSLBs הם משותקים, הם לא להתנתק מmicrowells (איור 4).

בנוסף לחרוזים מצופים בbilayers שומנים סינטטי, יש לנו גם השתמש בשיטה זו כדי ליצור מערכים של חלקיקי קרום טבעיים 21. בעבודה זו, אנו משותקים חלקיקי מיאלין נגזרים ממוח עכבר, כמו גם חלקיקי קרום עצביים, כגון שבריר שומנים רפסודה. היינו יכול להשתמש במערכים כדי לזהות מולקולות פני קרום תא ספציפי על ידי הנוגדנים בינדיng (איורים 6 ו -7). יתר על כן, כאשר הגודל של microwells הופחת ל ננו והמשטח העליון של המערך היה מצופה בזהב, היינו יכול להעסיק תהודה plasmon פני השטח כדי לפקח על כריכה של נוגדנים לחלקיקי קרום המיאלין ללא השימוש בתוויות ניאון. ההבדל העיקרי בין שימוש SSLB ושלפוחית ​​או חלקיקי קרום טבעיים ליצירת מערכים הוא כי במקרה של SSLBs את הסכום המדויק של חומר קרום בכל microwell ידוע כי רק חרוז אחד יכול להתאים גם בכל אחד. עם שלפוחיות או חלקיקי קרום טבעיים, אין דרך לשלוט בכמות של חומר בכל microwell, מלבד כדי להתאים את הריכוז ההתחלתי של שלפוחית ​​או חלקיקים. עם זאת, ההשתנות היטב היטב של מספר שלפוחית ​​אינה גדולות מאוד בהשוואה להפצה של קטרי שלפוחית ​​21.

לבסוף, שיטה זו יכולה להיות divאירי יישומים עתידיים. Junesch ועמיתים לעבודה שהועסקו מגב כדי להסיר חלקיקים במהלך nanofabrication יתוגרפיה colloidal 34. מערכי קרום יכולים להיווצר לחקות אנשי קשר תאי תאים לחקור הידבקות מוקד סלולרית 35 או לבחון המחייבים של חלבוני חישת עקמומיות הממברנה 36. בנוסף, השימוש בחרוזים נקבוביים יאפשר ההכללה של חלבונים הטרנסממברני לbilayers השומנים 37 או המשלוח מקומי של מטען מאוחסן בתאים בתרבית על מצע מערך biomembrane. פלטפורמת microwell היא מפוברק על ידי photolithography, המאפשר גמישות בעיצוב. כאן היו לנו מערכי גיאומטריה משושה, אך מרובע, ליניארי, או גיאומטריות אחרות יכול להיווצר עם משתנה ממדי מחזוריות המערך וmicrowell כדי לחקור את ההשפעות המרחבי של הידבקות מוקד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים לSHO מן המכונים הלאומיים לבריאות (R01 GM092993), הקרן הלאומית למדע (NSF פרס הקריירה וDBI 0,964,216), משרד מחקר של צי (ONR) צעיר תכנית החוקר ופרס מינסוטה השותפות לביוטכנולוגיה וג'נומיקס הרפואי. ייצור מכשיר בוצע במרכז אוניברסיטת מינסוטה Nanofabrication (NFC), שזוכה לתמיכה מNSF דרך רשת ננוטכנולוגיה התשתיות הלאומית. עבודה זו נתמכה גם על ידי מענקים למר מהמכונים הלאומיים לבריאות (NS048357, R21 NS073684), יסודות האגודה הלאומית הטרשת הנפוצה (CA1060A11), אפלבאום, הילטון, פיטרסון וסנפורד ומשפחת McNeilus. המחברים מבקשים להודות Hyungsoon Im לסיוע עם איורים וShailabh קומאר לקבלת סיוע במיקרוסקופיית אלקטרונים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4 inch silicon wafers University Wafer 425
Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist MicroChem SPR955-CM
Shipley MICROPOSIT CD-26 developer MicroChem CD-26
i-line stepper Canon 2500 i3 stepper
Vision 320 reactive ion etcher Advanced Vacuum Vision 320 RIE
Deep trench reactive ion etcher Plasma Therm SLR-770
Atomic layer depostion system Cambridge NanoTech Savannah
Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Egg phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 840051C
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt Avanti Polar Lipids 810158C
Monosialoganglioside GM1 Avanti Polar Lipids 860065P
Silica beads Bangs Laboratories SS03N/4666 Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter.
Cholera toxin B-subunit, Alexa 488-conjugate Molecular Probes C-34775
Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate R&D Systems NL1326R
FM1-43 Molecular Probes T-3136
Eppendorf MiniSpin centrifuge Fisher Scientific 05-401-09

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Drews, J. Drug discovery: A Historical Perspective. Science. 287 (5460), 1960-1964 (1126).
  2. Cooper, M. A. Advances in Membrane Receptor Screening and Analysis. J. Mol. Recognit. 17 (4), 286-315 (2004).
  3. Voskuhl, J., Ravoo, B. J. Molecular Recognition of Bilayer Besicles. Chem. Soc. Rev. 38 (2), 495-505 (2009).
  4. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (1002).
  5. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid Supported Lipid Bilayers: From Biophysical Studies to Sensor Design. Surf. Sci. Rep. 61 (10), 429-444 (2006).
  6. Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early Steps of Supported Bilayer Formation Probed by Single Vesicle Fluorescence Assays. Biophys. J. 83 (6), 3371-3379 (2002).
  7. Krysinski, P., Zebrowska, A., Michota, A., Bukowska, J., Becucci, L., Moncelli, M. R. Tethered Mono- and Bilayer Lipid Membranes on Au and Hg. Langmuir. 17 (13), 3852-3857 (2001).
  8. Li, L., Wang, H. F., Cheng, J. X. Quantitative Coherent anti-Stokes Raman Scattering Imaging of Lipid Distribution in Coexisting Domains. Biophys. J. 89 (5), 3480-3490 (2005).
  9. Richter, R. P., Brisson, A. R. Following the Formation of Supported Lipid Bilayers on Mica: A Study Combining AFM, QCM-D, and Ellipsometry. Biophys. J. 88 (5), 3422-3433 (2005).
  10. Dahlin, A., Zäch, M., Rindzevicius, T., Käll, M., Sutherland, D. S., Höök, F. Localized Surface Plasmon Resonance Sensing of Lipid-Membrane-Mediated Biorecognition Events. J. Am. Chem. Soc. 127 (14), 5043-5048 (2005).
  11. Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. Phase Separation of Lipid Membranes Analyzed with High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry. Science. 313 (5795), 1948-1951 (2006).
  12. Groves, J. T., Boxer, S. G. Micropattern Formation in Supported Lipid Membranes. Acc. Chem. Res. 35 (3), 149-157 (2002).
  13. Bally, M., Bailey, K., Sugihara, K., Grieshaber, D., Vörös, J., Stadler, B. Liposome and Lipid Bilayer Arrays Towards Biosensing Applications. Small. 6 (22), 2481-2497 (2010).
  14. Groves, J. T., Dustin, M. L. Supported Planar Bilayers in Studies on Immune Cell Adhesion and Communication. J. Immunol. Methods. 278 (1-2), 19-32 Forthcoming.
  15. Yang, T. L., Jung, S. Y., Mao, H. B., Cremer, P. S. Fabrication of Phospholipid Bilayer-Coated Microchannels for On-Chip Immunoassays. Anal. Chem. 73 (2), 165-169 (2001).
  16. Groves, J. T., Ulman, N., Boxer, S. G. Micropatterning Fluid Lipid Bilayers on Solid Supports. Science. 275 (5300), 651-653 (1997).
  17. Hovis, J. S., Boxer, S. G. Patterning and Composition Arrays of Supported Lipid Bilayers by Microcontact Printing. Langmuir. 17 (11), 3400-3405 (2001).
  18. Yee, C. K., Amweg, M. L., Parikh, A. N. Direct Photochemical Patterning and Refunctionalization of Supported Phospholipid Bilayers. J. Am. Chem. Soc. 126 (43), 13962-13972 (2004).
  19. Kelly, C. V., Craighead, H. G. Nanofabrication for the Analysis and Manipulation of Membranes. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1356-1366 (2012).
  20. Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Oh, S. H. High-Density Arrays of Submicron Spherical Supported Lipid Bilayers. Anal. Chem. 84 (19), 8207-8213 (2012).
  21. Wittenberg, N. J., et al. Facile Assembly of Micro- and Nanoarrays for Sensing with Natural Cell Membranes. ACS Nano. 5 (9), 7555-7564 (2011).
  22. Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels. Angew. Chem. Int. Ed. 42 (45), 5580-5583 (2003).
  23. Kalyankar, N. D., et al. Arraying of Intact Liposomes into Chemically Functionalized Microwells. Langmuir. 22 (12), 5403-5411 (2006).
  24. Dahlin, A. B., Jonsson, M. P., Höök, F. Specific Self-Assembly of Single Lipid Vesicles in Nanoplasmonic Apertures in Gold. Adv. Mater. 20 (8), 1436-1442 (2008).
  25. Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using Patterned Supported Lipid Membranes to Investigate the Role of Receptor Organization in Intercellular Signaling. Nat. Protoc. 6 (4), 523-539 (2011).
  26. Kuziemko, G. M., Stroh, M., Stevens, R. C. Cholera Toxin Binding Affinity and Specificity for Gangliosides Determined by Surface Plasmon Resonance. Biochemistry. 35 (20), 6375-6384 (1996).
  27. Moran-Mirabal, J. M., Edel, J. B., Meyer, G. D., Throckmorton, D., Singh, A. K., Craighead, H. G. Micrometer-Sized Supported Lipid Bilayer Arrays for Bacterial Toxin Binding Studies Through Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Biophys. J. 89 (1), 296-305 (2005).
  28. Shi, J. J., Yang, T. L., Kataoka, S., Zhang, Y. J., Diaz, A. J., Cremer, P. S. GM1 Clustering Inhibits Cholera Toxin Binding in Supported Phospholipid Membranes. J. Am. Chem. Soc. 129 (18), 5954-5961 (2007).
  29. Gill, D. M. The Arrangement of Subunits in Cholera Toxin. Biochemistry. 15 (6), 1242-1248 (1021).
  30. Weng, K. C., Kanter, J. L., Robinson, W. H., Frank, C. W. Fluid Supported Lipid Bilayers Containing Monosialoganglioside GM1: A QCM-D and FRAP study. Colloid Surface B. 50 (1), 76-84 (1016).
  31. Walt, D. R. Fibre Optic Microarrays. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 38-50 (2010).
  32. Bake, K. D., Walt, D. R. Multiplexed Spectroscopic Detections. Annu. Rev. Anal. Chem. 1 (1), 515-547 (2008).
  33. Kundu, J., Levin, C. S., Halas, N. J. Real-Time Monitoring of Lipid Transfer Between Vesicles and Hybrid Bilayers on Au Nanoshells Using Surface Enhanced Raman Scattering (SERS). Nanoscale. 1 (1), 114-117 (2009).
  34. Junesch, J., Sannomiya, T., Dahlin, A. B. Optical Properties of Nanohole Arrays in Metal-Dielectric Double Films Prepared by Mask-on-Metal Colloidal Lithography. ACS Nano. 6 (11), 10405-10415 (2012).
  35. Wu, M., Holowka, D., Craighead, H. G., Baird, B. Visualization of Plasma Membrane Compartmentalization with Patterned Lipid Bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (38), 13798-13803 (2004).
  36. Hatzakis, N. S., Bhatia, V. K., Larsen, J., Madsen, K. L., Bolinger, P. Y., Kunding, A. H., Castillo, J., Gether, U., Hedegard, P., Stamou, D. How Curved Membranes Recruit Amphipathic Helices and Protein Anchoring Motifs. Nat. Chem. Biol. 5 (11), 835-841 (2009).
  37. Roizard, S., Danelon, C., Hassaine, G., Piguett, J., Schulze, K., Hovius, R., Tampe, R., Vogel, H. Activation of G-Protein-Coupled Receptors in Cell-Derived Plasma Membranes Supported on Porous Beads. J. Am. Chem. Soc. 133 (42), 16868-16874 (2011).

Tags

הנדסת ביוטכנולוגיה, bilayer שומנים נתמך חרוזים microarray הקרינה microfabrication nanofabrication בתצהיר שכבה אטומית מיאלין רפסודות שומנים בדם גיליון 87
היווצרות של microarrays Biomembrane עם שיטת הרכבה מבוססת מגב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wittenberg, N. J., Johnson, T. W.,… More

Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Jordan, L. R., Xu, X., Warrington, A. E., Rodriguez, M., Oh, S. H. Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method. J. Vis. Exp. (87), e51501, doi:10.3791/51501 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter