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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Formazione di microarray di membrana con un metodo di assemblaggio con sede a seccatoio

Published: May 8, 2014 doi: 10.3791/51501
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 3,4, 1,2
1Department of Electrical and Computer Engineering, University of Minnesota, 2Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota, 3Department of Neurology, Mayo Clinic College of Medicine, 4Department of Immunology, Mayo Clinic College of Medicine

Summary

Bistrati lipidici supportati e particelle di membrana naturali sono sistemi convenienti che può approssimare le proprietà delle membrane cellulari e di essere incorporati in una varietà di strategie analitiche. Qui mostriamo un metodo per preparare microarray composto da supportati doppio strato lipidico rivestite SiO 2 perline, vescicole di fosfolipidi di membrana o particelle naturali.

Abstract

Doppio strato lipidico delle membrane formano le membrane plasmatiche delle cellule e definiscono i confini di organelli subcellulari. In natura, queste membrane sono miscele eterogenee di molti tipi di lipidi, contengono proteine ​​di membrana e sono decorate con i carboidrati. In alcuni esperimenti, è opportuno disaccoppiare le proprietà biofisiche o biochimiche del doppio strato lipidico da quelle della membrana naturale. Tali casi richiedono l'uso di sistemi modello come vescicole giganti, liposomi o doppi strati lipidici supportati (SLB). Matrici di SLB sono particolarmente interessanti per le applicazioni di rilevamento e mimando interazioni cellula-cellula. Qui si descrive un nuovo metodo per la formazione di matrici SLB. Inferiori al micron di diametro SiO 2 perle sono in primo luogo rivestiti con doppi strati lipidici per formare SLB sferici (SSLBs). Le perle sono poi depositati in una matrice di pozzetti inferiori al micron di diametro micro-fabbricato. La tecnica di preparazione utilizza un "seccatoio" per pulire la superficie del substrato, mentre leaving dietro SSLBs che si sono insediati nei pozzetti. Questo metodo non richiede alcuna modificazione chimica del substrato micropozzetti, né alcun particolare ligandi di targeting sul SSLB. I micropozzetti sono occupate da singole perline perché il diametro bene sia sintonizzato essere appena superiore al diametro del branello. Tipicamente, più il 75% dei pozzi sono occupati, mentre il resto rimane vuoto. In tampone array SSLB mostrano stabilità a lungo termine maggiore di una settimana. Diversi tipi di SSLBs possono essere collocati in una singola matrice mediante deposizione seriale, e le matrici possono essere usate per il rilevamento, che dimostriamo caratterizzando l'interazione di tossina colerica con ganglioside GM1. Mostriamo anche che vescicole fosfolipidiche che non supporti cerchietti e biomembrane da fonti cellulari possono essere disposte con lo stesso metodo e lipidi di membrana cellula-specifici possono essere identificati.

Introduction

Le membrane doppio strato lipidico sono strutture essenziali in natura. Membrane plasmatiche cellulare e membrane degli organelli sono composti di bistrati lipidici che incorporano un numero di molecole che sono necessarie per la vita. Molti processi di sostegno vitale verificano sulla superficie delle cellule o sono mediati da molecole associate con membrane a doppio strato lipidico. Infatti, molti prodotti farmaceutici processi o molecole bersaglio si trovano su o nelle membrane 1,2. È pertanto necessario indagare analiticamente processi, come reazioni chimiche o eventi di legame covalenti che si verificano sulla superficie della membrana. Poiché le membrane naturali possono essere difficili da isolare e / o interfaccia con i sensori, molti ricercatori utilizzano membrane modello semplificato di effettuare studi analitici. Un certo numero di sistemi a membrana modello sono descritti in letteratura, che vanno da vescicole giganti che possono essere decine a centinaia di micron di diametro a liposomi con dimensioni nanometriche 3,4. Alterntivamente, bistrati lipidici planari depositati su supporti solidi, cioè, supportati bistrati lipidici (SLB), possono essere formati su un numero di superfici diverse e sono stati ampiamente utilizzati in biofisici, biochimici e applicazioni analitiche 5. Accoppiamento SLB con materiali elettrici o ottici permette lo studio di membrana biochimica e biofisica attraverso l'uso di diverse tecniche analitiche. Microscopia a fluorescenza 6, elettrochimica 7, 8 spettroscopia ottica, microscopia a scansione di sonda 9, risonanza plasmonica di superficie 10, 11 e spettrometria di massa sono stati tutti impiegati per studiare la struttura e le proprietà di SLB.

Array SLB offrono maggiore versatilità nella progettazione di sensori per il test multiplex 12,13. Altre applicazioni utilizzano matrici SLB di imitare il bivio che si forma tra le cellule immunitarie 14. Metodi di preparazione per gli array SLB hanno variato dal microfluIDIC avvicina 15 a quelli che impiegano le barriere fisiche tra patch SLB adiacenti. sedici Altri gruppi hanno utilizzato metodi di stampa 17, patterning fotochimico 18 e vari approcci nanoingegneria 19 per creare array SLB.

In questo lavoro e video allegato si dimostra un metodo per formare matrici SLB depositando SLB-SiO 2 perle rivestite in array ordinati di micropozzetti 20. Ci riferiamo alle SLB-rivestite SiO 2 perle come sferici doppi strati lipidici supportati (SSLBs). Questa tecnica è un'estensione del precedente lavoro che ha creato schiere di vescicole fosfolipidiche e biomembrane derivati ​​da fonti naturali 21, da cui mostriamo anche Esempio risultati. Altri metodi per arraying particelle biomembrane o vescicole hanno fatto affidamento su modelli di specifici ligandi di targeting su superfici che si associano con ligandi complementari presenti sulla superficie delle vescicole. Gli esempi includono biotina-avidina associazione 22,23 e schemi di ibridazione DNA 24. Il nostro approccio richiede solo un array di micropozzetti senza di targeting o di riconoscimento porzioni necessarie. La dimensione di SSLBs è definita dal diametro delle SiO 2 supporti tallone, che hanno un basso poli-dispersity. Sintonizzando il diametro micropozzetti a poco più grande del diametro SSLB, un solo SSLB deposita in ciascun pozzetto. A poli (dimetilsiloxano) (PDMS) spatola rimuove poi dalla superficie tutti i SSLBs che non sono immobilizzati in pozzetti. I pozzetti e array SSLB risultanti hanno alta densità (~ 10 5 SSLBs / mm 2) con 3 micron spaziatura da centro a centro e la periodicità esagonale. Seriale i depositando SSLBs con differenti composizioni lipidiche, è possibile creare array multicomponenti con SSLBs posizionati in modo casuale. Per dimostrare la capacità di rilevamento di array SSLB, abbiamo usato l'interazione della tossina colerica (CTx) con un ganglioside (GM1) incorporato nei SSLBs. Conparticelle di membrana naturali, siamo stati in grado di rilevare lipidi cellula-specifici in matrici multicomponente contenenti materiale di membrana da due tipi di cellule differenti.

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Protocol

1. Microfabrication di Microwell Array substrato

  1. Iniziare con un wafer di silicio da 4 pollici con 100 nm di ossido cresciuto termicamente.
  2. Spin SPR-955 0,7 photoresist sul wafer a 4.000 rpm per 30 sec.
  3. Cuocere su una piastra riscaldante a 115 ° C per 90 sec.
  4. Esporre photoresist.
    1. Utilizzare una maschera che creerà 1 micron fori disposti in una matrice esagonale con un periodo di 3 micron in cui l'array copre un'area mm x 2 2 mm.
    2. Esporre wafer in un passo-passo i-line utilizzando un passo di 6 mm e una esposizione di 200 mJ / cm 2.
  5. Cuocere su una piastra riscaldante a 115 ° C per 90 sec.
  6. Sviluppare con uno sviluppatore di selezione per depositare 2 pozze d'CD-26 sul wafer per un tempo di sviluppo totale di 90 sec.
  7. Sciacquare abbondantemente con acqua ultrapura DI e asciugare con N 2.
  8. Etch l'ossido in un incisore reattiva ioni di litio per 6 min con 50 sccm di Ar, 25 sccm di CF 4 e 50 sccm di CHF 3 floala ad una pressione di 75 mTorr.
  9. Etch silicio in una profonda ICP-trincea incisore reattiva di litio per 2 min con 63 sccm di C 4 F 8, 27 sccm di SF 6, 40 sccm di Ar, e 10 sccm di O 2 che scorre ad una pressione di 14 mTorr.
  10. Sciacquare in acetone, metanolo e isopropanolo per rimuovere resistere.
  11. Posto in un bagno di H 2 SO 4: H 2 O 2 1:1 10 min per pulire la superficie.
  12. Sciacquare abbondantemente con acqua ultrapura DI e asciugare con N 2.
  13. Deposita 1.080 Å di Al 2 O 3 da deposizione di strati atomici a 250 ° C.

2. Preparazione di Poli (dimetilsiloxano) seccatoio

  1. Se possibile, lavorare in una camera sterile. In caso contrario, lavorare in un ambiente più pulito possibile.
  2. Ottenere un piatto di plastica Petri (o altro contenitore monouso pulito) con ≥ 13 millimetri lati.
  3. In quel piatto, versare il 5 g agente indurente PDMS, seguita da 50 g di PDMS base l'agente (o qualsiasi cosa con un rapporto 1:10 che per lo più riempire il piatto di Petri). Mescolare accuratamente con una pipetta di plastica usa e getta o asta.
  4. Rimuovere le bolle posizionando il PDMS misti in una camera con una linea di vuoto, applicando vuoto fino bolle fuoriescono miscela (circa 30 min).
  5. Se non è già nel piatto di Petri, versare PDMS in piatto di Petri, evitando la creazione di bolle d'aria.
  6. Curare durante la notte su una piastra riscaldante a> 50 ° C (maggiore calore per meno tempo funziona anche).
  7. Con la nuova / lama di rasoio pulito, accuratamente tagliato un pezzo rettangolare di circa 2,5 x 2,5 centimetri, mantenendo superficie superiore più pulito possibile. Sbucciare fuori con una pinza pulita. Tagliare un bordo (fino a 1,5 cm) premendo sulla lama di rasoio in un unico movimento, per rendere bordo superiore più nitido possibile (questo sarà il bordo utilizzato nel processo tergipavimento).
  8. Pulire con acetone, metanolo, alcol isopropilico e acqua deionizzata ultrapura, e poi asciugare con azoto pulito. Conservare in un piatto pulito Petri.

3. Preparazione di vescicole

  1. Raccogliere soluzioni stock lipidici di fosfatidilcolina 25 mg / ml uovo (PC) e 1 mg / ml di 1,2-dipalmitoil-sn-glycero-3-fosfoetanolamina-N - (lissamina rodamina B sulfonyl) sale di ammonio (Rho-PDPE) in cloroformio e / soluzione madre ml 0,5 mg di monosialoganglioside GM1 in cloroformio / metanolo (2:1 v / v).
  2. In un flaconcino piccolo bicchiere fare una miscela che si traduce nel 97% molare PC, 2 mol% GM1 e 1 mole% Rho-PDPE aggiungendo 18,9 ml di 25 mg / ml PC, 39,6 ml di 0,5 mg / ml GM1 e 7,9 ml di 1 mg / ml Rho-PDPE usando siringhe di vetro.
  3. Nota:. Il materiale supplementare per Nair et al 25 contiene un ottimo foglio di calcolo Excel personalizzabile per il calcolo degli importi di lipidi necessari per creare vescicole di qualsiasi composizione desiderata.
  4. Posizionare flaconcino in un essiccatore sotto vuoto e rimuovere il solvente lasciando il flaconcino sotto vuoto per 6 ore.
  5. Preparare una soluzione acquosa di 0,1M NaCl. Aggiungere 0,5 ml di soluzione 0,1 M di NaCl al flaconcino contenente il film lipidico essiccato.
  6. Lasciare la miscela lipidica acquosa per riposare durante la notte.
  7. Brevemente mix vortice per creare una sospensione vescicola, poi con ultrasuoni per 20 minuti in un bagno sonicatore a temperatura ambiente.
  8. Prelevare la sospensione vescicola attraverso una membrana di policarbonato con 100 nm dimensione dei pori. Passare la sospensione vescicola attraverso il filtro di 17x.
  9. Conservare le vescicole estrusi in un flacone di vetro a 4 ° C.

4. Formazione di sferici supportati doppi strati lipidici

  1. Raccogliere 700 nm di diametro SiO 2 perline. Le perle sono forniti in acqua distillata con una concentrazione scorta di 1,4 x 10 11 perline / ml.
  2. In una provetta Eppendorf da 1,5 ml preparare una sospensione di sferette 1 ml con una concentrazione di 1,5 x 10 10 perline / ml aggiungendo 107 ml di soluzione tallone stock a 893 ml di 0,1 M NaCl.
  3. Agitare la sospensione per assicurarsi che sia ben missa.
  4. Centrifugare la sospensione a 1.700 xg per 20 minuti poi scartare il surnatante. Risospendere le sfere in 1 ml di 0,1 M di NaCl. Ripetere questa operazione altre due volte di lavare accuratamente le perline.
  5. Per formare i SSLBs, in una provetta Eppendorf da 1,5 ml aggiungere 25 microlitri della sospensione di sferette SiO 2 a 200 ml di 1 mg / ml di sospensione di vescicole. Vortex il composto e lasciate riposare per 1 ora a temperatura ambiente. In questa fase la concentrazione SSLB dovrebbe essere 1,7 x 10 9 SSLBs / ml.
  6. Centrifugare a 1.700 xg per 20 min a pellet i SSLBs. Il pellet dovrebbe apparire rosa a causa della rottura di vescicole con Rho-PDPE sulle perline.
  7. Eliminare il surnatante e risospendere in 225 microlitri tampone fosfato salino (PBS), pH = 7.4. Ripetere i passaggi 4,6-4,7 altre due volte per rimuovere eventuali vescicole unruptured dalla sospensione SSLB.

5. Assemblea dei SSLB Array

  1. Wafer Cleave di matrici micropozzetti con conseguente pezzi rettangolari con 4-6 micRowell array per pezzo.
  2. Vortex mescolare la sospensione SSLB, quindi versare 10 ml di sospensione SSLB su ogni matrice microwell. Per timore di riposo per 1 ora per consentire SSLBs di depositarsi sulla superficie.
  3. Lavare delicatamente il chip matrice pozzetto con PBS da una bottiglia di lavaggio, poi immergere in un bagno PBS preparato in un piatto fondo.
  4. Mentre sommerso, inserire delicatamente il PDMS filo seccatoio sul chip matrice microwell e farlo scorrere delicatamente lungo la superficie 5x per rimuovere SSLBs che non sono immobilizzati in pozzetti.
  5. Afferrare il chip matrice pozzetto con una pinzetta e delicatamente agitare nel bagno PBS per rimuovere eventuali SSLBs eccesso.
  6. Rimuovere rapidamente il chip dal bagno spatola e mettere in un bagno PBS fresco fino a nuovo uso. Assicurarsi che la superficie superiore del chip rimane bagnato per preservare le SSLBs.

Nota: Il metodo di assemblaggio sopra descritto può essere usato per creare matrici di particelle di membrana naturali, come particelle mielina isolato da cervello di topo, o phovescicole spholipid che non SiO 2 supporti tallone. Questo lavoro è descritto in dettaglio in Wittenberg et al. 21 e risultati rappresentativi sono mostrati di seguito.

6. Tossina colerica Binding Assay

  1. Preparare una soluzione di 2 mg / ml di sieroalbumina bovina (BSA) in PBS.
  2. Preparare una soluzione con concentrazione desiderata di Alexa 488 coniugato tossina colerica B-subunità in PBS con 2 mg / ml di BSA.
  3. Rimuovere il chip matrice SSLB dal bagno PBS ed evacuare la maggior parte della soluzione PBS usando un laboratorio pulire. Lasciare basta PBS sul chip per mantenere la matrice SSLB idratata.
  4. Per prevenire il legame non specifico, aggiungere 200 ml di 2 mg / ml BSA al chip matrice SSLB. Lasciare riposare per 1 ora in una scatola umidificata.
  5. Con una micropipetta, rimuovere 200 ml di soluzione dalla parte superiore del chip matrice SSLB.
  6. Aggiungere 200 ml di soluzione di tossina del colera al chip matrice SSLB e lasciare riposare per 1 ora in una scatola umidificata.
  7. Lavare delicatamente il chip matrice SSLB con PBS da una bottiglia di lavaggio per eliminare ogni tossina del colera non legato.
  8. Wick via l'eccesso di PBS utilizzando un laboratorio wipe. Prima di imaging chip di copertura con una scivolata 24 millimetri di copertura x 40 mm.
  9. Array di immagine con un microscopio verticale con filtro imposta appropriato per i fluorofori di interesse.
  10. Analizzare l'intensità di fluorescenza dei singoli SSLBs di un array utilizzando la funzione di analisi delle particelle automatizzata del software ImageJ.
  11. Compilare intensità di fluorescenza medi dei singoli SSLBs in istogrammi che riassumono le intensità di SSLBs trovate su un dato array.

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Representative Results

Quando SiO 2 perle sono mescolati con una soluzione di vescicole composte da fosfolipidi, lipidi fluorescenti e altri lipidi come gangliosidi, le vescicole si rompono sulle superfici SiO 2 cerchietti per formare SSLBs, come mostrato schematicamente in figura 1a. Dopo aver lavato i SSLBs, una goccia di soluzione SSLB è posto su una matrice microwell, e le perle sono autorizzati a stabilirsi in superficie. (Figura 1b1) Questo può essere fatto anche con una sospensione di vescicole fosfolipidiche o particelle di membrana naturali, che sono indicati in Figura 1b2. Una immagine di fluorescenza di vescicole fosfolipidiche adsorbiti su un substrato di matrice micropozzetti è mostrato in Figura 1b3. Successivamente viene effettuata la spatola PDMS a scivolare delicatamente sulla superficie per rimuovere eventuali SSLBs (Figura 1C1), vescicole o particelle di membrana naturale (Figura 1c2) che non stabilirsi in pozzetti. Ciò si traduce in una matrice in cui ogni SSLBmicrowell contiene al massimo una SSLB (Figura 1d1) o una matrice in cui più vescicole o particelle di membrana naturali sono in ciascun pozzetto (Figura 1D2). L'immagine di un microarray composto contrassegnati in modo fluorescente vescicole è mostrato in Figura 1D3.

Figura 1
.. Figura 1 Formazione di SSLBs e SSLB assembly array (a) Illustrazione di un SSLB composto da 3 tipi di lipidi su un cordone SiO 2: uovo PC (nero), Rho-PDPE (rossi) e GM1 (blu). (B1-d1) Flusso di processo per il montaggio di una matrice SSLB mostra SSLBs sparsi su un array di Elisa (b1), l'uso di una spatola PDMS per rimuovere la superficie di SSLBs non risolta nei pozzetti (c1), e il SSLB matrice finale (d1 ). (B2-d2 (B3) Una immagine di fluorescenza di vescicole fosfolipidiche adsorbiti su un substrato micropozzetti corrispondente all'illustrazione in (b2). (D3) Una immagine di fluorescenza di un microarray composto di vescicole fosfolipidiche corrispondenti alla illustrazione in (d2). Adattato da riferimenti 20 e 21 ed utilizzati con il permesso della American Chemical Society.

I singoli SiO 2 perle supporti per SSLBs in micropozzetti sono stati ripresi con la microscopia elettronica a scansione (SEM) sia top-vista angolare e le prospettive trasversali. Una vista dall'alto di una superficie di circa 15 micron x 15 micron è mostrato nella figura 2a, mentre la figura 2b mostra una vista in sezione trasversale di una singola goccia immobilizzato in unmicropozzetti. Lo strato più leggero rivestimento micropozzetto è 100 nm di Al 2 O 3 depositato mediante deposizione di strati atomici per sintonizzare il diametro del pozzo in modo che i pozzetti sono in grado di accogliere solo singole perline.

Figura 2
Immagini Figura 2. Microscopia elettronica a scansione di array SSLB. (A) Un microscopio elettronico di una zona x 15 mm 15 mm mostra SSLB supporti branello immobilizzati in matrici micropozzetti. (B) Un unico diametro 700 nm SSLB in un micropozzetti. Il rivestimento micropozzetti è Al 2 O 3, che è depositato per ridurre il micropozzetti in modo che solo le singole sfere possono adattarsi all'interno. Adattato da riferimento 20 ed utilizzati con il permesso della American Chemical Society.

Una volta che le matrici SSLB sono preparati, possono essere esposte al microscopio a fluorescenza. Figura 3b mostra un'area con 550 pozzetti e 416 SSLBs per un tasso di occupazione del 76%.

Deposizione sequenziale di diversi tipi di SSLBs stato usato per creare array con più di un tipo di SSLB, in cui l'identità dei singoli SSLBs stata determinata dalla assenza o presenza di un recettore di tossina (GM1) e il suo legame della tossina colerica (CTx). Il processo di assemblaggio è stata la stessa per un singolo tipo SSLB ma è stata effettuata una seconda volta con una diversa identità SSLB. La concentrazione iniziale di SSLBs era 10x inferiore per ridurre occupazione del primo tipo di SSLB e per consentire a più posti da occupare il secondo tipo di SSLB. Nelle figure 3c-3e, viene mostrato un array SSLB con due tipi di SSLBs. All delle SSLBs contenute fluorescente rossa Rho-DPPE (Figura 3c), ma solo alcune delle SSLBs contenute GM1, un ganglioside che è il recettore per la subunità B CTx. Se esposto a verde fluorescente Alexa 488-coniugato CTx, solo i SSLBs contenenti GM1 fluorescenza nel canale verde (Figura 3d). Quando le immagini rosse e verdi sono uniti, è possibile determinare quali SSLBs contengono GM1 (giallo) e che non (rosso) (figura 3e).

Figura 3
Figura 3. Fluorescenza imaging array SSLB. (A) A 100 micron x 100 micron zona contenente 936 Rho-PDPE marcati SSLBs egg PC. (B) Un campo chiaro e fluorescenza overlay che mostra un SSLB con il 76% dei pozzetti occupati. (Ce) Matrice SSLB contenente SSLBs che contengono Rho-PDPE(C), una frazione che contengono anche GM1, che è vincolato da Alexa-488-coniugato CTx (d). (E) Fusione dei canali rosso e verde dove fluorescenza colocalized indica la presenza di GM1 sulla SSLB. I cerchi blu indicano SSLBs che solo la fluorescenza rossa, cioè privo GM1. Adattato da riferimento 20 ed utilizzati con il permesso della American Chemical Society.

Dati di fluorescenza da matrici SSLB stato analizzato misurando l'intensità dei singoli SSLBs in un'immagine. I dati di intensità SSLB da matrici stata compilata nel istogrammi. Figura 4a mostra una tale istogramma dall'analisi di Rho-PDPE fluorescenza da una matrice SSLB composto unicamente di SSLBs contenenti uovo PC e 1 mole% Rho-PDPE. I dati della figura 4a sono stati acquisiti analizzando l'immagine in Figura 3a. Abbiamo trovato le matrici SSLB per essere robusto e stabile per almeno una settimana in frigorifero unnd sommerso in tampone. Gli array non hanno perso alcuna intensità di fluorescenza, né ha la capienza delle matrici cambiano nel corso di una settimana (Fig. 4b).

Figura 4
Figura 4. (A) istogramma che mostra la distribuzione di intensità di fluorescenza per la matrice SSLB mostrato nella figura 3a. L'intensità media di ogni SSLB nella matrice è stata utilizzata per compilare l'istogramma. La linea continua rappresenta una misura gaussiana ai dati. (B) Media matrice occupazione (cerchi neri) e l'intensità di fluorescenza (quadrati rossi) per una matrice SSLB monitorato nel corso di una settimana. Adattato da riferimento 20 ed utilizzati con il permesso della American Chemical Society.

Abbiamo fatto matrici composte SSLBs con concentrazioni variabili di GM1 (0, 0,5, 1 unnd 2 mol%) e esposto ad una concentrazione fissa di CTx nonché array con SSLBs con concentrazioni di GM1 e li esposti a concentrazioni variabili di CTx. L'esperimento è stato successivamente utilizzato per determinare la costante di dissociazione (Kd) per GM1/CTx vincolante. Gli array SSLB con vari concentrazione GM1 sono stati esposti a 50 nm Alexa-488 marcato CTx per 1 ora poi lavato e ripreso. L'intensità istogrammi per le matrici SSLB con, 0,5 - 2% molare GM1 esposti a 50 nM Alexa 488 coniugato CTx può essere visto in Figura 5a Figura 5b mostra la dipendenza lineare medio di intensità di fluorescenza dalla concentrazione GM1.. Quando la concentrazione di GM1 in SSLBs è fissato al 2% in moli e le matrici SSLB sono esposti a CTx vanno da 16 pM a 158 nM, la risposta vincolante segue curve sigmoidali come mostrato in Figura 5c. Le curve di adattamento ai dati sono basati su due diversi modelli di legame: l'isoterma di Langmuir (Eq. 1) e la modalità Hill-Waudl (Eq. 2). cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Equazione 1 (1)

Equazione 2 (2)

Dove F è l'intensità di fluorescenza a una data concentrazione CTx, F max è l'intensità di fluorescenza durante l'associazione è saturo, [CTx] è la concentrazione di CTx, K D e K H sono le costanti di dissociazione dal Langmuir e Hill-Waud misura, rispettivamente, , e n è il coefficiente cooperatività nel modello Hill-Waud. Il coefficiente cooperatività (n) stima la quantità di legame multivalente, dove un n maggiore disi indica che ogni molecola CTx lega più GM1. La concentrazione di CTx a 0.5 x F max è il K D o K H per l'interazione GM1/CTx. Nei nostri esperimenti abbiamo calcolato un K D di 1.6 ± 0.2 nM e K H di 1,4 ± 0,2 Nm con un valore di 1,3 n, indicando cooperativa vincolante. Le costanti di dissociazione per l'interazione GM1/CTx variano ampiamente in letteratura, che vanno oltre 5 ordini di grandezza dalla 4.5 pm 370 nM 26,27.

Figura 5
Figura 5. CTx/GM1 saggi sugli array SSLB vincolante. (A) istogrammi dell'intensità di fluorescenza di SSLBs individuali all'interno array SSLB. Le matrici contenute SSLBs con 0,5, 1 o 2 mol% GM1 e sono stati esposti a 50 nM Alexa 488 coniugato CTx. Illinee solide sono adatte gaussiana. (B) Appezzamento di distribuzione significa da (a) in funzione della concentrazione GM1. (C) le curve vincolanti che mostrano la distribuzione mezzi di array contenenti SSLBs con 2 mol% GM1 dopo l'esposizione a Alexa-488-coniugato CTx che varia dalle 16 alle 158 nM. Le linee sono adatte alla isoterma di Langmuir (rosso) e Hill-Waud (blu) modelli vincolanti. Le barre di errore a (bc) rappresentano le deviazioni standard delle distribuzioni di intensità di fluorescenza corrispondenti a ciascun punto di dati. Adattato da riferimento 20 ed utilizzati con il permesso della American Chemical Society.

Come accennato in precedenza, è anche possibile formare array con materiale biomembrane derivato da fonti naturali 21. Gli array sono formate nello stesso modo, disperdendo particelle di membrana su un substrato micropozzetti, poi pulire la superficie superiore con il tergipavimento lasciare dietro particelle membrana nel microfonoRowells. figura 6 mostra esempi di mielina e neuronali microarrays lipidi zattera. Nella Figura 6a, le particelle di mielina sono etichettati con il fluoroforo lipofilo FM1-43. Raft lipidici sono noti per essere arricchito in colesterolo e gangliosidi come GM1; quindi, Alexa 488 coniugato CTx lega fortemente ai microarray zattera lipidi come illustrato nella Figura 6b, mentre streptavidina fluorescente (SAPE) non si lega alla matrice. (Figura 6c) Abbiamo anche creato le matrici della banda fornendo particelle mielina e lipidi zattera al substrato pozzetto con un chip microfluidica con 250 canali micron-wide. Dopo la consegna delle particelle, il chip microfluidica è stato staccato dal substrato micropozzetti e il processo tergipavimento eseguita come di consueto. Gli array della banda sono stati poi esposti a una fluorescente anti-oligodendrociti anticorpi IgM (IgM O4), che si lega sulfatide trovato nella mielina. (Figura 7) La mielina e lipidi zattera striscia microarrays in Figura 7 sono riportati a livelli crescenti di ingrandimento, e al massimo livello di ingrandimento, è evidente che IgM O4 lega solo ai microarrays mielina perché sulfatide è assente dalle zattere lipidiche.

Figura 6
Figura 6. Particella mielina e neuronali array di particelle raft lipidici. (A) Un microarray particella mielina dove le particelle mielina sono resi fluorescente dal fluoroforo lipofilo FM1-43. La linea tratteggiata indica il limite dell'area matrice. (B) Lipid zattera microarray mostra CTx vincolante alle particelle di lipidi zattera. (C) Lipid zattera microarray esposto a fluorescenza streptavidina-ficoeritrina (SAPE) che mostra poco o nessun legame non specifico. Adattato da riferimento 21 ed utilizzati con il permesso della American Chemical Soc.iety.

Figura 7
Figura 7. Array multicomponente formate dalla consegna microfluidica della mielina e delle membrane neuronali zattera. (A) immagine di fluorescenza dopo mielina e zattere furono depositate attraverso canali microfluidici sul substrato microarray. Le strisce sinistro e destro contengono mielina e la striscia centrale contiene membrane neuronali zattera. Le membrane sono colorate con FM1-43, che le etichette tutto il materiale lipidico. La barra della scala è di 250 micron. (B) immagine di fluorescenza delle stesse tre strisce dopo l'applicazione del tergipavimento PDMS e incubazione con IgM O4. La barra della scala è di 250 micron. (CE) immagini ingrandite delle tre strisce che dimostrano che IgM O4 lega solo ai microarrays mielina: (c) banda sinistra e (e) della banda destra. Le barre di scala in pannelli ce ne sono 30 micron. Adattato da riferimento 21 ed utilizzati con il permesso della American Chemical Society.

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Discussion

In questo lavoro mostriamo che monodisperse SiO 2 perle rivestite con doppi strati lipidici supportati possono essere disposte in array micropozzetti senza la necessità per il targeting ligandi sulle membrane lipidiche o la superficie del substrato, e le matrici possono essere utilizzati per caratterizzare le interazioni tossina-lipidico. La costante di dissociazione abbiamo calcolato per CTx/GM1 vincolante confronta favorevolmente, data l'ampia disparità di valori in letteratura, con una precedente relazione Inverno et al., Dove l'assemblaggio colloidale di perle lipidiche rivestite è stato utilizzato per calcolare una costante di dissociazione di circa 30 nM. Inserendo i dati al modello di associazione Hill-Waud, abbiamo determinato che l'interazione CTx/GM1 è probabile polivalente, che concorda con le precedenti relazioni 28. La subunità B (binding ganglioside) di CTx esiste come pentamero, con ciascuna delle cinque unità in grado di legare una molecola GM1 29; quindi, non è sorprendente che più di una subunità può essere vincolata data la diffmobilità usive di GM1 in SLB 30.

Matrici di perline chimicamente funzionalizzati sono stati utilizzati in altri studi analitici 31. In questi tipi di esperimenti, perline sono tipicamente immobilizzate in pozzetti creati alla fine delle fibre ottiche incisi. Saggi fluorescenza multiplex possono essere eseguite in questa configurazione mescolando sottopopolazioni di perline e immobilizzare contemporaneamente sulla estremità della fibra ottica 32. Nel nostro test multiplex (figure 3c-3e), abbiamo immobilizzato SSLBs otticamente codificati in sequenza perché lipidi su SSLBs gratuiti a soluzione potrebbero essere trasferiti da un tipo di SSLB ad un altro 33. Mentre questo si aggiunge passaggi aggiuntivi per la preparazione di matrici SSLB, ma non troppo tempo ed è l'approccio più efficiente per perline lipidi funzionalizzati. Abbiamo anche spazialmente codificata array depositando diverse popolazioni SSLB in array di pozzetti adiacenti, e non c'è cros osservabiles-talk tra gli array 20. Per ridurre i tempi di preparazione del campione, gli array SSLB possono essere preparati in anticipo e utilizzate quando lo desideri. Abbiamo testato la stabilità di matrici nel corso di una settimana e abbiamo trovato alcuna degradazione significativa delle matrici in termini di intensità di fluorescenza, che indica che la quantità di materiale lipidico sulla SSLBs non cambia con il tempo. Inoltre, l'occupazione matrice non cambia nel corso del tempo, il che suggerisce che una volta SSLBs sono immobilizzati, non si staccano dai pozzetti (Fig. 4b).

Oltre alle perle rivestite con doppi strati lipidici sintetici, abbiamo usato anche questo metodo per creare array di particelle di membrana naturali 21. In questo lavoro, abbiamo immobilizzato particelle mielina derivati ​​da cervello di topo e particelle membrana neuronale, come la frazione lipidica-zattera. Siamo stati in grado di utilizzare le matrici per identificare molecole di superficie della membrana cellula-specifici da anticorpi binding (figure 6 e 7). Inoltre, quando la dimensione dei micropozzetti è stata ridotta alla nanoscala e la superficie superiore della matrice è stata rivestita con oro, siamo stati in grado di impiegare risonanza plasmonica di superficie per monitorare il legame degli anticorpi a particelle di membrana mielina senza l'uso di etichette fluorescenti. La principale differenza tra l'utilizzo SSLB e vescicole o particelle di membrana naturali per formare matrici è che nel caso di SSLBs l'esatta quantità di materiale di membrana in ciascun pozzetto è noto perché solo una singola goccia può adattarsi in ogni pozzetto. Con vescicole o particelle di membrana naturali, non c'è modo per controllare la quantità di materiale in ciascun pozzetto, diverso per regolare la concentrazione iniziale di vescicole o particelle. Tuttavia, la variabilità benestante ben del numero di vescicole non è molto grande rispetto alla distribuzione dei diametri delle vescicole 21.

Infine, questo metodo può avere divERSE applicazioni future. Junesch e collaboratori hanno impiegato una spatola per rimuovere le nanoparticelle durante colloidale litografia nanofabbricazione 34. Array di membrana potrebbero essere formati per imitare i contatti cellula-cellula per indagare cellulare adesione focale 35 o esaminare il legame di membrana-curvatura sensing proteine ​​36. Inoltre, l'uso di perline porose faciliterebbe l'inclusione di proteine ​​transmembrana nei bistrati lipidici 37 o consegna locale del carico immagazzinato a cellule coltivate su un substrato di matrice biomembrane. La piattaforma micropozzetti è fabbricato mediante fotolitografia, che consente flessibilità di progettazione. Qui i nostri array avevano geometria esagonale, ma quadrata, lineare, o altre geometrie potrebbero essere creati con diverse serie di periodicità e di pozzetti dimensioni per studiare gli effetti spaziali di adesione focale.

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Disclosures

Gli autori non hanno concorrenti interessi finanziari da dichiarare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a SHO dal National Institutes of Health (R01 GM092993), la National Science Foundation (NSF CARRIERA Award e DBI 0.964.216), l'Office of Naval Research (ONR) Giovane Programma Investigator Award e il Minnesota Partnership for Biotechnology e genomica medica. Fabbricazione del dispositivo è stata eseguita presso l'Università del Minnesota Nanofabbricazione Center (NFC), che riceve il sostegno della NSF attraverso l'infrastruttura di rete National Nanotechnology. Questo lavoro è stato supportato anche da sovvenzioni di MR dal National Institutes of Health (NS048357, R21 NS073684), la National Multiple Sclerosis Society (CA1060A11), la Applebaum, Hilton, Peterson e Sanford Fondazioni e la famiglia McNeilus. Gli autori desiderano ringraziare Hyungsoon Im per l'assistenza con illustrazioni e Shailabh Kumar per l'assistenza con il microscopio elettronico a scansione.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4 inch silicon wafers University Wafer 425
Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist MicroChem SPR955-CM
Shipley MICROPOSIT CD-26 developer MicroChem CD-26
i-line stepper Canon 2500 i3 stepper
Vision 320 reactive ion etcher Advanced Vacuum Vision 320 RIE
Deep trench reactive ion etcher Plasma Therm SLR-770
Atomic layer depostion system Cambridge NanoTech Savannah
Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Egg phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids 840051C
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt Avanti Polar Lipids 810158C
Monosialoganglioside GM1 Avanti Polar Lipids 860065P
Silica beads Bangs Laboratories SS03N/4666 Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter.
Cholera toxin B-subunit, Alexa 488-conjugate Molecular Probes C-34775
Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate R&D Systems NL1326R
FM1-43 Molecular Probes T-3136
Eppendorf MiniSpin centrifuge Fisher Scientific 05-401-09

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References

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