Summary
サポートされている脂質二重層と天然膜粒子は、細胞膜の特性を近似することができると分析種々の戦略に組み込むことが好都合システムである。ここでは、サポートされている脂質二分子膜でコーティングされたSiO 2ビーズ、リン脂質小胞または天然の膜粒子からなるマイクロアレイを調製するための方法を実証する。
Abstract
脂質二分子膜は、細胞の原形質膜を形成し、細胞内オルガネラの境界を画定する。自然界では、これらの膜は、脂質の多くの種類の不均質混合物である膜結合タンパク質を含んでおり、糖質が飾られています。いくつかの実験では、天然のものから、膜の脂質二重層の生物物理学的又は生化学的特性を分離することが望ましい。そのような場合には、このような巨大ベシクル、リポソームまたはサポートされている脂質二重層（のSLB）などのモデルシステムの使用を求める。のSLBのアレイは、アプリケーションを検出し、細胞 - 細胞相互作用を模倣するために特に魅力的である。ここでは、SLBアレイを形成するための新たな方法を説明します。サブミクロン径のSiO 2ビーズが第1の球面のSLB（SSLBs）を形成する脂質二重層で被覆されている。次いで、ビーズを微細加工サブミクロン径のマイクロウェルのアレイに堆積される。別れるながら調製技術は、基板表面を洗浄するために「スキージ」を使用しマイクロウェルに落ち着いてきSSLBsの後ろグラム。この方法は、マイクロウェル基板のない化学修飾、またSSLB上の任意の特定の標的化リガンドを必要としません。ウェルの直径は、ビーズの直径よりもわずか大きくなるようにチューニングされているので、マイクロウェルは単一のビーズによって占有されている。残りは空のままで一般的には、井戸のより多くの75％は、占有されている。緩衝液中でSSLBアレイは、より大きな一週間の長期安定性を示す。我々は、ガングリオシドGM1とコレラ毒素の相互作用を特徴付けることによって実証する、SSLBs複数種類のシリアル堆積によって単一のアレイに配置することができ、およびアレイは、感知のために使用することができる。我々はまた、細胞源からビーズ支持体と生体膜なしのリン脂質小胞は、同じ方法で配列することができ、細胞特異的膜脂質を同定することができることを示している。
Introduction
脂質二重膜は、本質的に必須の構造である。携帯形質膜や細胞小器官の膜は、生活のために必要である分子の数を組み込んだ脂質二重層で構成されています。多くの生命維持プロセスは、細胞の表面に発生するか、脂質二重膜と結合する分子によって媒介される。実際には、多くの医薬品対象プロセスまたは分子は、1,2または膜上に見出される。これは、分析的に、膜表面で起こる化学反応または非共有結合事象のようなプロセスを調査することが必要である。天然の膜は、単離することが困難および/またはセンサとのインタフェースとすることができるので、多くの研究者が分析研究を実施するために簡略化されたモデル膜を用いる。モデル膜システムの数は、数十ナノスケール寸法を有するリポソーム3,4に直径数百ミクロンにすることができる巨大な小胞に至るまで、文献に記載されている。 ALTERNatively、固体支持体上に堆積された平面脂質二重層は、 すなわち 、異なる表面の数に形成することができ、広く、生物物理学的、生化学的、および分析アプリケーション5で使用されているが、脂質二重層（のSLB）を支持した。電気的または光学材料でのSLBとを連結すると、さまざまな分析技術を利用して膜生化学および生物物理学の研究を可能にします。蛍光顕微鏡6、7電気化学、光学分光8、走査型プローブ顕微鏡法9、表面プラズモン共鳴10、および質量分析11は、すべてのSLBの構造と特性を研究するために使用されてきた。
SLBアレイは多重アッセイ12,13のためのセンサーの設計に追加の汎用性を提供します。他のアプリケーションは、免疫細胞14の間に形成される接合を模倣するために、SLBアレイを使用しています。 SLBアレイの製造方法は、microfluから変化しているIDICは、隣接のSLBパッチ間の物理的な障壁を用いるものと15に近づく。16他のグループが印刷方法17を使用していた、光化学パターニング18と、様々なナノエンジニアリングは、SLBアレイを作成するために19に近づく 。
本論文では、添付のビデオでは、マイクロウェル20の順序付き配列にSLBでコーティングされたSiO 2ビーズを堆積させることにより、SLBアレイを形成する方法を示しています。私たちは、球状の支持された脂質二重層（SSLBs）などのSLBでコーティングされたSiO 2ビーズを参照してください。この技術は、我々はまた、例の結果を示し、そこから自然発生源21に由来リン脂質小胞と生体膜の配列を作成した初期の研究の延長である。生体粒子または小胞を配列するための他の方法は、小胞の表面上に含まれる相補的なリガンドと会合する表面上の特定の標的化リガンドのパターンに頼ってきた。例としては、ビオチンを含んでアビジン会合22,23及びDNAハイブリダイゼーションスキーム24。我々のアプローチは、必要のない標的化または認識部分を有するマイクロウェルアレイを必要とします。 SSLBsのサイズは、低多分散性を持ったSiO 2ビーズ支持体の直径によって定義されます。 SSLBの直径よりも大きいだけに、マイクロウェルの直径を調整することによって、単一SSLBは、各マイクロウェルに落ち着く。ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）スキージはその後、表面からマイクロウェル中に固定化されていないすべてのSSLBsが削除されます。得られたSSLBマイクロウェルアレイは、3μmの中心間間隔および六角形の周期性を有する高密度（〜10 5 SSLBs個/ mm 2）を有する。直列異なる脂質組成物でSSLBsを堆積させることによって、それがランダムに配置SSLBsを有する多成分アレイを作成することができる。 SSLBアレイの感知能力を実証するために、我々はSSLBsに組み込まガングリオシド（GM1）でコレラ毒素（CTX）の相互作用を用いる。とともに天然の膜粒子は、我々は2つの異なる種類の細胞からの膜材料を含む多成分アレイにおいて、細胞特異的脂質を検出することができた。
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Protocol
マイクロウェルアレイ基板の1。微細加工
- 熱成長酸化物を100nmで4インチシリコンウエハで始まる。
- 30秒間、4,000 rpmで、ウェハ上に、SPR-955 0.7フォトレジストをスピン。
- 90秒間115℃のホットプレート上で焼く。
- フォトレジストを露光。
- アレイが2ミリメートル×2ミリメートルの領域をカバーして3ミクロン周期の六角形のアレイ状に配置された1ミクロンの穴が作成されたマスクを使用してください。
- 6mmのステップサイズは200ミリジュール/ cm 2の露光を用いて、i線ステッパーでウエハを露光する。
- 90秒間115℃のホットプレート上で焼く。
- 90秒の総開発時間のために、ウェーハ上のCD-26の2水たまりを堆積させるためにスピンデベロッパを使用して開発しています。
- 超純DI水で十分に洗い流し、N 2で乾燥させます。
- Arを50 SCCM、CF 4の25 SCCM、及びCHF 3 FLOの50 SCCMで6分間反応性イオンエッチング装置、酸化物をエッチングする75トルの圧力で翼。
- C 4 F 8、SF 6、Arを40 SCCM、および14トルの圧力で流れるO 2の10 SCCMの27 SCCMの63 SCCMで2分間のICPディープトレンチ反応性イオンエッチング装置でシリコンをエッチング。
- レジストを除去するためにアセトン、メタノール、およびイソプロパノールですすぐ。
- H 2の浴の代わりSO 4：表面を洗浄するための10分間のH 2 O 2 1:1である。
- 超純DI水で十分に洗い流し、N 2で乾燥させます。
- 250℃での原子層堆積によって堆積物の Al 2 O 3の1080オングストローム
2ポリの製造（ジメチルシロキサン）スキージ
- 可能な場合は、クリーンルームで働いています。そうでなければ可能な最もクリーンな環境で動作します。
- ≥13ミリメートルの両側にプラスチック製のペトリ皿（またはその他のクリーン使い捨て容器）を取得します。
- その皿の中で、50グラムのPDMSのBASが続き、5グラムのPDMS硬化剤を注ぐEエージェント（またはほとんどペトリ皿を記入します1:10の比で何か）。使い捨てのプラスチックピペットや棒でよく混ぜる。
- 気泡が混合物（約30分）から出てくるまで、真空を適用し、真空ラインでチャンバ内で混合さPDMSを配置することにより気泡を除去。
- ペトリ皿に既にされていない場合、気泡の生成を回避し、ペトリ皿中のPDMSを注ぐ。
- 50℃（短い時間のために高い熱も動作します）>ホットプレート上で一晩硬化する。
- 新しい/クリーンかみそりの刃で、慎重に、可能な限りクリーンな上面を保ち、矩形片約2.5×2.5センチカット。清潔なピンセットを用いてはがします。 （これはスキージ工程で使用されるエッジになります）できるだけ鋭い上端を作るために、一つの動きにカミソリの刃を押し下げて、1辺（1.5センチダウン）を切り落とす。
- 次いで、アセトン、メタノール、イソプロピルアルコール、超純DI水できれいにし、クリーンな窒素ガスでブロー乾燥した。きれいなペトリ皿に保管してください。
小胞の3。準備
- 25 mg / mlの卵ホスファチジルコリン（PC）の脂質ストック溶液を収集し、1 mg / mlの1,2 -ジパルミトイル-sn-グリセロ-3 -ホスホエタノールアミン-N - （リサミンローダミンBスルホニル）アンモニウム塩（Rho-イソDPPE）をクロロホルムクロロホルム/メタノール中のモノシアロガングリオシドGM1の0.5 mg / mlのストック溶液（2:1 v / v）であった。
- 小さなガラスバイアル中の25 mg / mlのPCの18.9μlの、0.5ミリグラムの39.6μlの/ mlのGM1との7.9μLを添加することによって97モル％のPCに、2モル％GM1及び1モル％のRho-DPPE結果混合物を作る1ミリグラム/ガラスシリンジを使用してミリリットルのRho-DPPE。
- 注：Nairさんら 25の補足材料は、任意の所望の組成のベシクルを作成するために必要な脂質の量を算出するための優れたカスタマイズ可能なExcelスプレッドシートが含まれています。
- 真空デシケーター中でバイアルを置き、6時間真空下でバイアルを残すことによって溶媒を除去する。
- 0.1の水溶液を作るのNaCl。乾燥した脂質フィルムを含むバイアルに、0.1M NaCl溶液0.5ミリリットルを追加します。
- 水性の脂質混合物を一晩休ませることができます。
- 室温でのバスソニケーターで20分間超音波処理して、小胞体分散液を作成するために簡単に説明すると渦ミックス。
- 100 nmの細孔サイズを有するポリカーボネート膜を介して小胞懸濁液を押し出す。フィルタ17Xによってベシクル懸濁液を渡します。
- 4℃でガラスバイアル中で押し出された小胞を保存
球面支持された脂質二重層から4。の形成
- 700 nmの直径のSiO 2ビーズを収集します。ビーズは、1.4×10 11ビーズ/ mlのストック濃度で蒸留水に供給される。
- 1.5mlのエッペンドルフチューブ中の0.1 M NaClを893μlのビーズストック溶液の107μLを添加することによって1.5×10 10個のビーズ/ mlの濃度の1mlのビーズ懸濁液を調製する。
- それがよくマイルであることを保証するために、サスペンションをボルテックスXED。
- 遠心分離器20分間1700×gで懸濁液を次いで、上清を捨てる。 0.1 MのNaCl 1ml中にビーズを再懸濁する。徹底的にビーズを洗浄するためにさらに2回、この手順を繰り返します。
- SSLBsを形成するために、1.5mlのエッペンドルフチューブに1 mg / mlの小胞懸濁液200μlをSiO 2ビーズ懸濁液25μlを加える。ボルテックス混合し、室温で1時間放置してみましょう。この段階でSSLB濃度が1.7×10 9 SSLBs / mlである必要があります。
- SSLBsをペレット20分間1700×gで遠心します。ペレットは、ビーズ上のRho-DPPEとの小胞の破裂をピンク色に表示されます。
- 225μlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH値= 7.4での上清と再懸濁を捨てる。繰り返しますSSLB懸濁液から任意の未破裂小胞を除去するために4.6から4.7をさらに2回繰り返します。
5。総会SSLBの配列
- 4-6 MICとの長方形片に生じたマイクロウェルアレイのクリーブウエハ一枚あたりのローウェル·アレイ。
- 渦がSSLBサスペンションを混ぜ、その後、各マイクロウェルアレイ上SSLB懸濁液10μlを置く。残りのないよう、1時間SSLBsを表面に安定するようにします。
- 優しく浅い皿に用意し、PBS浴に沈めた後、洗浄瓶からPBSでマイクロウェルアレイチップを洗う。
- 水没しながら、ゆっくりとマイクロウェルアレイチップのPDMスキージフラッシュを置き、ゆっくりとマイクロウェル中に固定化されていないSSLBsを削除するために、表面5Xに沿ってスライドさせます。
- 余分SSLBsを削除するために、PBS浴にグリップピンセットでマイクロウェルアレイチップ、ゆっくり振る。
- すぐにスキージ浴からチップを取り外し、さらに使用するまで新しいPBS浴に配置します。チップの上面がSSLBsを保存する濡れたままにしてください。
注：上述の組立方法は、天然の膜粒子のアレイを作成するために使用できる、ミエリンマウス脳から単離された粒子、またはフォーのようなSiO 2のビーズがサポートなしでspholipid小胞。この作業は、ウィッテンら 21及び代表的な結果を以下に示すに詳細に記載されている。
6。コレラ毒素結合アッセイ
- PBS中のウシ血清アルブミン（BSA）の2 mg / mlの溶液を調製する。
- 2 mg / mlのBSAを含むPBS中でアレクサ488コンジュゲートコレラ毒素Bサブユニットの所望の濃度の溶液を調製する。
- PBS浴からSSLBアレイチップを取り外し、拭いて、実験室を使用して、PBS溶液のほとんどを吸い取る。 SSLBアレイが水和し維持するために、チップ上だけで十分なのPBSを残す。
- 非特異的結合を防ぐために、SSLBアレイチップに2 mg / mlのBSA溶液を200μlを加える。湿潤箱中で1時間休ませ。
- マイクロピペットで、SSLBアレイチップの上部から溶液200μlを削除します。
- SSLBアレイチップにコレラ毒素溶液200μlを加え、湿潤箱中で1時間の休憩をしましょう。
- 優しく未結合のコレラ毒素を除去するための洗浄瓶からPBSでSSLBアレイチップを洗う。
- 拭いて研究室を使用して過剰のPBSを吸い取る。 24ミリメートル×40ミリメートルのカバースリップでカバーチップを画像化する前に。
- 関心対象のフルオロフォアのための適切なフィルターセットを用いて正立顕微鏡の画像アレイ。
- ImageJソフトウェアの自動化された粒子解析関数を使用して、アレイ内の個々のSSLBsの蛍光強度を分析する。
- 指定された配列で発見SSLBsの強度をまとめたヒストグラムに個別SSLBsからの平均蛍光強度をコンパイルします。
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Representative Results
SiO 2のビーズは、リン脂質、蛍光脂質およびガングリオシドなどのような他の脂質からなる小胞の溶液と混合すると、図1aに模式的に示すように、小胞は、SSLBsを形成するためにSiO 2をビーズ表面上で破裂。 SSLBsを洗浄した後、SSLB溶液の滴をマイクロウェルアレイ上に配置し、ビーズを表面に沈降させる。 （ 図1B1）これは、 図1b2とに示されているリン脂質小胞または天然の膜粒子の懸濁液を用いても行うことができる。マイクロウェルアレイ基板に吸着したリン脂質小胞の蛍光画像を図1B3に示されている。その後のPDMSスキージは、任意のSSLBs（ 図1C1）、小胞や天然膜粒子マイクロウェルに沈降しなかった（ 図1C2）を除去するために表面をそっとスライドさせる。これは、各々にSSLB配列になりマイクロウェルは、ほとんど1 SSLB（ 図1D1）または複数の小胞や天然膜粒子は、各マイクロウェル（ 図1d2の ）内にある配列に含まれています。蛍光標識された小胞からなるマイクロアレイの画像を図1d3のに示されている。
図1 SSLBsとSSLBアレイアセンブリの形成にSiO 2ビーズ上の脂質の3種類で構成SSLBの（A）イラスト：卵PC（黒）、ロー-DPPE（赤）とGM1（青）。 （B1-D1）マイクロウェルアレイ（B1）上に散在SSLBsを示すSSLB配列の組立のためのプロセスフロー、SSLBsの表面をクリアするのPDMSスキージを使用すると、マイクロウェル（C1）に落ち着いていない、と最終SSLBアレイ（D1 ）。 （B2-D2 （b3）前記（b2）との図に対応するマイクロウェル基板上に吸着されたリン脂質小胞の蛍光画像を表示する。 （d3）前記（d2）の中の図に対応したリン脂質小胞からなるマイクロアレイの蛍光画像である。参考文献20および21から適応し、米国化学会の許可を得て使用。
個々のSiO 2ビーズ、マイクロウェル内のSSLBsは角度のついたトップビューや断面の視点の両方から、走査型電子顕微鏡（SEM）で画像化したためにサポートしています。 図2bは、単一のビーズに固定化された断面図を示している領域の上面図が、約15ミクロン×15ミクロンは、 図2aに示されているマイクロウェル。マイクロウェルをコーティング軽い層は、ウェルは単一のビーズを収容可能となるように調整するために原子層蒸着ウェルの直径によって堆積したAl 2 O 3が100nmである。
図2 SSLBアレイの走査型電子顕微鏡画像。マイクロウェルアレイに固定化SSLBビーズ支持体を示す図15ミリメートル×15mmの領域（a）の電子顕微鏡写真。 （b）は、マイクロウェル内の単一の700 nmの直径SSLB。マイクロウェルコーティングは、個々のビーズの内側にフィットできるように、マイクロウェルを縮小するために堆積されたAl 2 O 3である。参照20から適応し、米国化学会の許可を得て使用。
SSLBアレイが調製されると、それらは蛍光顕微鏡で画像化することができる。
SSLBsの異なる種類の逐次堆積は、個々のSSLBsの同一性毒素受容体（GM1）の有無によって決定され、そのコレラ毒素（CTX）の結合SSLB、複数のタイプのアレイを作成するために使用された。組立工程は、単一のSSLBタイプと同じであったが、異なるSSLB同一性を有する第2時間行った。 SSLBsの出発濃度は、SSLBの第1のタイプの占有率を低減し、より多くの空孔がSSLB第二のタイプによって占有されることを可能にするために10倍低かった。 図3cは-3eに、SSLBs、2種類のSSLBアレイが示されている。アルSSLBsのLは、赤色蛍光のRho-DPPE（ 図3c）が含まれているが、一部だけSSLBsのはGM1、のCTX Bサブユニットの受容体であるガングリオシドが含まれています。緑色蛍光アレクサ488コンジュゲートのCTxにさらされた場合、GM1を含む唯一SSLBsは緑のチャンネル（ 図3d）で蛍光を発する。赤色および緑色の画像がマージされるとき、それはSSLBsがGM1（黄色）を含有しないものではない（赤）（ 図3e）を決定することができる。
図3 SSLBアレイの蛍光イメージング。 （A）936のRho-DPPE-標識卵PCのSSLBsを含む100ミクロン×100ミクロンの領域です。 （B）が占めるマイクロウェルの76％でSSLBを示す明視野および蛍光のオーバーレイ。 （CE）のRho-DPPEが含まれているSSLBsを含むSSLB配列（c）は、の画分ものAlexa-488コンジュゲートのCTx（d）で結合しているGM1を含む。共局在蛍光がSSLB上のGM1の存在を示し、赤と緑のチャンネル（E）合併。青い円は、 すなわち GM1を欠いた、唯一の赤の蛍光を発するSSLBsを示している。参照20から適応し、米国化学会の許可を得て使用。
SSLBアレイからの蛍光データは、画像内の個々のSSLBsの強度を測定することによって分析した。アレイからのSSLB強度データをヒストグラムにまとめた。 図4aは、単に卵PCと1モル％のRho-DPPEを含むSSLBsを主成分SSLBアレイからのRho-DPPE蛍光の分析からのそのようなヒストグラムを示す。 図4aのデータを図3aに画像を解析することにより取得した。我々は、冷蔵時SSLBアレイは少なくとも1週間安定で堅牢であることが見出されNDバッファに沈めた。配列は、任意の蛍光強度を失うことはありませんでした、また、配列の占有率は1週間（ 図4b）の経過とともに変化しなかった。
図4（a）のヒストグラムは、 図3aに示さSSLBアレイの蛍光強度の分布を示す。配列内の各SSLBの平均強度は、ヒストグラムをコンパイルするために使用された。実線はデータにガウシアンフィッティングです。 （b）は、平均占有アレイ（黒丸）及び一週間の経過にわたって監視SSLBアレイの蛍光強度（赤色四角）。参照20から適応し、米国化学会の許可を得て使用。
私たちは、GM1（0、0.5、1の様々な濃度でSSLBs成る配列を作ったND 2モル％）と固定のCTX濃度だけでなく、GM1の濃度SSLBsを持つ配列にそれらを露出してのCTX様々な濃度にそれらを暴露した。後述の実験をGM1/CTx結合についての平衡解離定数（Kd）を決定するために使用した。変化するGM1濃度SSLBアレイを洗浄し、画像化され、1時間、50 nMでのAlexa-488標識のCTxに曝露した。強度は0.5でSSLBアレイのヒストグラム- 50 nMのアレクサ488コンジュゲートのCTxに曝さ2モル％GM1は、 図5aに見ることができる図5bは、GM1濃度に平均蛍光強度の線形依存性を示す図である。 SSLBs中のGM1の濃度が2モル％に固定され、SSLBアレイは16 pMでから158 nMの範囲のCTxに暴露されると、図5cに示すように、結合応答は、シグモイド曲線に従う。ラングミュア等温線（式1）及びヒル·Waudモード：このデータに適合曲線は2種の異なる結合モデルに基づいているL（式2）。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
（1）
（2）
Fは、所与のCTx濃度での蛍光強度で結合が飽和しているときに、F maxは蛍光強度であり、【のCTxが】のCTx濃度であり、それぞれ、K DおよびK Hは、ラングミュアからの解離定数であり、ヒル·Waudが収まる、nはヒルWaudモデルにおける協同性係数である。協同性係数（n）はnよりも大きい多価結合の量を推定する一つのCTx各分子は複数のGM1に結合することを示している。 0.5×F maxでのCTX濃度がGM1/CTx相互作用のK DまたはK hである。我々の実験では、協同的結合を示す、1.3のn値で1.4±0.2 nMで1.6±0.2 nMであり、K、HのK Dを計算した。 GM1/CTx相互作用の解離定数は370 nMの26,27に4.5時から大きさの5分以上お買い上げの範囲で、文献で 大きく異なります。
図5。CTx/GM1はSSLBアレイ上の結合アッセイ。 （a）は、SSLBアレイ内の個々のSSLBsの蛍光強度のヒストグラム。 0.5アレイは、1又は2モル％GM1でSSLBsを含有し、50 nMのアレクサ488コンジュゲートのCTxに曝露した。ザ·実線はガウスフィットである。 （b）の分布のプロットGM1濃度の関数としての（a）からを意味する。 （C）分布を示す結合曲線は、158 nMの16時から変化アレクサ-488-結合のCTxに暴露した後、2モル％GM1とSSLBsを含むアレイからを意味します。行は、ラングミュア等温線（赤）とヒル - Waud（青）結合モデルにフィットです。 （BC）中のエラーバーは各データポイントに対応する蛍光強度の分布の標準偏差を表す。参照20から適応し、米国化学会の許可を得て使用。
先に述べたように、天然の供給源21に由来する生体材料でアレイを形成することも可能である。マイクアレイは、膜の粒子を残すためのスキージで上面を洗浄、次いで、マイクロウェル基板上の膜粒子を分散させ、同じように形成されているrowells。 図6は、ミエリン及び神経脂質ラフトマイクロアレイの例を示します。 図6aにおいて、ミエリン粒子は、親油性フルオロフォアFM1-43で標識される。脂質ラフトは、コレステロールなどGM1ガングリオシドに富んでいることが知られている。 図6bに示すように、蛍光標識されたストレプトアビジン（SAPE）は、配列に結合しないつつ、アレクサ488コンジュゲートのCtx、脂質ラフトマイクロアレイに強く結合。 （ 図6C）我々はまた、250ミクロン幅のチャネルを有するマイクロ流体チップを搭載したマイクロ基板にミエリンと脂質ラフトの粒子を提供することで、ストライプ配列を作成しました。粒子デリバリーの後、マイクロ流体チップは、マイクロウェル基板といつものように実施し、スキージのプロセスから分離されました。ストライプアレイは、次いで、ミエリンに見られるスルファチドに結合する蛍光性の抗オリゴデンドロIgM抗体（IgM抗体O4）に曝露した。 （ 図7）、ミエリンと脂質ラフトストライプマイクロアレイ図7は、複数の倍率の増加のレベルで示され、倍率の最高レベルでは、スルファチドは、脂質ラフトに存在しないので、IgMのO4のみミエリンマイクロアレイに結合することが容易に明らかであるている。
図6。ミエリン粒子と神経細胞の脂質ラフト粒子の配列。ミエリン粒子は親油性の蛍光団FM1-43による蛍光をレンダリングされます（A）ミエリン粒子マイクロアレイ。破線は、アレイ領域のエッジを示している。 （b）は、脂質ラフト粒子に結合のCTxを示す脂質ラフトマイクロアレイを。 （C）脂質ラフトマイクロアレイはなし非特異的結合がほとんどを示す蛍光ストレプトアビジン-フィコエリスリン（SAPE）に暴露した。参照21から適応し、米国化学学会の許可を得て使用iety。
図7。ミエリン及び神経ラフト膜のマイクロ流体送達によって形成された多成分の配列。 （a）は、ミエリンおよびラフト後の蛍光画像は、マイクロアレイ基板上のマイクロ流体チャネルを介して堆積された。左右のストライプは、ミエリンが含まれており、中央のストライプは、神経細胞のラフト膜が含まれています。膜は、FM1-43は、すべての脂質物質を標識で染色する。スケールバーは250μmである。 （b）は PDMSのスキージを印加O4およびIgMと共にインキュベートした後、同じ3つのストライプの蛍光画像を表示する。スケールバーは250μmである。 （CE）のIgM O4のみミエリンマイクロアレイに結合することを示した3つのストライプからの拡大画像：（C）左のストライプと、（E）、右ストライプ。 P中のスケールバーanels CEは30μmである。参照21から適応し、米国化学会の許可を得て使用。
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Discussion
本研究では、支持された脂質二分子層で被覆された単分散SiO 2のビーズは、脂質二重層または基板表面にリガンドを標的化するための必要なしにマイクロウェルアレイに配列することができ、アレイは、毒素-脂質相互作用を特徴づけるために使用することができることを示している。我々はCTx/GM1結合に計算された解離定数は冬らの以前の報告。、脂質でコーティングしたビーズのコロイドアセンブリは約の解離定数を計算するために使用したと、文学の中の値の広い格差を考えると、好意的に比較30 nMの。ヒルWaud結合モデルにデータを適合することにより、我々はCTx/GM1相互作用はこれまでの報告28と一致している可能性が高い多価であることを決定した。のCTX B（ガングリオシド結合）サブユニットは、GM1分子29を結合することができる5つのユニットのそれぞれと、五量体として存在する。従って、それは所与の差分、複数のサブユニットが結合されてもよいことは驚くべきことではないのSLB 30におけるGM1のusiveモビリティ。
化学的に機能ビーズの配列は、他の分析研究31で使用されてきた。これらのタイプの実験では、ビーズは、典型的には、エッチングされた光ファイバの端部で作成したマイクロウェル中に固定化される。多重蛍光アッセイは、ビーズの亜集団を混合し、光ファイバ32の端部に、それらを同時に固定化することによって、この構成で行うことができる。溶液中の遊離SSLBs上の脂質が他の33にSSLBの1種類から転送される可能性があるため、当社のマルチプレックスアッセイ（ 図3C-3E）で、私たちは順番に、光学的にエンコードされたSSLBsを固定化した。これはSSLBアレイの製造における余分なステップが追加されますが、それはしない、過度に時間がかかり、脂質官能化ビーズのための最も効率的なアプローチである。また、空間的に隣接するマイクロウェルアレイ内の異なるSSLB集団を堆積させることによって配列をコードしており、観察可能なCROはない配列20の間にSトーク。試料調製時間を低減するために、SSLBアレイは、予め調製し、所望の場合に使用することができる。我々は、一週間にわたってアレイの安定性を試験しSSLBs上の脂質物質の量は経時的に変化しないことを示す蛍光強度の点で配列の有意な低下は認められなかった。また、アレイの占有率はSSLBsが固定化されると、それらはマイクロウェル（ 図4b）から剥離しないことが示唆され、経時的に変化しない。
合成脂質二重層でコーティングしたビーズに加えて、我々はまた、天然膜粒子21の配列を作成するには、このメソッドを使用している。その研究では、マウス脳由来のミエリン粒子だけでなく、脂質ラフト画分として、神経膜粒子を固定化した。我々は、抗体ビンディによって細胞特異的膜表面分子を同定するために配列を使用することができたngの（ 図6および7）。さらに、マイクロウェルのサイズは、アレイのナノスケールの上面に減少したときには、金でコーティングした、我々は、蛍光標識を使用することなく、ミエリン膜粒子への抗体の結合を監視するために表面プラズモン共鳴を使用することができた。アレイを形成するSSLB小胞または天然の膜粒子を使用しての主な違いは、単一のビーズを各ウェルに収まるのでSSLBsの場合、各マイクロウェル内の膜材料の正確な量が既知であることである。小胞または天然の膜粒子と、ベシクルまたは粒子の出発濃度を調整する以外に、各マイクロウェル内の材料の量を制御する方法はない。しかし、小胞の数のウェル間の変動性は、小胞の直径21の分布に比べて非常に大きくはない。
最後に、このメソッドは、DIVを持つことができます将来のアプリケーションをERSE。 Juneschらは、コロイドリソグラフィーナノ加工34中にナノ粒子を除去するため、スキージを採用しています。膜アレイは、細胞接着斑35を調査または膜湾曲感知タンパク質36の結合を調べるために、細胞-細胞接触を模倣するように形成することができる。また、多孔質ビーズの使用は、脂質二重層37又は生体膜アレイ基板上に培養した細胞に記憶されたカーゴの局所送達に貫通タンパク質の包含を容易にするであろう。マイクロウェルプラットフォームは、設計の柔軟性を可能にするフォトリソグラフィによって作製される。ここに私たちの配列は、六角形の幾何学を持っていたが、正方形、直線的、または他の形状は、接着斑の空間的影響を調査するために、アレイの周期性とマイクロウェルの寸法を変更することで作成することができた。
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Disclosures
著者らは、開示することなく、競合する金融利害関係はありません。
Acknowledgments
この作品は、国立衛生研究所（R01 GM092993）からSHOの補助金によって支えられて、全米科学財団（NSFキャリア賞、DBI 0964216）、米海軍研究局（ONR）若手研究プログラムとバイオテクノロジーのためのミネソタパートナーシップ賞医療ゲノミクス。デバイス製造は、国家ナノテクノロジー基盤ネットワークを介してNSFの支援を受けてミネソタ大学のナノファブリケーションセンター（NFC）、で行った。この作品はまた、国立衛生研究所（NS048357、R 21 NS073684）、国立多発性硬化症協会（CA1060A11）、アップルバウム、ヒルトン、ピーターソンとフォード財団やMCNEILUSファミリーからMRに補助金によって支えられている。著者らは、走査型電子顕微鏡の支援のためのイラストやShailabhクマーの支援についてはHyungsoonイムに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 inch silicon wafers | University Wafer | 425 | |
| Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist | MicroChem | SPR955-CM | |
| Shipley MICROPOSIT CD-26 developer | MicroChem | CD-26 | |
| i-line stepper | Canon | 2500 i3 stepper | |
| Vision 320 reactive ion etcher | Advanced Vacuum | Vision 320 RIE | |
| Deep trench reactive ion etcher | Plasma Therm | SLR-770 | |
| Atomic layer depostion system | Cambridge NanoTech | Savannah | |
| Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Egg phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt | Avanti Polar Lipids | 810158C | |
| Monosialoganglioside GM1 | Avanti Polar Lipids | 860065P | |
| Silica beads | Bangs Laboratories | SS03N/4666 | Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter. |
| Cholera toxin B-subunit, Alexa 488-conjugate | Molecular Probes | C-34775 | |
| Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate | R&D Systems | NL1326R | |
| FM1-43 | Molecular Probes | T-3136 | |
| Eppendorf MiniSpin centrifuge | Fisher Scientific | 05-401-09 |
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