Summary
지원되는 지질 이중층과 천연 막 입자는 세포막의 특성을 근사 할 수 있고 분석 다양한 전략에 통합 될 편리한 시스템이다. 여기에서 우리는 지원 지질 이중층 코팅 된 SiO2로 비즈, 인지질 막 소포 또는 천연 입자로 구성된 마이크로 어레이를 제조하는 방법을 보여준다.
Abstract
지질 이중층 막은 세포의 원형질막을 형성 및 세포 내 소기관의 경계를 정의한다. 자연 속에서, 이러한 세포막은 지질의 많은 종류의 이종 혼합물이다 막 결합 단백질을 포함하고 탄수화물로 장식되어 있습니다. 일부 실험에서, 천연 막과는 지질 이중층의 생물 리 학적 또는 생화학 적 성질을 분리하는 것이 바람직하다. 이러한 경우에는 거 소포, 리포좀 또는지지 지질 이중층 (SLB 수)와 같은 모델 시스템의 사용을 요구한다. SLB 수의 배열은 응용 프로그램을 감지하고 세포 - 세포 상호 작용을 모방 특히 매력적이다. 여기에서 우리는 SLB 배열을 형성하는 새로운 방법을 설명합니다. 서브 마이크론 직경의 SiO2 구슬 먼저 구형 SLB 수 (SSLBs)를 형성하는 지질 이중 막으로 코팅되어 있습니다. 비즈는 다음의 마이크로 제조 서브 마이크론 직경의 마이크로 웰의 배열로 입금됩니다. 갈려하면서 제조 기술은, 기판 표면을 청소하기 위해 "스퀴즈"를 사용마이크로 웰에 정착 SSLBs 뒤에 g. 이 방법은 마이크로 웰 기판의 화학적 인 수정이나 SSLB에 특정 표적 리간드가 필요하지 않습니다. 잘 직경이 비드 직경보다 그냥 크게 조정되어 있기 때문에 마이크로 웰은 작은 구슬에 의해 점유되어 있습니다. 나머지는 비어있을 동안 일반적으로 우물의 더 많은 최대 75 %를 점유하고 있습니다. 버퍼 SSLB 어레이보다 일주의 장기 안정성을 표시. 우리는 강글 리오 시드 GM1와 콜레라 독소의 상호 작용을 특성화하여 보여 이는 SSLBs 여러 종류의 시리얼 증착에 의해 하나의 어레이에 배치 될 수 있으며, 어레이는 감지를 위해 사용될 수있다. 우리는 또한 셀룰러 소스로부터 비드 지지체 및 생체막없이 인지질 소체는 동일한 방법으로 배열 될 수 있고, 셀 고유 막 지질은 식별 될 수 있음을 보여준다.
Introduction
지질 이중층 막 자연에 필수적인 구조입니다. 셀룰러 원형질막 및 소기관 막은 생활에 필요한 분자의 수를 반영 지질 이중층으로 구성되어있다. 많은 생명 유지 과정은 세포의 표면에 발생하거나 지질 이중층의 세포막과 관련된 분자에 의해 매개된다. 사실, 많은 제약 대상 프로세스 또는 분자는 1,2 또는 세포막에서 발견된다. 그것은 해석 등의 막 표면에 발생하는 화학 반응 또는 비공유 결합 이벤트와 같은 프로세스를 조사 할 필요가있다. 천연 막은 센서 분리 및 / 또는 인터페이스하기 어려울 수 있기 때문에, 많은 연구자들은 분석적 연구를 수행하기 위해 단순화 된 모델 막을 이용한다. 모델 멤브레인 시스템의 수는 나노 크기 3,4와 리포좀 직경 미크론의 수백 수만 할 수 있습니다 거대한 소포에 이르기까지 문헌에 설명되어 있습니다. Alternatively, 고체 지지체 상에 증착 평면 지질 이중층, 즉, 지질 이중층 (SLB 수)이 다른면의 개수에 형성 될 수 있고, 광범위하게, 생물 리 학적 생화학 및 분석 애플리케이션 (5)에 사용 된 지원. 전기 또는 광학 재료와 SLB 수 커플 링은 서로 다른 분석 기술의 사용을 통해 막 생화학 및 생물 물리학의 조사를 가능하게한다. 형광 현미경 (6), 전기 화학 7, 광학 분광 8, 주사 탐침 현미경 9, 표면 플라즈몬 공명 (10)와 질량 분석기 (11)는 모든 SLB 수의 구조와 특성을 연구하기 위해 사용되어왔다.
SLB 배열은 다중 분석 (12, 13)에 대한 센서의 설계에 추가 기능성을 제공합니다. 다른 응용 프로그램은 면역 세포 (14) 사이에 형성하는 접합을 모방하는 SLB 배열을 사용합니다. SLB 배열을위한 준비 방법은 microflu에서 변화 한IDIC 인접 SLB 패치 사이의 물리적 장벽을 사용하는 사람들에게 (15)에 접근한다. 16 다른 그룹은 인쇄 방법 17을 사용하고, 광 화학적 패턴 (18) 및 다양한 나노 공학은 SLB의 배열을 만들 수 (19)에 접근한다.
이 논문 및 첨부 된 영상에서 우리는 마이크로 웰 (20)의 정렬 된 어레이로 SLB-SiO2로 코팅 된 비드를 증착함으로써 SLB 어레이를 형성하는 방법을 보여준다. 우리는 구형 지원 지질 이중층 (SSLBs)로 SLB-코팅 그런가 2 구슬을 참조하십시오. 이 기술은 우리는 또한 예를 들어 결과를 보여되는 천연 자원 21에서 파생 된 인지질 소포 및 생체막의 배열을 생성 이전 작업의 연장이다. 생체막 입자 또는 소포를으로 배열하는 다른 방법은 소포 표면에 포함 된 보완 리간드와 연관 표면에 특정 표적 리간드의 패턴에 의존하고있다. 예 비오틴을 포함아비딘 협회 22,23 및 DNA 혼성화 기법 24. 우리의 접근 방식은 필요없는 타겟팅 또는 인식 부분과 마이크로 웰 어레이를 필요로합니다. SSLBs의 크기는 낮은 폴리 분산도가 그런가 2 비드 지원의 직경에 의해 정의된다. SSLB 직경보다 더 큰 단지에 마이크로 웰 지름을 조정함으로써, 단일 SSLB 각 마이크로 웰 나오기. 폴리 (디메틸 실록산) (PDMS) 고무 롤러는 표면에서 마이크로 웰에 고정되지 않은 모든 SSLBs을 제거합니다. 마이크로 웰과 결과 SSLB 배열은 3 ㎛의 중심 간 간격과 육각형의주기와 높은 밀도 (~ 10 5 SSLBs / ㎟)가있다. 직렬 다른 지질 조성물로 SSLBs을 증착함으로써, 임의로 배치 SSLBs 가진 다 성분 배열을 생성 할 수있다. SSLB 배열의 감지 기능을 설명하기 위해, 우리는 SSLBs에 통합 강글리오사이드 (GM1)와 콜레라 독소 (CTx가)의 상호 작용을 사용했다. 와천연 막 입자, 우리는 두 가지 종류의 세포로부터 멤브레인 재료를 함유하는 다 성분 어레이 셀 고유 지질을 검출 할 수 있었다.
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Protocol
마이크로 웰 어레이 기판의 1. 미세 가공
- 열 성장 산화물 (100) (Nm)에 4 인치의 실리콘 웨이퍼로 시작.
- 30 초 동안 4,000 rpm에서 웨이퍼에 SPR-955 0.7 포토 레지스트를 스핀.
- 90 초 동안 115 ° C에서 열판에 굽는다.
- 포토 레지스트를 노출합니다.
- 배열은 2mm X 2mm 면적 3 μm의 기간이 육각형으로 배열 1 ㎛의 구멍을 만들 것입니다 마스크를 사용하십시오.
- 6mm의 스텝 사이즈 200 엠제이 / cm 2의 노출을 사용하여 i 선 스테퍼에 웨이퍼를 노출시킨다.
- 90 초 동안 115 ° C에서 열판에 굽는다.
- 90 초 총 개발 시간의 웨이퍼에 CD-26의 2 웅덩이을 입금 스핀 Developer를 사용하여 개발할 수 있습니다.
- N 2 고순도의 DI 물과 건조로 철저히 씻어.
- 아르곤 50 sccm으로, CF 4의 25 SCCM 및 CHF 3 FLO 50 SCCM으로 6 분 동안 반응성 이온 에칭 기에서 산화물을 에칭75 mTorr의 압력에서 날개.
- C 4 F 8 63 SCCM, SF 6의 27 SCCM, 아칸소의 40 SCCM, 및 O 2가 14 mTorr의 압력에서 흐르는 10 SCCM 2 분 ICP 깊은 트렌치 반응 이온 에칭에 실리콘 에칭.
- 저항 제거하기 위해 아세톤, 메탄올, 이소프로판올에 씻어.
- H 2 SO 4의 목욕 장소 : H 2 O 2 1:1 표면을 청소하는 10 분.
- N 2 고순도의 DI 물과 건조로 철저히 씻어.
- 250 ° C에서 원자 층 증착에 의해 알이 1,080 Å O 3을 입금
폴리 2. 준비 (디메틸 실록산) 스퀴지
- 가능하면, 클린 룸에서 작동합니다. 그렇지 않으면 가능한 깨끗한 환경에서 작동합니다.
- ≥ 13mm의 측면과 함께 플라스틱 페트리 접시 (또는 다른 깨끗한 일회용 용기)를 구합니다.
- 그 접시에, 50g의 PDMS의 BAS 다음, 5g PDMS 경화제을 부어전자 에이전트 (또는 대부분 페트리 접시를 채울 1:10 비율로 무엇이든). 일회용 플라스틱 피펫 또는 막대로 충분히 섞는다.
- 거품이 혼합물 (약 30 분) 나올 때까지 진공을 적용, 진공 라인과 챔버에서 혼합 된 PDMS를 배치하여 거품을 제거합니다.
- 이미 배양 접시에 기포의 생성을 방지 페트리 접시에 PDMS를 부어하지 않을 경우.
- 50 ° C (적은 시간에 대한 높은 열이 또한 작동)>에서 핫 플레이트에서 하룻밤 치료.
- 새 / 깨끗한 면도날로,주의 깊게 가능한 한 깨끗한 표면을 유지, 사각형 조각 약 2.5 × 2.5 cm를 잘라. 깨끗한 포셉 함께 껍질. (이것은 스퀴지 공정에 사용되는 에지 예정) 가능한 한 날카로운 위쪽 가장자리를 만들기 위해, 한 동작으로 면도날을 눌러서 하나의 에지 (1.5 cm 아래로)를 잘라냅니다.
- 다음 아세톤, 메탄올, 이소 프로필 알코올, 및 초순수 DI 물을 청소하고, 청소 질소 가스로 건조한다. 깨끗한 페트리 접시에 보관합니다.
소포의 3. 준비
- 지질 재고 25 ㎎ / ㎖ 달걀 포스파티딜콜린 (PC)의 솔루션 및 1 ㎎ / ㎖, 1,2 - 디 팔미 토일-sn-phosphoethanolamine-N을 수집 - 클로로포름 (리사 민 로다 민 B의 설 포닐) 암모늄염 (RHO-DPPE) 클로로포름 / 메탄올 monosialoganglioside GM1의 0.5 ㎎ / ㎖의 원액 (2 : V / V).
- 작은 유리 병에 25 ㎎ / ㎖의 PC의 18.9 μL, 0.5 밀리그램의 39.6 μL / ㎖ GM1 및 7.9 μl를 추가하여 97 몰 %의 PC에, 2 몰 % GM1 1 몰 % RHO-DPPE 결과 혼합물을 1 ㎎ / 유리 주사기를 사용하여 ML RHO-DPPE.
- 참고 :. 나이 르 등 25 보충 자료는 원하는 구성의 소포를 만드는 데 필요한 지질의 양을 계산하는 뛰어난 사용자 정의 Excel 스프레드 시트가 포함되어 있습니다.
- 진공 건조기에서 유리 병을 넣고 6 시간 동안 진공 유리 병을 떠나는하여 용매를 제거한다.
- 0.1의 수용액을 만들M의 NaCl. 건조한 지질 필름을 함유하는 바이알에, 0.1 M NaCl 용액 0.5 ㎖를 추가.
- 수성 지질 혼합물이 하룻밤 휴식을하실 수 있습니다.
- 소포의 현탁액을 생성하기 위해 잠시 동안 소용돌이 혼합 한 다음 실온에서 욕조 초음파 처리기에서 20 분 동안 초음파 처리.
- 100 nm의 기공 크기를 갖는 폴리 카보네이트 막을 통해 소포 현탁액을 돌출. 필터의 17 배를 통해 소포 현탁액을 전달합니다.
- 4 ℃에서 유리 병에 돌출 된 소포를 저장
구형 지원 지질 이중층의 4. 형성
- 700 나노 미터 직경의 SiO2 구슬을 수집합니다. 구슬은 1.4 × 10 11 비즈 / ㎖의 재고 농도 증류수에 공급된다.
- 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 0.1 M NaCl을 893 μL에 구슬 원액 107 μL를 추가하여 1.5 × 10 10 비즈 / ㎖의 농도가 1 ㎖ 비드 현탁액을 준비합니다.
- 잘 마일 보장하기 위해 서스펜션을 흔든다XED.
- 20 분 후 상층 액을 버린다 1,700 XG에 현탁액을 원심 분리기. 0.1 M의 NaCl 1 ㎖에 비즈를 Resuspend. 철저하게 구슬을 씻어 두 번 더이 단계를 반복합니다.
- , SSLBs를 형성 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 1 ㎎ / ㎖ 소포 현탁액 200 μL에 그런가 2 비드 현탁액의 25 μl를 추가합니다. 소용돌이 혼합물을 실온에서 1 시간 동안 서 보자. 이 단계에서 SSLB 농도는 1.7 × 10 9 SSLBs / ㎖이어야한다.
- SSLBs 펠렛 20 분 1,700 XG에 원심 분리기. 펠렛 인해 구슬 RHO-DPPE와 소포의 파열에 핑크를 나타납니다.
- 225 ㎕의 인산 완충 식염수 (PBS), pH가 7.4에서 뜨는에 resuspend 폐기하십시오. 반복 SSLB 서스펜션에서 모든 비 파열 소포를 제거하는 4.6-4.7 두 번 더 단계.
SSLB 배열 5. 총회
- 4-6 마이크 사각형 조각의 결과로 마이크로 웰 어레이 베기 웨이퍼조각 당과 Rowell 배열.
- 소용돌이가 SSLB 현탁액을 혼합, 각 마이크로 웰 어레이에 SSLB 현탁액의 10 μl를 놓습니다. 1 시간 동안 나머지는 SSLBs 표면에 정착 할 수 있도록 않도록.
- 다음 조심스럽게 얕은 접시에 준비 PBS 욕조에 잠수함, 세척 병에서 PBS와 마이크로 웰 어레이 칩을 씻는다.
- 잠수하는 동안 부드럽게 마이크로 웰 어레이 칩의 PDMS 스퀴지 플러시를 배치하고 부드럽게 마이크로 웰에 고정되지 않은 SSLBs을 제거하기 위해 표면에 5 배를 따라 밀어 넣습니다.
- 그립은 부드럽게 마이크로 웰 어레이 핀셋 칩 및 초과 SSLBs를 제거하는 PBS 욕조에 흔들.
- 빨리 스퀴지 화장실에서 칩을 제거하고 더 사용할 때까지 신선한 PBS 욕조에 넣습니다. 칩의 표면은 SSLBs을 유지하기 위해 젖은 상태로 있어야합니다.
참고 : 위에서 설명한 조립 방법은 마우스의 뇌, 또는 포에서 격리 수초 입자처럼, 자연의 막 입자의 배열을 만들 수 있습니다그런가 2 비드 지원없이 spholipid 소포. 이 작품은 비텐 베르크 등에 자세히 설명되어 있습니다 알. (21) 대표 결과는 다음과 같습니다.
6. 콜레라 독소 결합 분석
- PBS에 소 혈청 알부민 (BSA)의 2 ㎎ / ㎖ 용액을 준비합니다.
- 2 ㎎ / ㎖ BSA와 PBS에서 알렉사 488 - 복합 콜레라 독소 B-서브 유닛의 원하는 농도의 용액을 제조.
- PBS 화장실에서 SSLB 어레이 칩을 제거하고 닦아 실험실을 사용하여 PBS 솔루션의 대부분을 떨어져 심지. SSLB 배열이 수화 유지하기 위해 칩에 충분한 PBS를 남겨주세요.
- 비특이적 결합을 방지하기 위해, 2 ㎎ / ㎖ SSLB 어레이 칩 BSA 용액 200 μl를 추가합니다. 가습 상자에 1 시간 동안 휴식을 보자.
- 마이크로 피펫으로, SSLB 어레이 칩의 상단에서 솔루션 200 μl를 제거합니다.
- SSLB 어레이 칩에 콜레라 독소 솔루션 200 μl를 추가하고 가습 상자에 1 시간 동안 휴식을 할 수 있습니다.
- 부드럽게 모든 언 바운드 콜레라 독소를 제거하기 위해 세척 병에서 PBS와 SSLB 어레이 칩을 씻는다.
- 실험실을 사용하여 심지 멀리 초과 PBS는 닦아냅니다. 24mm X 40mm 커버 슬립으로 커버 칩 이미징 전에.
- 필터를 사용하여 직립 현미경 이미지 배열은 관심의 형광에 적합한 설정합니다.
- ImageJ에 소프트웨어의 자동화 된 입자 분석 기능을 사용하여 배열의 개별 SSLBs의 형광 강도를 분석.
- 주어진 배열에서 발견 SSLBs의 강도를 요약 막대 그래프로 개별 SSLBs에서 평균 형광 강도를 컴파일합니다.
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Representative Results
SiO2로 비즈 인지질, 형광 지질 등 강글리오사이드와 같은 다른 지질로 구성된 소포 용액과 혼합하는 경우도 1a에 개략적으로 도시 된 바와 같이, 소체는 SSLBs을 형성 할 SiO2를 비드 표면에 파열. SSLBs 세척 후, SSLB 용액의 방울을 마이크로 웰 어레이에 배치되고, 비드 표면에 정착하는 것이 허용된다. (그림 1B1)이 그림 1B2에 표시됩니다 인지질 소포 또는 자연 막 입자의 서스펜션도를 수행 할 수 있습니다. 마이크로 웰 어레이 기판에 흡착 인지질 소체의 형광 이미지를도 1B3에 도시된다. 그런 다음 PDMS 스퀴지는 어떤 SSLBs (그림 1C1), 소포 또는 자연 막 입자 마이크로 웰에 정착하지 않았다 (그림 1C2)을 제거하기 위해 표면을 부드럽게 슬라이드한다. 이 SSLB 배열에 어떤 결과 각마이크로 웰 대부분에 포함하는 하나의 SSLB (그림 1D1) 또는 여러 개의 소포 또는 자연 막 입자는 각각의 마이크로 웰 (그림 1d2)에 배열. 찬란 소포로 구성된 마이크로 어레이의 이미지는 그림 1d3에 표시됩니다.
계란 PC (검정), RHO-DPPE (빨간색)와 GM1 (파란색) :.. 그런가 2 비드에 지질의 3 종류로 구성 SSLB의 SSLBs 및 SSLB 배열 어셈블리의 그림 1과 형성 () 그림. (B1-D1) 마이크로 웰 어레이 (B1)에 흩어져 SSLBs을 보여주는 SSLB 배열의 조립을위한 프로세스 흐름, SSLBs의 표면을 취소 할 수있는 PDMS 스퀴지의 사용은 마이크로 웰 (C1)에 정착하지, 최종 SSLB 배열 (D1 ). (B2-D2 (B2)의 그림에 해당하는 마이크로 웰 기판에 흡착 인지질 소포 (B3) 형광 이미지. (D3) (D2)의 그림에 해당하는 인지질 소포로 구성된 마이크로 어레이의 형광 이미지. 참조 (20, 21)에서 적응과 미국 화학 학회의 허가와 함께 사용.
마이크로 웰에서 SSLBs 양쪽 각진 베스트 시청 및 단면도 관점에서 주사 전자 현미경 (SEM)으로 이미지화 된 개별의 SiO2 비즈 지원한다. 도 2B는 고정화 단일 비드의 단면도를 보여 주지만 영역의 평면도는 약 15 μm의 X 15 μM은,도 2a에 도시마이크로 웰. 마이크로 웰을 코팅 라이터는 Al 층이 100 ㎚이다 O 3 웰은 단일 비드를 수용 할 수 있도록 웰의 직경은 튜닝에 원자 층 증착에 의해 침착.
SSLB 배열의 그림 2. 주사 전자 현미경 이미지. 마이크로 웰 어레이에 고정화 SSLB 비드 지지체를 도시 15mm X 15mm의 영역 (a) 전자 현미경 사진. (b)는 마이크로 웰의 하나의 700 nm의 직경 SSLB. 마이크로 웰 코팅 개별 비드 안으로 들어갈 수 있도록 마이크로 웰 수축 퇴적 알 2 O 3이다. 참고 20에서 적응과 미국 화학 학회의 허가와 함께 사용.
SSLB 어레이가 준비되면, 그들은 형광 현미경에 의해 촬영 될 수있다.
SSLBs의 다른 유형의 순차적 증착은 하나 이상의 개별 SSLBs의 신원이 독소 수용체 (GM1)의 부재 또는 존재에 의해 결정 하였다 SSLB의 종류 및 콜레라 독소 (CTx가)의 결합으로 배열을 생성하기 위해 사용되었다. 조립 공정은 단일 SSLB 유형과 동일하지만 상이한 SSLB ID로 두 번 수행 하였다. SSLBs의 출발 농도는 SSLB의 제 분류 인원을 줄이기 위해 더 가능일 SSLB의 제 분류에 의해 점유 될 수 있도록 배 낮았다. 도 3C-3E에서 SSLBs 두 가지 유형의 SSLB 어레이가 표시됩니다. 알SSLBs의 난 적색 형광 RHO-DPPE (그림 3C)를 포함하지만, SSLBs의 일부는 GM1,의 CTX B-서브 유닛에 대한 수용체 강글 리오 시드가 포함되어 있습니다. 녹색 형광 알렉사 488 - 복합 CTx가 노출되었을 때, GM1을 포함 만 SSLBs 녹색 채널 (그림 3D)에 형광. 빨간색과 녹색의 이미지가 병합 될 때, SSLBs는 GM1 (노란색)를 포함하는 결정하는 것이 가능하고 어떤하지 않음 (빨강) (그림 3E).
SSLB 배열의 그림 3. 형광 이미징. (A) 936 RHO-DPPE 표지 계란 PC의 SSLBs을 포함하는 100 μm의 × 100 μm의 영역입니다. (B)를 차지하는 마이크로 웰의 76 %와 SSLB을 보여주는 시야 및 형광 오버레이. (CE) RHO-DPPE를 포함 SSLBs를 포함하는 SSLB 배열(C)의 일부는 알렉사 - 488 - 복합 CTx가 (D)에 구속되어 GM1가 포함되어 있습니다. (E) colocalized 형광 SSLB에 GM1의 존재를 나타내는 빨간색과 녹색 채널의 합병. 파란색 동그라미, 즉 GM1 부족, 단지 붉은 형광 SSLBs을 나타냅니다. 참고 20에서 적응과 미국 화학 학회의 허가와 함께 사용.
SSLB 어레이로부터 형광 데이터는 이미지의 개별 SSLBs의 세기를 측정하여 분석 하였다. 배열에서 SSLB 강도 데이터는 막대 그래프로 컴파일 된. 그림 4a는 유일하게 계란 PC와 1 몰 % RHO-DPPE를 포함 SSLBs의 구성 SSLB 배열 RHO-DPPE 형광의 분석에서 하나의 막대 그래프를 보여줍니다. 도 4a에있는 데이터는도 3a에 화상을 분석함으로써 획득되었다. 우리는 냉장 때 SSLB 어레이는 적어도 일주일 동안 강력하고 안정한 것으로 밝혀차 버퍼에 잠긴. 배열은 형광 강도를 잃지 않았고, 배열의 인원은 일주 (그림 4B)의 과정을 통해 변경했다.
도 4. (a)의 히스토그램이도 3a에 도시 SSLB 배열의 형광 농도의 분포를 나타내는. 배열의 각 SSLB의 평균 강도는 히스토그램을 컴파일하는 데 사용되었다. 실선은 데이터에 대한 가우시안 적합하다. (b)는 배열 점유율 (검은 색 원)과 일주일에 걸쳐 모니터링 SSLB 배열의 형광 강도 (빨간색 사각형)을 의미한다. 참고 20에서 적응과 미국 화학 학회의 허가와 함께 사용.
우리는 GM1 (0, 0.5, 1의 농도 변화와 SSLBs로 구성된 배열을 만든차 2 몰 %) 및 고정의 CTX 농도뿐만 아니라 GM1의 농도 SSLBs와 배열에 노출과의 CTX 농도 변화에 노출. 이후 실험 GM1/CTx가 바인딩 평형 해리 상수 (Kd 값)를 결정하는 데 사용되었다. 가변 GM1 농도 SSLB 어레이이어서 세정 묘화 1 시간 동안 50 nM의 알렉사-488 표지 CTx가 노출시켰다. 강도는 0.5으로 SSLB 어레이에 대한 히스토그램 - 50 nM의 알렉사 488 공역 CTx가 노출 2 몰 % GM1은도 5a에서 알 수있는도 5b는 GM1 농도에 따라 평균 형광 강도의 선형 의존도를 보여준다.. SSLBs GM1에서의 농도가 2 몰 %로 고정되고 SSLB 어레이는 16시 ~ 158 ㎚에 이르는 CTx가 노출되는 경우도 5c에 도시 된 바와 같이, 결합 반응은 S 자형 곡선을 따른다. 이 데이터에 적합 곡선은 두 개의 서로 다른 결합 모델을 기반으로합니다 : 랭 뮤어 등온선 (식 1)과 힐 Waud 모드L (식 2). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
(1)
(2)
F는 관련 CTx가 농도에서 형광 강도 여기서 결합이 포화 될 때, F 맥스 형광 강도이며, [CTx가] CTx가 농도, K D 및 K H는 랭 뮤어와 힐 Waud로부터 해리 상수가되어 각각 적합 및 N-힐 Waud 모델 협동성 계수이다. 협동성 계수 (N)는보다 큰 n 다가 결합의 양을 추정하나는 각 CTx가 분자 하나 이상의 GM1 바인딩을 나타냅니다. 0.5 ×의 F 최대에서의 CTX 농도는 GM1/CTx 상호 작용을 K D 또는 K H입니다. 우리의 실험에서 우리는 협력 바인딩을 나타내는 1.3의 N 값으로 1.6 ± 0.2 ㎚의 K D 및 1.4 ± 0.2 ㎚의 K H를 계산. GM1/CTx 상호 작용에 대한 해리 상수는 370 nm의 (26, 27) 4.5 ~ 시부 터 크기의 5 이상 구매시에 이르기까지 문헌에 널리 다릅니다.
그림 5. CTx/GM1이 SSLB 배열에 대한 분석을 결합. (a) SSLB 어레이 내의 개별 SSLBs의 형광 강도의 히스토그램. 이 배열은 0.5, 1, 2 몰 % GM1과 SSLBs을 포함, 50 nM의 알렉사 488 - 복합 CTx가 노출되었다.실선은 가우시안 적합하다. (b) 분포의 플롯은 GM1 농도의 함수로서 (a)까지 의미한다. (C)의 분포를 보여주는 바인딩 곡선은 158 nm의 16 시부 터 다양한 알렉사 - 488 - 복합 CTx가에 노출 된 후 2 몰 % GM1과 SSLBs를 포함하는 배열에서 의미합니다. 선은 랭 뮤어 등온선 (적색)과 힐 Waud (파란색) 결합 모델에 적합하다. (BC)의 오차 막대는 각 데이터 포인트에 대응하는 형광 강도의 분포의 표준 편차를 나타낸다. 참고 20에서 적응과 미국 화학 학회의 허가와 함께 사용.
앞서 언급 한 바와 같이, 그것은 천연 공급원 (21)으로부터 유도 생체막 재료로 어레이를 형성하는 것도 가능하다. 배열은 다음 MIC 멤브레인 입자 뒤에 남겨 스퀴지 상부 표면을 세정, 마이크로 웰 기판 상에 멤브레인 입자를 분산하여, 동일하게 형성되어있다rowells. 그림 6은 수초와 신경 세포의 지질 뗏목의 마이크로 어레이의 예를 보여줍니다. 그림 6a에서, myelin의 입자는 친 유성 형광 FM1-43으로 표시됩니다. 지질 뗏목은 콜레스테롤과 같은 GM1 강글리오사이드 등이 풍부한 것으로 알려져있다; 그림의 (b)에 나타낸 바와 같이 형광 표지 스트렙 타비 딘 (SAPE)는 배열에 바인딩하지 않습니다 동안 따라서, 알렉사 488 - 복합 CTx가가, 지질 뗏목의 마이크로 어레이에 강하게 결합한다. (그림 6C) 우리는 또한 250 μm의 넓은 채널을 미세 유체 칩 마이크로 웰 기판에 수초 및 지질 뗏목 입자를 제공하여 스트라이프 배열을 만들었습니다. 입자 도착 후, 마이크로 유체 칩은 마이크로 웰 기판에서 분리하고, 스퀴지 과정은 평소와 같이 실시했다. 스트라이프 배열은 다음 수초에서 발견 sulfatide을 결합하는 형광 방지 희소 돌기 아교 세포의 IgM 항체 (IgM 항체 O4)에 노출되었다. (그림 7) 수초 및 지질 뗏목 스트라이프 마이크로 어레이그림 7의이 배율의 증가 수준에 표시하고, 확대의 가장 높은 수준에서, 그것은 sulfatide은 지질 뗏목에서 결석 때문에 IgM 항체 O4는 수초 마이크로 어레이에 결합하는 것이 명백하다 있습니다.
그림 6. 미엘린 입자와 신경 세포의 지질 뗏목 입자 배열. 미엘린 입자는 친 유성 형광 FM1-43에 의해 형광을 렌더링 (a) 미엘린 입자 마이크로 어레이. 점선은 어레이 영역의 가장자리를 나타낸다. (B) CTx가이 지질 뗏목 입자에 결합 보여주는 지질 뗏목의 마이크로 어레이. (다) 지질 뗏목의 마이크로 어레이없이 비특이적 결합을 조금 보여주는 형광 스트렙 타비 딘 - 피코 에리 트린 (SAPE)에 노출. 참고 21에서 적응 및 미국 화학 SOC의 사용 허가iety.
그림 7. 다 성분 배열 수초와 신경 뗏목 점막의 미세 유체 전달에 의해 형성. (a) 및 미엘린 뗏목 후의 형광 화상은 마이크로 어레이 기판 상에 미세 유체 채널을 통해 증착시켰다. 왼쪽과 오른쪽 줄무늬 수초를 포함하고 중간 스트라이프 신경 뗏목 세포막이 포함되어 있습니다. 막은 FM1-43, 모든 지질 자료를 레이블로 염색된다. 스케일 바는 250 μm의입니다. PDMS 스퀴지를 적용하고 IgM 항체 O4와 함께 배양 한 후 동일한 3 개의 줄무늬의 (B) 형광 이미지. 스케일 바는 250 μm의입니다. IgM 항체 O4는 수초 마이크로 어레이에 결합 보여주는 세 개의 줄무늬에서 (CE) 확대 된 이미지 : (C) 왼쪽 스트라이프 및 (e) 바로 스트라이프. P의 스케일 바anels 세륨은 30 μm의 수 있습니다. 참고 21에서 적응과 미국 화학 학회의 허가와 함께 사용.
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Discussion
본 연구에서 우리는지지 지질 이중층 코팅 단 분산의 SiO2 비즈 지질 이중층 또는 기판 표면 상에 리간드를 표적에 대한 필요없이 마이크로 웰 어레이로 배열 될 수 있으며, 배열이 독소 - 지질 상호 작용을 특성화에 사용될 수 있음을 보여준다. CTx/GM1 바인딩에 대해 계산 된 해리 상수 우리에 의하여 이전의보고와, 문헌 값의 폭 격차 관련, 바람직 비교 윈터 등. 지질 - 코팅 된 비드의 콜로이드 어셈블리는 약의 해리 상수를 계산하는 데 사용 된 곳 30 ㎚. 힐 Waud 바인딩 모델에 데이터를 피팅함으로써, 우리는 CTx/GM1 상호 작용은 이전의보고 28 동의 가능성 다가이라고 결정했다. 의 CTX B (강글 리오 시드 결합) 서브 유닛은 GM1 분자 (29)를 결합 할 수있는 오 유닛 각각과, 펜타 머로서 존재한다; 따라서, 하나 이상의 서브 유닛은 비교를 주어 결합 될 수 있다는 놀라운 일이 아니다SLB 수 30 GM1의 usive 이동.
화학적 작용 구슬의 배열은 다른 분석 연구 (31)에 사용되어왔다. 이런 종류의 실험에서, 비드는 일반적으로 에칭 된 광 화이버의 단부에서 만든 마이크로 웰에 고정화된다. 멀티 플렉스 형광 분석법 비즈의 모집단을 혼합 및 광파이버 (32)의 단부 상에 동시에 고정화하여이 구성에서 수행 될 수있다. 솔루션 무료 SSLBs에 지질이 다른 33 SSLB의 한 유형에서 전송 될 수 있기 때문에 우리의 다중 분석 (그림 3C-3E)에서, 우리는 순차적으로 광학적으로 인코딩 된 SSLBs을 고정. 이것은 SSLB 어레이의 제조에서 추가 단계를 추가하지만, 그렇지 지나치게 시간이 소요되고 지질 작용 비드에 가장 효율적인 방법이다. 또한 공간적으로 인접하는 마이크로 웰 어레이에서 다른 SSLB 인구를 증착함으로써 어레이를 인코딩 한, 어떠한 관찰 크로마뇽가 없다어레이 (20) 사이의 토크. 샘플 준비 시간을 줄이기 위해 SSLB 어레이는 미리 준비하고, 원하는 경우 사용될 수있다. 우리는 일주일에 걸쳐 배열의 안정성을 테스트 SSLBs에 지질 물질의 양이 시간에 따라 변화하지 않음을 나타냅니다 형광 강도의 측면에서 배열의 유의 한 저하를 찾을 수 없습니다. 또한, 배열 인원은 SSLBs이 고정되면, 그들은 마이크로 웰 (그림 4B)에서 분리하지 않는 것이 제안하는, 시간이 지남에 따라 변경되지 않습니다.
합성 지질 이중 막으로 코팅 구슬 이외에, 우리는 또한 자연적인 막 입자 (21)의 배열을 만들려면이 방법을 사용했습니다. 이 작품에서 우리는 지질 뗏목 부분이 마우스의 뇌뿐만 아니라 신경 세포의 막 입자에서 파생 된 수초 입자를 고정. 우리는 항체 빈디 의해 셀 고유 막 표면 분자를 식별하는 배열을 사용할 수 있었다NG (도 6 및도 7). 또한, 마이크로 웰의 크기가 어레이의 나노 스케일 및 상면으로 감소되었을 때이 금으로 코팅 한 후, 우리는 형광 라벨의 사용없이 미엘린 막 입자에 대한 항체의 결합을 모니터링하는 표면 플라즈몬 공명을 채용 할 수 있었다. 어레이를 형성하도록 SSLB 및 소낭 또는 천연 막 입자를 사용 간의 주요 차이점은 단일 비드 각 웰에 들어갈 수 있기 때문에 SSLBs의 경우는 각 마이크로 웰의 막 재료의 정확한 양이 공지되어 있다는 점이다. 소낭 또는 천연 막 입자, 소포 또는 입자의 출발 농도를 조정하는 것 이외의 각 마이크로 웰의 재료의 양을 제어 할 수있는 방법이 없다. 그러나 소포의 수의 잘 - 투 - 웰 가변성 소포 직경 (21)의 분포에 비해 매우 크지 않다.
마지막으로,이 방법은 DIV를 가질 수 있습니다미래의 응용 프로그램을 어스 어. Junesch 및 동료 콜로 이달 리소그래피 나노 제조 34시 나노 입자를 제거하기 위해 고무 롤러를 사용했다. 막 배열은 휴대 초점 접착 (35)를 조사하거나 막 곡률 감지 단백질 (36)의 바인딩을 검사하는 세포 - 세포 연락처를 모방하기 위해 형성 될 수있다. 또, 다공성 비드의 사용은 지질 이중층 또는 37 생체막 어레이 기판 상에 배양 세포에 저장된화물의 로컬 대금에 막 횡단 단백질의 포함을 용이하게한다. 마이크로 웰 플랫폼은 설계 유연성을 허용 포토 리소그래피에 의해 제조된다. 여기에 우리의 배열은 육각형의 형상을했지만, 사각형, 직선, 또는 다른 형상은 초점 접착의 공간 효과를 조사하기 위해 배열주기와 마이크로 웰 치수 변화로 생성 될 수있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 경쟁 금전적 이해 관계가 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 건강의 국립 연구소 (R01 GM092993)에서 SHO 보조금에 의해 지원되었다, 국립 과학 재단 (NSF 경력 수상 및 DBI 0,964,216), 해군 연구 국 (ONR) 젊은 탐정 프로그램 및 생명 공학에 대한 미네소타 파트너십 수상 의학 유전체학. 장치 제조는 국가 나노 기술 인프라 네트워크를 통해 NSF에서 지원을받는 미네소타 대학의 Nanofabrication이 센터 (NFC)에서 수행 하였다. 이 작품은 건강 (NS048357, R21 NS073684), 국립 다중 경화증 학회 (CA1060A11), 알파 밤, 힐튼, 피터슨과 샌포드 기초 및 McNeilus 가족의 국립 연구소에서 MR 보조금에 의해 지원되었다. 저자는 주사 전자 현미경에 대한 지원은 그림과 Shailabh 쿠마에 대한 지원은 Hyungsoon 임 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 inch silicon wafers | University Wafer | 425 | |
| Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist | MicroChem | SPR955-CM | |
| Shipley MICROPOSIT CD-26 developer | MicroChem | CD-26 | |
| i-line stepper | Canon | 2500 i3 stepper | |
| Vision 320 reactive ion etcher | Advanced Vacuum | Vision 320 RIE | |
| Deep trench reactive ion etcher | Plasma Therm | SLR-770 | |
| Atomic layer depostion system | Cambridge NanoTech | Savannah | |
| Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Egg phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt | Avanti Polar Lipids | 810158C | |
| Monosialoganglioside GM1 | Avanti Polar Lipids | 860065P | |
| Silica beads | Bangs Laboratories | SS03N/4666 | Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter. |
| Cholera toxin B-subunit, Alexa 488-conjugate | Molecular Probes | C-34775 | |
| Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate | R&D Systems | NL1326R | |
| FM1-43 | Molecular Probes | T-3136 | |
| Eppendorf MiniSpin centrifuge | Fisher Scientific | 05-401-09 |
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