Summary
Bicamadas lipídicas suportadas e partículas de membranas naturais são sistemas convenientes que podem aproximar as propriedades das membranas celulares e ser incorporadas em uma variedade de estratégias de análise. Aqui demonstramos um método para a preparação de compostos de microarrays de suporte revestidas de lípidos em bicamada-SiO 2 grânulos, vesículas de fosfolípidos ou partículas de membranas naturais.
Abstract
Membranas de bicamada lipídica formar as membranas plasmáticas de células e definir os limites de organelos subcelulares. Na natureza, estas membranas são misturas heterogéneas de vários tipos de lípidos, contêm proteínas ligadas à membrana, e são decorados com hidratos de carbono. Em algumas experiências, é desejável para dissociar as propriedades biofísicas ou bioquímicas da bicamada lipídica dos da membrana natural. Tais processos requerem o uso de sistemas modelo tais como vesículas gigantes, lipossomas ou bicamadas lipídicas suportados (EBSL). Matrizes de EBSL são particularmente atraentes para aplicações de detecção e imitando interações célula-célula. Aqui nós descrevemos um novo método para a formação de matrizes SLB. Submicron diâmetro SiO 2 grânulos são primeiro revestidas com camadas duplas de lípido para formar EBSL esféricas (SSLBs). Os grânulos são, em seguida, depositada numa matriz de micropoços micro fabricado submícron de diâmetro. A técnica de preparação utiliza um "rodo" para limpar a superfície do substrato, enquanto deixandog trás SSLBs que se instalaram em micropoços. Este método não requer nenhuma modificação química do substrato de micropoços, nem quaisquer ligandos alvo particulares no SSLB. Os micropoços são ocupados por grânulos individuais, porque o diâmetro do poço é ajustado para ser apenas maior do que o diâmetro do cordão. Tipicamente, mais de 75% dos poços estão ocupados, enquanto o restante permanece vazio. Em tampão de matrizes SSLB exibir estabilidade a longo prazo maior do que uma semana. Vários tipos de SSLBs podem ser colocados em uma única matriz pela deposição de série, e as matrizes podem ser usados para a detecção, o que demonstramos ao caracterizar a interação da toxina da cólera com gangliosídeo GM1. Mostramos também que as vesículas de fosfolípidos, sem os suportes de talão e biomembranas de fontes celulares podem ser dispostos com o mesmo método e os lípidos da membrana específicos para células podem ser identificadas.
Introduction
Membranas lipídicas bicamada são estruturas essenciais na natureza. Membranas plasmáticas celulares e membranas de organelas são compostas por bicamadas lipídicas que incorporam uma série de moléculas que são necessárias para a vida. Muitos processos que sustentam a vida ocorrem na superfície de células ou são mediadas por moléculas associadas com membranas de bicamada lipídica. De facto, muitos processos farmacêuticos alvo ou moléculas são encontrados sobre ou dentro de membranas de 1,2. Por conseguinte, é necessário investigar analiticamente processos, tais como reacções químicas ou eventos de ligação não covalentes que ocorrem sobre as superfícies da membrana. Porque as membranas naturais podem ser difíceis de isolar e / ou de interface com os sensores, muitos investigadores empregam membranas modelo simplificado para a realização de estudos analíticos. Um certo número de sistemas de membranas modelo são descritos na literatura, variando a partir de vesículas gigantes que podem ser dezenas a centenas de microns de diâmetro até os lipossomas com dimensões nanométricas 3,4. Alterntivamente, bicamadas lipídicas planas depositados em suportes sólidos, isto é, suportadas bicamadas lipídicas (EBSL), pode ser formado de uma série de superfícies diferentes e têm sido amplamente utilizados em biofísicos, bioquímicos, e aplicações analíticas 5. Acoplamento EBSL com materiais eléctricos ou ópticos permite a investigação de bioquímica e biofísica da membrana, através da utilização de diferentes técnicas analíticas. A microscopia de fluorescência 6, 7 eletroquímica, espectroscopia óptica 8, microscopia de varredura por sonda 9, a ressonância de plasma de superfície 10, e espectrometria de massa 11 têm sido utilizados para estudar a estrutura e propriedades de EBSL.
Matrizes SLB oferecem versatilidade adicional na concepção de sensores para ensaios multiplex 12,13. Outras aplicações utilizam matrizes SLB para imitar a junção que se forma entre células do sistema imunológico 14. Métodos de preparação para matrizes SLB têm variado de microfluidic se aproxima de 15 a aqueles que empregam as barreiras físicas entre os patches SLB adjacentes. 16 Outros grupos têm usado métodos de impressão 17, padronização fotoquímica 18 e vários nanoengineering se aproxima de 19 a criar matrizes SLB.
Neste artigo e vídeo que acompanha demonstramos um método para formar matrizes SLB SLB depositando-revestidos SiO 2 contas em conjuntos ordenados de micropoços 20. Referimo-nos aos SLB-revestidos SiO 2 pérolas esféricas como bicamadas lipídicas suportadas (SSLBs). Esta técnica é uma extensão do trabalho anterior que criou conjuntos de vesículas de fosfolipídios e biomembranas derivados de fontes naturais 21, de onde também mostram exemplos de resultados. Outros métodos para arraying partículas de membranas ou vesículas têm contado com padrões de ligantes específicos de segmentação em superfícies que se associam com ligantes complementares contidas na superfície da vesícula. Exemplos incluem a biotina-associação avidina 22,23 e esquemas de hibridização DNA 24. Nossa abordagem requer apenas uma matriz de micropoços sem partes necessárias de segmentação ou de reconhecimento. O tamanho de SSLBs é definida pelo diâmetro das SiO 2 suportes de talão, que têm baixa poli-dispersividade. Ao ajustar o diâmetro de micropoços apenas maior que o diâmetro SSLB, apenas um único SSLB depositada em cada microplaca. Um poli (dimetilsiloxano) (PDMS) rodo então remove da superfície de todos os SSLBs que não estão imobilizados em micropoços. Os micropoços e matrizes SSLB resultantes têm elevada densidade (~ 10 5 SSLBs / mm 2) com 3 um espaçamento centro-a-centro e periodicidade hexagonal. Por serialmente depositando SSLBs com diferentes composições de lípidos, é possível criar matrizes de múltiplos componentes com SSLBs posicionados aleatoriamente. Para demonstrar a capacidade de detecção de matrizes SSLB, usamos a interação da toxina da cólera (CTx) com um gangliosídeo (GM1) incorporada nas SSLBs. Compartículas de membranas naturais, que eram capazes de detectar lípidos específicos de células em matrizes de multicomponentes que contenham material de membrana a partir de dois tipos de células diferentes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Microfabricação de Microwell matriz Substrato
- Comece com uma pastilha de silício de 4 polegadas com 100 nm de óxido crescido termicamente.
- Gire SPR-955 0.7 photoresist na bolacha a 4.000 rpm por 30 seg.
- Asse numa placa de aquecimento a 115 ° C durante 90 seg.
- Expor photoresist.
- Use uma máscara que irá criar uma mM buracos dispostos em um arranjo hexagonal com um período de 3 um, onde a matriz de cobre a 2 mm Área x 2 mm.
- Expor bolacha num passo i-line utilizando um tamanho de passo de 6 mm e uma exposição de 200 mJ / cm 2.
- Asse numa placa de aquecimento a 115 ° C durante 90 seg.
- Desenvolver usando um desenvolvedor de spin para depositar duas poças de CD-26 no wafer para um tempo de desenvolvimento total de 90 seg.
- Enxaguar abundantemente com água ultrapura DI e seco com N2.
- Etch do óxido em um etcher reativa-ion para 6 min com 50 sccm de Ar, 25 sccm de CF 4 e 50 sccm de CHF 3 floasa, a uma pressão de 75 mTorr.
- Etch silício em um ICP profunda trincheira etcher reativa-ion por 2 min com 63 sccm de C 4 F 8, 27 sccm de SF 6, 40 sccm de Ar, e 10 sccm de O2 que flui a uma pressão de 14 mTorr.
- Enxaguar em acetona, metanol e isopropanol, para remover resistir.
- Coloca-se num banho de H 2 SO 4: H 2 O 2 a 1:01 durante 10 minutos para limpar a superfície.
- Enxaguar abundantemente com água ultrapura DI e seco com N2.
- Deposite 1,080 Å de Al 2 O 3 por deposição de camadas atômicas a 250 ° C.
2. Preparação de Poli (dimetilsiloxano) Rodo
- Se possível, trabalhar em uma sala limpa. Caso contrário, trabalhar no ambiente mais limpo possível.
- Obter um prato de plástico Petri (ou outro recipiente descartável limpo) com ≥ lados 13 mm.
- Nesse prato, despejar 5 g agente PDMS cura, seguido de 50 g de PDMS base agente (ou qualquer coisa com uma relação de 01:10 que a maioria irá preencher a placa de Petri). Misture bem com uma pipeta de plástico descartável ou vara.
- Retirar as bolhas, colocando o PDMS misturados numa câmara com uma linha de vácuo, a aplicação de vácuo, até sair bolhas de mistura (cerca de 30 min).
- Se ainda não estiver na placa de Petri, despeje PDMS em placa de Petri, evitando a criação de bolhas de ar.
- Curar durante a noite numa placa de aquecimento a> 50 ° C (mais elevada de calor durante menos tempo também funciona).
- Com lâmina de barbear novo / limpo, cuidadosamente cortar um pedaço retangular de aproximadamente 2,5 x 2,5 cm, mantendo a superfície superior o mais limpo possível. Descasque fora com um pano limpo fórceps. Apare uma borda (até 1,5 cm), pressionando para baixo em lâmina de barbear em um movimento, para fazer borda superior tão afiada quanto possível (esta será a borda utilizada no processo de rodo).
- Limpa-se com acetona, metanol, álcool isopropílico, e ultrapura DI água, e, em seguida, secar com azoto gasoso limpo. Guarde em um prato limpo Petri.
3. Preparação de vesículas
- Recolhe soluções de lipídicos de fosfatidilcolina de 25 mg / ml de ovo (PC) e 1 mg / ml de 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N - (lissamina rodamina B sulfonil) de sal de amónio (Rho-DPPE) em clorofórmio e uma solução a 0,5 mg / ml de mono-sialogangliósido GM1, em clorofórmio / metanol (2:1 v / v).
- Num frasco pequeno de vidro fazer uma mistura que resulta em 97% molar de PC, 2% molar de GM1 e 1% molar de DPPE-Ró, adicionando 18,9 uL de 25 mg / mL de PC, 39,6 ul de 0,5 mg / ml de GM1 e 7,9 ul de 1 mg / mL de Rho-DPPE utilizando seringas de vidro.
- Nota:. O material suplementar para Nair et al 25 contém uma excelente planilha Excel customizáveis para o cálculo das quantidades de lipídios necessários para criar vesículas de qualquer composição desejada.
- Coloque frasco num exsicador de vácuo e remover o solvente deixando o frasco sob vácuo durante 6 horas.
- Adicione uma solução aquosa de 0,1M de NaCl. Adicionar 0,5 ml de solução de NaCl 0,1 M para o frasco contendo a película de lípidos seca.
- Permitir que a mistura aquosa de lípido para descansar durante a noite.
- Resumidamente mistura vortex para criar uma suspensão de vesículas, em seguida, sonicar durante 20 min num banho de ultra-sons à temperatura ambiente.
- Extrude a suspensão vesícula através de uma membrana de policarbonato com 100 nm de tamanho de poros. Passar a suspensão de vesículas através do filtro de 17x.
- Armazenar as vesículas extrusadas em um frasco de vidro a 4 ° C.
4. Formação de esféricas lipídicas Bicamadas suportados
- Colete 700 nm de diâmetro SiO 2 contas. As contas são fornecidos em água destilada com uma concentração estoque de 1,4 x 10 11 contas / ml.
- Num tubo de Eppendorf de 1,5 ml preparar uma suspensão de esferas de 1 ml, com uma concentração de 1,5 x 10 10 contas / ml pela adição de 107 ul de solução-mãe de talão de 893 ul de 0,1 M de NaCl.
- Vortex a suspensão para garantir que ele está bem mixa.
- Centrifugar a suspensão a 1700 xg durante 20 min, em seguida, descartar o sobrenadante. Ressuspender as pérolas em 1 ml de 0,1 M de NaCl. Repita este passo mais duas vezes para lavar bem as contas.
- Para formar os SSLBs, num tubo Eppendorf de 1,5 ml adicionar 25 ul da suspensão de esferas de SiO 2 para 200 ul de 1 mg / ml de suspensão de vesículas. Vortex a mistura e deixar repousar durante 1 hora à temperatura ambiente. Nesta fase, a concentração deve ser SSLB 1,7 x 10 9 SSLBs / ml.
- Centrifugar a 1700 xg por 20 min para agregar as SSLBs. A pastilha deve aparecer rosa devido à ruptura de vesículas com Rho-DPPE sobre as contas.
- Descartar o sobrenadante e ressuspender em 225 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH = 7,4. Repita os passos de 4,6-4,7 mais duas vezes para remover quaisquer vesículas unruptured da suspensão SSLB.
5. Assembleia da SSLB Matriz
- Wafer Cleave de matrizes de micropoços, resultando em peças retangulares com 4-6 micmatrizes rowell por peça.
- Vortex misturar a suspensão SSLB, em seguida, coloque 10 ml de suspensão SSLB em cada matriz de micropoços. Para que não descanso para 1 hora para permitir SSLBs para resolver para a superfície.
- Lave cuidadosamente o chip conjunto de micropoços com PBS a partir de um frasco de lavagem, em seguida, mergulhe em um banho de PBS preparada em um prato raso.
- Enquanto submerso, coloque delicadamente o PDMS rubor rodo no chip conjunto de micropoços e gentilmente deslize-o ao longo da superfície de 5x para remover SSLBs que não estão imobilizadas em micropoços.
- Segure o chip conjunto de micropoços, com uma pinça e agite no banho PBS para remover quaisquer SSLBs excesso.
- Remover rapidamente o chip do banho de rodo e coloque em banho-PBS fresco até à sua utilização. Certifique-se que a superfície superior do chip permanece molhado para preservar os SSLBs.
Nota: O processo de montagem descrito acima pode ser utilizado para criar matrizes de partículas de membranas naturais, como partículas de mielina isoladas de cérebro de rato, ou phovesículas spholipid sem os SiO 2 suportes talão. Este trabalho é descrita em pormenor em Wittenberg et 21 al. E os resultados representativos são apresentados abaixo.
6. Cholera Toxin Binding Assay
- Prepara-se uma solução de 2 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA) em PBS.
- Prepara-se uma solução com a concentração desejada de Alexa 488 conjugado com a toxina da cólera subunidade B em PBS com 2 mg / ml de BSA.
- Retire o chip conjunto SSLB do banho de PBS e pavio fora a maior parte da solução PBS usando um laboratório de limpar. Deixar simplesmente suficiente PBS no chip para manter a matriz SSLB hidratado.
- Para impedir a ligação não específica, adicionar 200 ul de 2 mg / ml de solução de BSA a matriz do chip SSLB. Deixe descansar por 1 hora em uma caixa umidificado.
- Com uma micropipeta, remover 200 mL de solução a partir do topo do chip de matriz SSLB.
- Adicione 200 ml de solução de toxina da cólera ao chip conjunto SSLB e deixe descansar por 1 hora em uma caixa umidificado.
- Lave cuidadosamente o chip conjunto SSLB com PBS a partir de um frasco de lavagem para remover qualquer toxina da cólera não ligado.
- Wick o excesso de PBS usando um laboratório de limpar. Antes de imagem de chip tampa com um pedaço 24 milímetros tampa x 40 mm.
- Matrizes de imagem com um microscópio vertical usando filtro define apropriado para os fluoróforos de interesse.
- Analisar a intensidade de fluorescência de SSLBs individuais em uma matriz usando a função de análise de partículas automatizada de software ImageJ.
- Compilar intensidades de fluorescência média de SSLBs individuais em histogramas que resumem as intensidades de SSLBs encontrados em uma determinada matriz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Quando SiO 2 pérolas são misturadas com uma solução de vesículas compostas por fosfolípidos, lípidos fluorescentes e outros lípidos, tais como gangliósidos, as vesículas se rompem na superfície do grânulo de SiO 2 para formar SSLBs, como mostrado esquematicamente na Figura 1A. Depois de lavar as SSLBs, uma gota de solução SSLB é colocada sobre uma matriz de micropoços, e os grânulos são deixadas assentar à superfície. (Figura 1b1) Isto também pode ser feito com uma suspensão de vesículas de fosfolípidos ou partículas de membranas naturais, que são mostrados na Figura 1b2. A imagem de fluorescência de vesículas fosfolipídicas adsorvido a um substrato de matriz micropoço é mostrado na Figura 1B3. Em seguida, o rodo PDMS é feito para deslizar suavemente sobre a superfície para remover qualquer SSLBs (Figura 1C1), vesículas ou partículas de membrana naturais (Figura 1C2), que não se contentou em micropoços. Isso resulta em uma matriz, em que cada SSLBmicropoços contém, no máximo, uma SSLB (Figura 1D1) ou uma matriz onde múltiplas vesículas ou partículas de membranas naturais são em cada micropoço (Figura 1d2). Uma imagem de uma micromatriz de composto marcado por fluorescência vesículas é mostrado na Figura 1d3.
.. Figura 1 Formação de SSLBs e SSLB montagem array (a) Ilustração de um SSLB composta por 3 tipos de lipídios em uma SiO2 talão: ovo PC (preto), Rho-DPPE (vermelho) e GM1 (azuis). (B1-d1) Fluxo de processo para a montagem de uma matriz SSLB mostrando SSLBs dispersas em uma matriz de micropoços (b1), o uso de um rodo PDMS para limpar a superfície do SSLBs não resolvido em micropoços (C1), ea matriz último SSLB (d1 ). (B2-D2 (B3) Um imagem de fluorescência de vesículas fosfolipídicas adsorvido sobre um substrato de micropoços correspondente à ilustração em (b2). (D3) Um imagem de fluorescência de uma micromatriz constituída por vesículas fosfolipídicas correspondentes à ilustração em (d2). Adaptado a partir de referências 20 e 21 e usadas com permissão da American Chemical Society.
Individuais SiO 2 contas suportes para SSLBs em micropoços foram fotografadas com microscopia eletrônica de varredura (MEV), tanto do ângulo superior vista e perspectivas transversais. Uma vista de topo de uma área de aproximadamente 15 mm x 15 mm é mostrado na Figura 2A, enquanto a Figura 2b mostra uma vista em corte transversal de uma única pérola imobilizada numamicropoços. A camada mais leve revestindo a microplaca é de 100 nm de Al 2 O 3 depositado por deposição de camadas atômicas para ajustar o diâmetro bem para que os poços são capazes de acomodar apenas contas individuais.
Imagens de microscopia eletrônica Figura 2. Digitalização de matrizes SSLB. (A) Uma micrografia eletrônica de uma área de 15 milímetros x 15 mm mostrando SSLB suportes talão imobilizados em matrizes de micropoços. (B) Um único diâmetro de 700 nm SSLB numa microplaca. O revestimento é de micropoços de Al 2 O 3, o qual é depositada a encolher a micropoços de modo que apenas os grânulos individuais podem se encaixar dentro. Adaptado da referência 20 e usadas com permissão da American Chemical Society.
Uma vez que as matrizes SSLB são preparados, eles podem ser visualizados por meio de microscopia de fluorescência.
Deposição sequencial dos diferentes tipos de SSLBs foi usada para criar matrizes com mais do que um tipo de SSLB, em que a identidade de SSLBs individuais foi determinada pela ausência ou presença de um receptor de toxina (GM1) e a sua ligação da toxina da cólera (CTx). O processo de montagem é a mesma que para um único tipo SSLB mas foi realizada uma segunda vez com uma identidade SSLB diferente. A concentração inicial de SSLBs foi 10x menor para reduzir a ocupação do primeiro tipo de SSLB e para permitir mais vagas para ser ocupado pelo segundo tipo de SSLB. Nas Figuras 3c-3e, uma matriz SSLB com dois tipos de SSLBs é mostrado. All dos SSLBs conter fluorescente vermelha Rho-DPPE (Figura 3c), mas apenas alguns dos SSLBs conter GM1, um gangliósido, que é o receptor para a subunidade B da CTX. Quando exposto a verde fluorescente Alexa 488-conjugado CTx, apenas os que contêm SSLBs GM1 fluorescência no canal verde (Fig. 3d). Quando as imagens vermelhas e verdes são mescladas, é possível determinar qual SSLBs conter GM1 (amarelo) e que não (vermelho) (Figura 3e).
Fluorescência imagiologia Figura 3. De matrizes SSLB. (A) Uma área mM 100 mm x 100 contendo 936 Rho-DPPE-rotulados SSLBs ovo PC. (B) Um campo claro e de fluorescência que mostra uma sobreposição SSLB com 76% dos micropoços ocupados. (Ce) Uma matriz contendo SSLB SSLBs que contêm Rho-DPPE(C), uma fracção de que também contêm o GM1, que é ligado por CTx Alexa-488 conjugado com (d). (E) Incorporação de canais vermelho e verde, onde fluorescência colocalized indica a presença de GM1 na SSLB. Os círculos azuis indicam que apenas SSLBs fluorescência vermelho, isto é, falta de GM1. Adaptado da referência 20 e usadas com permissão da American Chemical Society.
Dados de fluorescência a partir de matrizes SSLB foi analisada pela medição da intensidade de SSLBs individuais numa imagem. Os dados de intensidade SSLB de matrizes foram compilados em histogramas. Figura 4a mostra um exemplo de um histograma da análise de Rho-DPPE fluorescência a partir de uma matriz SSLB composto unicamente de SSLBs contendo PC de ovo e 1% molar de Rho-DPPE. Os dados apresentados na Figura 4a foram adquiridos por análise da imagem mostrada na Figura 3a. Encontramos as matrizes SSLB para ser robusto e estável durante pelo menos uma semana, quando refrigerada and submerso em tampão. As matrizes não perdeu qualquer intensidade de fluorescência, nem a ocupação das matrizes mudar ao longo de uma semana (Figura 4b).
Figura 4. (A) Histograma mostrando a distribuição da intensidade de fluorescência para a matriz SSLB mostrado na Figura 3a. A intensidade média para cada SSLB na matriz foi usado para compilar o histograma. A linha a cheio é um ajuste de Gauss para os dados. (B) A média de ocupação matriz (círculos pretos) e a intensidade de fluorescência (quadrados vermelhos) para uma matriz SSLB monitorizados ao longo de uma semana. Adaptado da referência 20 e usadas com permissão da American Chemical Society.
Fizemos matrizes compostas de SSLBs com várias concentrações de GM1 (0, 0,5, 1-And 2 mol%) e expô-los a uma concentração fixa de CTx, bem como as matrizes com SSLBs com concentrações de GM1 e expostos às concentrações variadas de CTx. A experiência foi depois utilizada para determinar a constante de dissociação em equilíbrio (Kd) para a ligação GM1/CTx. As matrizes SSLB com várias concentrações de GM1 foram expostas a 50 nM de Alexa-488 marcado com CTx durante 1 hora, em seguida, lavou-se e fotografada. A intensidade de histogramas para matrizes SSLB com 0,5-2% mol GM1 expostas a 50 nM de Alexa 488-conjugado CTx pode ser visto na Figura 5-A Figura 5b mostra a dependência linear da intensidade média de fluorescência sobre a concentração de GM1.. Quando a concentração de GM1 em SSLBs é fixada em 2% em mol e as matrizes SSLB são expostos a CTx variando de 16 pM a 158 nM, a resposta de ligação segue uma curva sigmoidal, como mostrado na Figura 5c. As curvas de ajuste a esses dados são baseados em dois modelos de ligação diferentes: a isoterma de Langmuir (Eq. 1) eo modo de Hill-Waudl (Eq. 2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
(1)
(2)
Onde F é a intensidade de fluorescência a uma dada concentração CTx, F max é a intensidade de fluorescência quando a ligação está saturado, [CTx] é a concentração CTx, K D e K H são as constantes de dissociação a partir de Langmuir e Hill-Waud encaixa, respectivamente , e n é o coeficiente de cooperatividade no modelo de Hill-Waud. O coeficiente de cooperatividade (n) calcula a quantidade de ligação multivalente, quando um n superiorum indica que cada molécula CTx se liga mais do que um GM1. A concentração de CTx em 0,5 x F max é a D ou K K H a interacção GM1/CTx. Em nossos experimentos foi calculado um K D de 1,6 ± 0,2 nM e K H de 1,4 ± 0,2 nm, com um valor de n de 1,3, indicando ligação cooperativa. As constantes de dissociação para a interacção GM1/CTx variar amplamente na literatura, que varia mais de 5 ordens de grandeza de 16:05 a 370 nM 26,27.
Figura 5. Ensaios sobre matrizes SSLB ligação CTx/GM1. (A) Os histogramas da intensidade de fluorescência de SSLBs individuais dentro de matrizes SSLB. As matrizes continham SSLBs com 0,5, 1 ou 2% em mol e GM1 foram expostas a 50 nM de Alexa 488 conjugado com CTx. Olinhas sólidas são encaixa gaussianas. (B) Lote de os meios de distribuição a partir de (a) como uma função da concentração de GM1. (C) As curvas de ligação que mostram os meios de distribuição a partir de matrizes contendo SSLBs com 2 mol% GM1 após exposição a Alexa-488 conjugado com CTx variando de 16 pM a 158 nM. As linhas são ajustes para a isoterma de Langmuir (vermelho) e Hill-Waud (azul) modelos de ligação. As barras de erro em (bc) representam os desvios padrão das distribuições de intensidade de fluorescência correspondente a cada ponto de dados. Adaptado da referência 20 e usadas com permissão da American Chemical Society.
Como mencionado anteriormente, é também possível formar arranjos com material biomembrana derivado de fontes naturais 21. As matrizes são formadas da mesma maneira, através da dispersão de partículas de membrana sobre um substrato de micropoços, em seguida, a limpeza da superfície de topo com o rodo para deixar para trás partículas de membrana do microfoneRowells. Figura 6 mostra exemplos de mielina e neuronais microarrays jangada lipídica. Na Figura 6a, partículas de mielina são etiquetados com o fluoróforo lipofílico FM1-43. Jangadas lipídicas são conhecidas por ser enriquecido em colesterol e gangliósidos, tais como GM1; assim, Alexa 488 conjugado com CTx liga-se fortemente a microarranjos de jangadas lipídicas, como mostrado na Figura 6b, enquanto estreptavidina marcada com fluorescência (SAPE) não se liga à matriz. (Figura 6c) Também criamos matrizes de banda, oferecendo mielina e jangada lipídica partículas ao substrato de micropoços com um chip microfluídico com 250 canais micrometros de largura. Após a administração de partículas, o chip de microfluidos foi separado a partir do substrato de microcavidades e o processo de rodo realizado como habitual. As matrizes de banda foram em seguida expostos a um anticorpo anti-IgM fluorescente oligodendrócitos (IgM O4), que se liga sulfatide encontrado na mielina. (Figura 7) A mielina e jangada lipídica tarja microarrays na figura 7 são mostrados no aumento dos níveis de ampliação, e no nível mais elevado de amplificação, é facilmente aparente que apenas IgM O4 liga aos microarrays mielina porque sulfatide está ausente das jangadas lipídicas.
Figura 6. Partícula Mielina e neuronais lipídios matrizes de partículas jangada. (A) Uma partícula de microarray de mielina, onde as partículas de mielina são processados fluorescente pelo fluoróforo lipofílico FM1-43. A linha tracejada indica o limite da área da matriz. (B) Lipid jangada microarray mostrando ligação CTx às partículas de jangada lipídica. (C) Lipid microarray jangada exposta a fluorescente estreptavidina-ficoeritrina (SAPE), mostrando pouca ou nenhuma ligação não específica. Adaptado da referência 21 e usadas com permissão da American Chemical Society.
Figura 7. Matrizes multicomponentes formado pela entrega microfluídicos de mielina e membranas neuronais jangada. (A) imagem de fluorescência após a mielina e balsas foram depositados via canais microfluídicos sobre o substrato microarray. As listras esquerda e direita conter mielina ea faixa do meio contém membranas neuronais jangada. As membranas são corados com FM1-43, que rotula todo o material lipídico. A barra de escala é de 250 m. (B) imagem de fluorescência das mesmas três listras após a aplicação do rodo PDMS e incubação com IgM O4. A barra de escala é de 250 m. (ce) imagens ampliadas das três listras que mostram que apenas IgM O4 liga aos microarrays de mielina: (c) tarja esquerda e (e) de banda direita. As barras de escala em panels ce são 30 mm. Adaptado da referência 21 e usadas com permissão da American Chemical Society.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neste trabalho é mostrar que monodispersas SiO 2 contas revestidas com camadas duplas lipídicas suportados podem ser dispostos em conjuntos de micropoços, sem a necessidade de ligandos alvo nas bicamadas lipídicas ou a superfície do substrato, e as matrizes podem ser usadas para caracterizar as interacções lípido-toxina. A nós constante de dissociação calculada para a ligação CTx/GM1 compara favoravelmente, dada a grande disparidade de valores na literatura, com um relatório anterior por Winter et al., Onde a montagem coloidal de esferas revestida de lipídios foi usado para calcular a constante de dissociação de cerca de 30 nM. Ajustando os dados para o modelo de ligação Hill-Waud, determinou-se que a interação CTx/GM1 é provável multivalente, o que está de acordo com os relatórios anteriores 28. A B (ligação gangliósido) subunidade de CTx existe como um pentâmero, com cada uma das cinco unidades capazes de se ligar a uma molécula de GM1 29; assim, não é surpreendente que mais do que uma sub-unidade pode ser ligada a dada difmobilidade usive de GM1 em EBSL 30.
Matrizes de grânulos quimicamente funcionalizados foram utilizados em outros estudos analíticos 31. Nestes tipos de experiências, os grânulos são normalmente imobilizadas em micropoços criada no final de fibras ópticas gravadas. Ensaios de fluorescência multiplex pode ser realizada nesta configuração pela mistura subpopulações de grânulos e imobilizando-as simultaneamente para a extremidade da fibra óptica 32. Em nosso ensaio multiplex (Figuras 3c-3-E), que imobilizado SSLBs opticamente codificados sequencialmente porque lipídios no SSLBs livres em solução pode ser transferido de um tipo de SSLB para outro 33. Enquanto isso adiciona etapas suplementares para a preparação de matrizes SSLB, não excessivamente demorado e é o método mais eficiente para as esferas funcionalizadas com lípidos. Temos também espacialmente codificada matrizes por deposição de diferentes populações SSLB em matrizes de micropoços adjacentes, e que não há cros observávels-talk entre as matrizes 20. Para reduzir o tempo de preparação da amostra, matrizes SSLB podem ser preparadas com antecedência e usado quando for desejado. Foi testada a estabilidade das matrizes ao longo de uma semana e não encontrou nenhuma degradação significativa das matrizes, em termos de intensidade de fluorescência, o que indica que a quantidade de material lípido sobre as SSLBs não muda com o tempo. Além disso, a ocupação matriz não muda ao longo do tempo, o que sugere que uma vez SSLBs são imobilizadas, eles não separar os micropoços (Figura 4b).
Além de esferas revestidas com bicamadas lipídicas sintéticas, também têm utilizado este método para criar matrizes de partículas naturais de membrana 21. Neste trabalho, nós imobilizada partículas mielina derivados de cérebro de ratinho, bem como partículas de membranas neuronais, tais como a fracção de lípido-jangada. Fomos capazes de utilizar as matrizes de identificar moléculas de superfície de membrana específico de células por anticorpo binding (figuras 6 e 7). Além disso, quando o tamanho dos micropoços foi reduzida à escala nano e a superfície de topo da matriz foi revestido com ouro, fomos capazes de utilizar ressonância de plasmon de superfície para monitorar a ligação de anticorpos a partículas de membrana de mielina, sem a utilização de marcadores fluorescentes. A maior diferença entre a utilização de SSLB e vesículas de membrana ou partículas naturais para formar matrizes é que, no caso de SSLBs a quantidade exacta de material de membrana em cada micropoço é conhecido porque apenas um único grânulo pode encaixar em cada poço. Com vesículas de membranas naturais ou partículas, não há nenhuma maneira de controlar a quantidade de material em cada micropoço, excepto para ajustar a concentração inicial de vesículas ou de partículas. No entanto, a variabilidade de poço-a-poço do número de vesículas não é muito grande em comparação com a distribuição de diâmetros de vesículas 21.
Finalmente, este método pode ter divERSE aplicações futuras. Junesch e colegas empregaram um rodo para remover nanopartículas durante coloidal litografia nanofabricação 34. Matrizes de membrana pode ser formada para simular os contactos célula-célula para investigar adesão focal celular 35 ou examinar a ligação de proteínas sensível à curvatura da membrana 36. Além disso, o uso de grânulos porosos iria facilitar a inclusão de proteínas transmembranares nas bicamadas lipídicas 37 ou entrega local de carga armazenada para células cultivadas sobre um substrato de matriz biomembrana. A plataforma de microcavidades é fabricado por fotolitografia, o que permite uma flexibilidade de design. Aqui nossas matrizes tinha geometria hexagonal, mas quadrado, linear, ou outras geometrias poderiam ser criados com diferentes dimensões de periodicidade e variedade de micropoços para investigar os efeitos espaciais de adesão focal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm concorrentes interesses financeiros para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios a SHO dos Institutos Nacionais de Saúde (R01 GM092993), a Fundação Nacional de Ciência (NSF CARREIRA Award e DBI 0.964.216), o Escritório de Pesquisa Naval (ONR) Programa Jovem Pesquisador eo Prêmio Parceria Minnesota de Biotecnologia e Genômica Médica. Fabricação de dispositivos foi realizada na Universidade de Minnesota Nanofabricação Center (NFC), que recebe o apoio da NSF por meio da Rede de Infra-estrutura Nacional de Nanotecnologia. Este trabalho também foi apoiado por subsídios para MR dos Institutos Nacionais de Saúde (NS048357, R21 NS073684), a National Multiple Sclerosis Society (CA1060A11), o Applebaum, Hilton, Peterson e Sanford Fundações ea família McNeilus. Os autores agradecem a Hyungsoon Im de assistência com ilustrações e Shailabh Kumar de assistência com microscopia eletrônica de varredura.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4 inch silicon wafers | University Wafer | 425 | |
| Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist | MicroChem | SPR955-CM | |
| Shipley MICROPOSIT CD-26 developer | MicroChem | CD-26 | |
| i-line stepper | Canon | 2500 i3 stepper | |
| Vision 320 reactive ion etcher | Advanced Vacuum | Vision 320 RIE | |
| Deep trench reactive ion etcher | Plasma Therm | SLR-770 | |
| Atomic layer depostion system | Cambridge NanoTech | Savannah | |
| Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Egg phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt | Avanti Polar Lipids | 810158C | |
| Monosialoganglioside GM1 | Avanti Polar Lipids | 860065P | |
| Silica beads | Bangs Laboratories | SS03N/4666 | Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter. |
| Cholera toxin B-subunit, Alexa 488-conjugate | Molecular Probes | C-34775 | |
| Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate | R&D Systems | NL1326R | |
| FM1-43 | Molecular Probes | T-3136 | |
| Eppendorf MiniSpin centrifuge | Fisher Scientific | 05-401-09 |
References
- Drews, J. Drug discovery: A Historical Perspective. Science. 287 (5460), 1960-1964 (1126).
- Cooper, M. A. Advances in Membrane Receptor Screening and Analysis. J. Mol. Recognit. 17 (4), 286-315 (2004).
- Voskuhl, J., Ravoo, B. J. Molecular Recognition of Bilayer Besicles. Chem. Soc. Rev. 38 (2), 495-505 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (1002).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid Supported Lipid Bilayers: From Biophysical Studies to Sensor Design. Surf. Sci. Rep. 61 (10), 429-444 (2006).
- Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early Steps of Supported Bilayer Formation Probed by Single Vesicle Fluorescence Assays. Biophys. J. 83 (6), 3371-3379 (2002).
- Krysinski, P., Zebrowska, A., Michota, A., Bukowska, J., Becucci, L., Moncelli, M. R. Tethered Mono- and Bilayer Lipid Membranes on Au and Hg. Langmuir. 17 (13), 3852-3857 (2001).
- Li, L., Wang, H. F., Cheng, J. X. Quantitative Coherent anti-Stokes Raman Scattering Imaging of Lipid Distribution in Coexisting Domains. Biophys. J. 89 (5), 3480-3490 (2005).
- Richter, R. P., Brisson, A. R. Following the Formation of Supported Lipid Bilayers on Mica: A Study Combining AFM, QCM-D, and Ellipsometry. Biophys. J. 88 (5), 3422-3433 (2005).
- Dahlin, A., Zäch, M., Rindzevicius, T., Käll, M., Sutherland, D. S., Höök, F. Localized Surface Plasmon Resonance Sensing of Lipid-Membrane-Mediated Biorecognition Events. J. Am. Chem. Soc. 127 (14), 5043-5048 (2005).
- Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. Phase Separation of Lipid Membranes Analyzed with High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry. Science. 313 (5795), 1948-1951 (2006).
- Groves, J. T., Boxer, S. G. Micropattern Formation in Supported Lipid Membranes. Acc. Chem. Res. 35 (3), 149-157 (2002).
- Bally, M., Bailey, K., Sugihara, K., Grieshaber, D., Vörös, J., Stadler, B. Liposome and Lipid Bilayer Arrays Towards Biosensing Applications. Small. 6 (22), 2481-2497 (2010).
- Groves, J. T., Dustin, M. L. Supported Planar Bilayers in Studies on Immune Cell Adhesion and Communication. J. Immunol. Methods. 278 (1-2), 19-32 Forthcoming.
- Yang, T. L., Jung, S. Y., Mao, H. B., Cremer, P. S. Fabrication of Phospholipid Bilayer-Coated Microchannels for On-Chip Immunoassays. Anal. Chem. 73 (2), 165-169 (2001).
- Groves, J. T., Ulman, N., Boxer, S. G. Micropatterning Fluid Lipid Bilayers on Solid Supports. Science. 275 (5300), 651-653 (1997).
- Hovis, J. S., Boxer, S. G. Patterning and Composition Arrays of Supported Lipid Bilayers by Microcontact Printing. Langmuir. 17 (11), 3400-3405 (2001).
- Yee, C. K., Amweg, M. L., Parikh, A. N. Direct Photochemical Patterning and Refunctionalization of Supported Phospholipid Bilayers. J. Am. Chem. Soc. 126 (43), 13962-13972 (2004).
- Kelly, C. V., Craighead, H. G. Nanofabrication for the Analysis and Manipulation of Membranes. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1356-1366 (2012).
- Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Oh, S. H. High-Density Arrays of Submicron Spherical Supported Lipid Bilayers. Anal. Chem. 84 (19), 8207-8213 (2012).
- Wittenberg, N. J., et al. Facile Assembly of Micro- and Nanoarrays for Sensing with Natural Cell Membranes. ACS Nano. 5 (9), 7555-7564 (2011).
- Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels. Angew. Chem. Int. Ed. 42 (45), 5580-5583 (2003).
- Kalyankar, N. D., et al. Arraying of Intact Liposomes into Chemically Functionalized Microwells. Langmuir. 22 (12), 5403-5411 (2006).
- Dahlin, A. B., Jonsson, M. P., Höök, F. Specific Self-Assembly of Single Lipid Vesicles in Nanoplasmonic Apertures in Gold. Adv. Mater. 20 (8), 1436-1442 (2008).
- Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using Patterned Supported Lipid Membranes to Investigate the Role of Receptor Organization in Intercellular Signaling. Nat. Protoc. 6 (4), 523-539 (2011).
- Kuziemko, G. M., Stroh, M., Stevens, R. C. Cholera Toxin Binding Affinity and Specificity for Gangliosides Determined by Surface Plasmon Resonance. Biochemistry. 35 (20), 6375-6384 (1996).
- Moran-Mirabal, J. M., Edel, J. B., Meyer, G. D., Throckmorton, D., Singh, A. K., Craighead, H. G. Micrometer-Sized Supported Lipid Bilayer Arrays for Bacterial Toxin Binding Studies Through Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Biophys. J. 89 (1), 296-305 (2005).
- Shi, J. J., Yang, T. L., Kataoka, S., Zhang, Y. J., Diaz, A. J., Cremer, P. S. GM1 Clustering Inhibits Cholera Toxin Binding in Supported Phospholipid Membranes. J. Am. Chem. Soc. 129 (18), 5954-5961 (2007).
- Gill, D. M. The Arrangement of Subunits in Cholera Toxin. Biochemistry. 15 (6), 1242-1248 (1021).
- Weng, K. C., Kanter, J. L., Robinson, W. H., Frank, C. W. Fluid Supported Lipid Bilayers Containing Monosialoganglioside GM1: A QCM-D and FRAP study. Colloid Surface B. 50 (1), 76-84 (1016).
- Walt, D. R. Fibre Optic Microarrays. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 38-50 (2010).
- Bake, K. D., Walt, D. R. Multiplexed Spectroscopic Detections. Annu. Rev. Anal. Chem. 1 (1), 515-547 (2008).
- Kundu, J., Levin, C. S., Halas, N. J. Real-Time Monitoring of Lipid Transfer Between Vesicles and Hybrid Bilayers on Au Nanoshells Using Surface Enhanced Raman Scattering (SERS). Nanoscale. 1 (1), 114-117 (2009).
- Junesch, J., Sannomiya, T., Dahlin, A. B. Optical Properties of Nanohole Arrays in Metal-Dielectric Double Films Prepared by Mask-on-Metal Colloidal Lithography. ACS Nano. 6 (11), 10405-10415 (2012).
- Wu, M., Holowka, D., Craighead, H. G., Baird, B. Visualization of Plasma Membrane Compartmentalization with Patterned Lipid Bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (38), 13798-13803 (2004).
- Hatzakis, N. S., Bhatia, V. K., Larsen, J., Madsen, K. L., Bolinger, P. Y., Kunding, A. H., Castillo, J., Gether, U., Hedegard, P., Stamou, D. How Curved Membranes Recruit Amphipathic Helices and Protein Anchoring Motifs. Nat. Chem. Biol. 5 (11), 835-841 (2009).
- Roizard, S., Danelon, C., Hassaine, G., Piguett, J., Schulze, K., Hovius, R., Tampe, R., Vogel, H. Activation of G-Protein-Coupled Receptors in Cell-Derived Plasma Membranes Supported on Porous Beads. J. Am. Chem. Soc. 133 (42), 16868-16874 (2011).
