Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

الدهون طبقة ثنائية الحويصلة انشاء طريق ميكروفلويديك النفث

Published: February 21, 2014 doi: 10.3791/51510

Summary

النفث ميكروفلويديك ضد واجهة قطرات الدهون طبقة ثنائية يوفر وسيلة موثوقة لتوليد الحويصلات مع السيطرة على التماثل الغشاء، إدراج البروتينات عبر الغشاء، والتغليف من المواد. هذه التقنية يمكن تطبيقها على دراسة مجموعة متنوعة من النظم البيولوجية حيث يتم المطلوب الجزيئات الحيوية مجزأة.

Abstract

يعرض أسفل إلى أعلى البيولوجيا التركيبية نهجا جديدا للتحقيق وإعادة تشكيل النظم البيوكيميائية، وربما الحد الأدنى من الكائنات الحية. هذا المجال الناشئ يشارك المهندسين والكيميائيين وعلماء الأحياء، والفيزياء لتصميم وتجميع المكونات البيولوجية الأساسية في المجمع، وأنظمة تعمل من أسفل إلى أعلى. هذه النظم من أسفل إلى أعلى قد يؤدي إلى تطوير خلايا اصطناعية للاستفسارات البيولوجية الأساسية والعلاجات المبتكرة 1،2. يمكن الحويصلات unilamellar العملاقة (GUVs) بمثابة منصة نموذجية لعلم الأحياء الاصطناعية نظرا لهيكل غشاء الخلية مثل والحجم. النفث ميكروفلويديك، أو microjetting، هو الاسلوب الذي يسمح لتوليد GUVs مع حجم تسيطر عليها، وتكوين الغشاء والبروتين عبر الغشاء التأسيس، والتغليف 3. المبدأ الأساسي لهذه الطريقة هو استخدام متعددة، البقول السوائل عالية التردد التي تم إنشاؤها بواسطة جهاز النافثة للحبر بيزو دفعتها إلى تشوه وعلقت لطبقة ثنائية IPID إلى GUV. هذه العملية هي أقرب إلى فقاعات الصابون تهب من فيلم الصابون. من خلال تغيير تركيبة الحل متدفق، وتكوين الحل يشمل، و / أو المكونات المدرجة في طبقة ثنائية، يمكن للباحثين تطبيق هذه التقنية لخلق الحويصلات حسب الطلب. وتصف هذه الورقة الإجراء لتوليد الحويصلات بسيطة من طبقة ثنائية واجهة الحبرية بواسطة microjetting.

Introduction

أصبح من الواضح بشكل متزايد أن بيولوجيا الخلية هي مشكلة متعددة المستويات التي تنطوي على دمج فهمنا من الجزيئات إلى الخلايا. بالتالي، مع العلم بالضبط كيفية عمل الجزيئات بشكل فردي ليست كافية لفهم السلوكيات الخلوية المعقدة. هذا يرجع جزئيا إلى وجود سلوكيات الناشئة من أنظمة متعددة المكونات، كما يتضح من إعادة تشكيل الأكتين التفاعل مع شبكة حويصلات الدهنية طبقة ثنائية والتجمع المغزل الإنقسامية في القيطم استخراج وديناميات المكانية الأجهزة انقسام الخلايا البكتيرية 6. طريقة واحدة لاستكمال نهج الاختزالية للتشريح العمليات الجزيئية من المنظومات الحية هو اتخاذ النهج المعاكس من إعادة تشكيل السلوكيات الخلوية باستخدام مجموعة صغيرة من المكونات البيولوجية. جزء هام من هذا النهج ينطوي على التغليف موثوقة من الجزيئات الحيوية في حجم المحصورة، سمة أساسية من سمات خلية.

e_content "> العديد من الاستراتيجيات المتبعة لتغليف الجزيئات الحيوية لدراسة نظم بيوميمتيك. النظام الأكثر ملاءمة من الناحية البيولوجية هو الأغشية طبقة ثنائية المادة الدهنية، والتي تحاكي القيود البيوكيميائية والفيزيائية التي تفرضها غشاء البلازما الخلية تشكيل حويصلات unilamellar العملاقة (GUVs) من خلال electroformation واحدة من أكثر التقنيات المستخدمة على نطاق واسع لتوليد GUV 14، وعادة ما يكون الفقراء العائد التغليف نظرا لتعارضه مع العازلة الملح عالية 8. أيضا يتطلب Electroformation أحجام عينة كبيرة (> 100 ميكرولتر)، والتي يمكن أن يكون مشكلة للعمل مع البروتينات المنقى ، ويشتمل على نحو غير فعال جزيئات كبيرة بسبب صعوبة نشرها بين طبقات الدهون متباعدة عن كثب. وقد وضعت عدة نهج ميكروفلويديك لتوليد حويصلات الدهنية. طرق مستحلب مزدوجة، التي تمر من خلال مكونات واجهات اثنين بين طبقات المياه نفط المياه (W / O / W)، تعتمد على التبخر من فوالمذيبات latile لدفع تشكيل طبقة ثنائية الدهن 9. وقد استخدم البعض الآخر خط التجميع ميكروفلويديك التي تنتج تيار مستمر من الدهون طبقة ثنائية حويصلات أو 10 في خطوتين مستقلة 11. قمنا بتطوير تقنية بديلة تقوم على تطبيق بسرعة نبضات السائل ضد واجهة قطرات طبقة ثنائية لإنتاج 12 GUVs من حجم تسيطر عليها، وتكوينها، والتغليف. نهجنا، والمعروفة باسم النفث ميكروفلويديك، ويقدم المزايا مجتمعة من عدة تقنيات الجيل حويصلة القائمة، وتوفير نهج لإنشاء أنظمة الجزيئية البيولوجية وظيفية للتحقيق في مجموعة متنوعة من المشاكل البيولوجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تصنيع غرفة اللانهاية

  1. تصميم غرفة اللانهاية (يسمى لشكله) باستخدام الكمبيوتر التصميم بمساعدة (CAD) والبرمجيات، وحفظ الملف بحيث أنه متوافق مع قطع الليزر. لإنشاء هذا الشكل، منفصلة دائرتين بقطر 0.183 في بمسافة مركز إلى مركز 0.15 بوصة قطع غرفة من 1/8- 3/16 في الاكريليك واضحة مع قطع الليزر. شكل اللانهاية يسهل الحبرية واجهة تشكيل طبقة ثنائية والاستقرار.
  2. حفر 1/16 من خلال ثقب في حافة الغرفة الاكريليك على شكل ما لا نهاية أيضا. كرر على الجانب المقابل. قطع مستطيل صغير من الاكريليك ورقة 0.2 مم مع مقص أو قاطع ليزر لتكون بمثابة الأسفل إلى الآبار.
  3. تطبيق طبقة رقيقة ولكن كاملة من التجفيف السريع لاصق على جانب واحد من 0.2 مم الاكريليك والغراء إلى الجزء السفلي من الغرفة. عقد 0.2 مم الاكريليك بإحكام في مكان ضد السفلي من الغرفة والاستغناءالغراء في واجهة للسماح للالغراء لإنشاء ختم ولكن تجنب يغطي مساحة العرض. تأكد من محاذاة الاكريليك بحيث حافته هو مطاردة مع حافة جدار الغرفة، وأنها تغطي تماما انقطاع غرفة اللانهاية. وهذا سوف يسمح لاختراق طائرة كافية ومنع التسرب من البئر.
  4. قطع اثنين من قطع صغيرة من المطاط الطبيعي لتغطية الثقوب المحفورة. تطبيق التجفيف السريع لاصق حول الثقب. وضع المطاط خلال ثقب والصحافة في جميع المجالات مع زوج من ملقط لتأمين. تكرار لكلا الثقوب المحفورة. تأكد من أن كافة الاتصالات لصقها هي الاختام كاملة وذلك لمنع أي تسرب.
  5. باستخدام 23 G، 1 في إبرة، كزة حفرة في المطاط الطبيعي على جانبي الغرفة لتسهيل الإدراج من طرف النافثة للحبر كهرضغطية.

2. إعداد التجريبية

حل تخزين الدهون في الكلوروفورم الأسهم في الفريزر -20 درجة مئوية. لهذه الدراسة، إما 1،2-diphytanoوقد استخدم YL-SN-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) أو 1،2-dioleoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (DOPC). وعادة ما يتم إعداد 2 مل من 25 ملغ / مل حل الدهون في هذا البروتوكول وسوف تستمر لمدة شهرين عند تخزينها في -20 درجة مئوية.

  1. ل resuspend الدهون في ن ديكان، ونقل لأول مرة من قارورة الأسهم إلى وعاء زجاجي صغير، والجافة بلطف تحت الأرجون أو النيتروجين. عقد الجرة في زاوية بينما التجفيف لفضح المزيد من المساحة السطحية للغاز، والسماح للدهون لتجف بشكل أسرع.
  2. مع غطاء الجرة ثمل قليلا فقط على، والسماح للحل المجففة للجلوس تحت فراغ في مجفف لمدة 1-2 ساعة. ثم تضيف ن ديكان لresolubilize الدهون في 25 ملغ / مل. دوامة الحل لفترة وجيزة الدهون ويصوتن ذلك في sonicator الحمام لمدة 15 دقيقة. تخزين الدهون تشكيلها في ن ديكان في -20 درجة مئوية.
  3. إعداد محلول المخزون السكروز. في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، إضافة 900 ميكرولتر من 300 ملي السكروز و 100 ميكرولترمن 1٪ ميثيل (MC). يضاف لزيادة اللزوجة ميثيل من الحل، والذي يساعد في النفث. خطوة اختيارية: إضافة 1 ميكرولتر من اختياري داكنة اللون صبغة الطعام أو الخرز الفلورسنت لتقديم مزيد من التباين أو مضان في مجال التصوير، على التوالي. هذا الحل هو حل 300 الميلي أسمول السكروز مصممة لتتناسب الأسمولية الخلوية وتوفير النقيض خلال microjetting.
  4. رسم الحل في التخلص منها 1 مل حقنة بلاستيكية. في حين عقد المحقنة مع طرف متجهة لأعلى، ونفض الغبار رمح مرارا لطرد أي فقاعات نحو الحافة، ودفع المكبس لإخراج الهواء المحبوس. يجب التأكد من اخلاء جميع الهواء من الحقنة قبل المتابعة، لأنها سوف تتداخل مع انكماش كهرضغطية المناسبة المسؤولة عن النفث.
  5. تثبيت مرشح 0.22 ميكرون على نهاية الحقنة. لمنع الهواء من الوقوع في التصفية، عقد حقنة عموديا ودفع المكبس حتى يتم تشكيل قطرات أعلاه غيض. ملاحظة: وتم العثور على 33 ملم وحدة القطر تصفية حقنة لتعمل بشكل أفضل، ولكن المرشحات البديلة صغيرة مثل 3 مم مرشح حقنة يمكن استخدامها للحد من حجم القتلى.
  6. فك محول ليور الإناث من النافثة للحبر، والضغط بشكل آمن في مكانه على نهاية التصفية. مرة أخرى، إخراج السوائل لمنع احتباس الهواء. المسمار في الجزء العلوي من النافثة للحبر. السوائل يجب أن السفر إلى غيض من النافثة للحبر بعد تعلق تماما.

3. تستعد ومعدات

  1. باستخدام الخامس المشبك، جبل الجمعية حقنة على المسرح المجهر. نعلق السلك من النافثة للحبر إلى وحدة تحكم النافثة للحبر. ملاحظة: تم بناء المرحلة مخصصة لهذا البروتوكول، في حين أن مرحلة التصميم يمكن تحديد من قبل المستخدم، فمن الأهمية بمكان أن يكون التحكم XYZ مستقلة عن حقنة والسيطرة س ص من صاحب العينة.
  2. تحديد التكبير وضرورية لتحقيق مزيج عدسة التصوير المطلوب. هنا يتم استخدام هدفا 10X 10X والعدسة. استخدام كاميرا عالية السرعة (≥ 1،000 إطارا في الثانية) لتصور النفث وتوليد حويصلة. قبل التصوير، وأداء الكاميرا اللازمة المعايرة. استخدام الصورة القائمة على صناعة السيارات في الزناد ضمن برنامج الكاميرا لبدء التقاط الصور.
  3. جبل غرفة اللانهاية على خشبة المسرح المجهر. تأمين غرفة عن طريق تسجيل في مكانه على المسرح.
  4. محاذاة بعناية غيض النافثة للحبر مع فتحة ثقب في المطاط الطبيعي (انظر الشكل 1B). للقيام بذلك، وجعل النافثة للحبر على مقربة من القاعة وضبط المواقع بالعين، ثم إجراء تعديلات أكثر دقة من خلال عدسة المجهر. المضي قدما بحذر، والحركات الخشنة يمكن أن تلحق الضرر غيض النافثة للحبر.
  5. مرة واحدة يتم محاذاة النافثة للحبر، دعم التجمع حقنة بعيدا عن غرفة لمنع أي ضرر للالنافثة للحبر أثناء التحميل من الآبار. تأكد من أن حركة النافثة للحبر في اتجاه واحد بحيث يظل الانحياز مع ثقب في الغشاء.
  6. الصحافة بلطف على plunGER من التجمع حقنة حتى أشكال قطرات صغيرة في فوهة النافثة للحبر. هذا وسوف توفر بعض احداهما الأولي.
  7. إدخال المعلمات النفث. لموجة ثنائي القطب شبه منحرف، واستخدام المعلمات التالية: تردد 20 كيلوهرتز نبض، 3 الوقت μsec الارتفاع، 35 μsec مدة النبض، 3 الوقت μsec الخريف، 65 V الجهد المطبق (نبض السعة)، و 100 طائرة في البقول الزناد (عدد النبض) . ومع ذلك، فإن الجهد المطبق (نبض السعة) وعدد النبض (البقول طائرة في الزناد) يمكن أن تختلف إلى التحكم في حجم الحويصلة.

4. الجيل حويصلة

  1. إضافة 25-30 ميكرولتر حل الدهون العالقة في ن ديكان إلى غرفة ما لا نهاية، وتغطي كامل السطح من كلا البئرين.
  2. إضافة 25 ميكرولتر الجلوكوز (من نفس الأسمولية هو الحل السكروز) إلى الحافة الخارجية من واحد أيضا، pipetting لببطء وسلاسة. على الترسيب، ينبغي أن تشكل قطرة من الجلوكوز، لأن الجلوكوز والدهون الحل لا يختلطان. إضافة 25 أخرى1، ل الجلوكوز إلى البئر المقابلة، الأمر الذي سيجعل انخفاض آخر وتشكل طبقة ثنائية الغشاء الدهني في منتصف الغرفة في غضون 5-10 دقيقة.
  3. إدراج النافثة للحبر من خلال المطاط الطبيعي، وتوجيه ذلك بعناية نحو واجهة قطرات طبقة ثنائية. الاقتراب من طبقة ثنائية ببطء، كما قدم النافثة للحبر وسوف تحل محل وحدة التخزين، ويمكن أن تمزق طبقة ثنائية.
  4. عندما النافثة للحبر هو داخل ~ 200 ميكرون، تطبيق النفث مع إعدادات موضح في الخطوة 3.8. المسافة من طبقة ثنائية قد تختلف أساسا اعتمادا على الجهد والنبض العدد، بين غيرها من المعالم. يوصي هذا البروتوكول يتزايد ببطء إعدادات (الجهد وعدد النبض) ومراقبة طبقة ثنائية تشوه.

5. تنظيف معدات

  1. فصل التجمع حقنة من مرحلة المجهر، والتخلص من 1 مل حقنة بلاستيكية والتصفية.
  2. لتنظيف النافثة للحبر، ونضح الحلول التالية في النظام عن طريق غمس طرف في محلولن 7-10X كل: 70٪ من الإيثانول و 2٪ Neutrad حل في ماء دافئ، و 70٪ من الإيثانول، وده 2 O. إذا لم النافثة للحبر تناسب بشكل آمن على ماصة الطموح، وقطع طرف ماصة لتشكيل محول.
  3. تجف الغرفة مع الأنسجة. وضع غرفة اللانهاية في كوب 250 مل مع 2٪ ت / ت Neutrad في المياه الدافئة، ويصوتن لمدة 5-10 دقيقة. بعد صوتنة، يجف تماما الآبار تحت الهواء المضغوط. أي رطوبة في الآبار يمكن أن تعرض للخطر الاستقرار في غشاء الدهون طبقة ثنائية، لذلك فمن المستحسن أيضا أن يتم وضع الغرف في الفرن على 60 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لقد جمعنا الإعداد النفث ميكروفلويديك على المجهر مضان مقلوب التقليدية مع مرحلة العرف تجميعها من أجزاء تشكيله وميكرومتر دليل (الشكل 1). توصيف النافثة للحبر توفر نظرة ثاقبة في عملية توليد حويصلة. متفاوتة المسافة بين فوهة النافثة للحبر والدهون طبقة ثنائية يؤثر على القوة المستخدمة لإحداث تشوه الغشاء. وثيقة القرب من طبقة ثنائية تركز التيار النفاث ويمنع الغشاء من تشتيت الطاقة بعيدا عن نقطة من الجيل حويصلة. الزيادات السفر دوامة مع الجهد المطبق على المحرك كهرضغطية، بما يتفق مع توقعاتنا (الشكل 2). تشكيل الحويصلة وممثل متدفق وتظهر الحويصلات في الشكل 3. يبين الشكل 3A تسلسل صورة ممثل لتشكيل الحويصلة بواسطة microjetting. بعد تشكيل والاستقرار حويصلة يميل إلى تختلف مع حويصلة diameteص، حيث كانت الحويصلات أصغر أكثر استقرارا.

الشكل 1
الشكل 1. توضيحات من هذه التقنية والمعدات. (أ) رسم تخطيطي للعملية النفث يحركها كهرضغطية ضد اجهة الحبرية طبقة ثنائية. دفعت النبضات متعددة في تعاقب سريع تشكيل هيكل حلقة الدوامة التي بتشوهات طبقة ثنائية لإنتاج GUVs. ويظهر تصوير اليمنى السفلى موقع ترسب الجلوكوز وأبعاد البئر. مرة واحدة تم إضافة حل الدهون إلى غرفة ما لا نهاية، يتم إضافة 25 ميكرولتر الجلوكوز إلى الحواف الخارجية من البئر، أولا (1) في، ثم (2) في. (ب) تجميع شنت حقنة، ومنصة مخصصة عقد، وغرفة اللانهاية. يتم تأمين غرفة في مكان، ويتم محاذاة غيض من النافثة للحبر مع الحول ه في المطاط الطبيعي على جانب البئر. (ج) المجهر ومرحلة كاملة مخصصة التجمع. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الرقم 2
الشكل 2. توصيف للحبر (أ) تتداخل النبضات النافثة للحبر السريع في 20 كيلو هرتز (50 نبضات في 55 V سعة النبض) لتشكيل عصابة دوامة واحدة. (ب) الإزاحة الأمامية طائرة السائل بوصفها وظيفة من الوقت أكثر من نبض السعة النطاق (40-65 V) لعدد النبض ثابتة (200 البقول). اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

دائما "> الرقم 3
الرقم 3. انشاء الحويصلة. صور من عملية توليد حويصلة والعديد من الحويصلات إنتاجها. (أ) تشويه للطبقة ثنائية واجهة الحبرية (DPhPC) التي تنتجها البقول السريع من الحل يسبب غشاء لقرصة قبالة وتشكيل GUV. (ب) العديد من الحويصلات إنشاؤها باستخدام النفث ميكروفلويديك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد تم تطوير العديد من التقنيات لتوليد حويصلة، بما في ذلك electroformation، مستحلب، والجيل الحبرية 14-16. ومع ذلك، وتقنيات تجريبية جديدة ضرورية للسماح لتصميم النظم البيولوجية مع التشابه المتزايد لنظم المعيشة. وعرضت وسائل ميكروفلويديك على وجه الخصوص زيادة مستوى السيطرة التي تحكم unilamellarity الغشاء، monodispersity من حجم، ومحتويات داخلية 17،18، وبذلك نماذج حويصلة أقرب إلى علم الأحياء. وعلاوة على ذلك، أظهرت توصيف والتجريب باستخدام النفث ميكروفلويديك الإدماج الفعلي للبروتينات غشاء المنحى، وعدم تناسق الغشاء، والتغليف 3،13.

هذا الأسلوب واضح ومباشر، ولكن تشمل بعض الخطوات التي ينبغي أن تؤخذ بحذر. كل من الاكريليك ورقة والمطاط الطبيعي يجب أن تشكل الاختام كاملة مع الغرفة خلال تلفيق ما لا نهاية. خلاف ذلك، فإن الآبار على شكل تسرب ما لا نهاية وصISK الاستقرار طبقة ثنائية. أثناء إعداد التجريبية، يجب أن يكون الباحث متأكدا تماما لإخلاء التجمع حقنة من الهواء، في البداية وبعد ربط كل مكون. فقاعات داخل هذه الجمعية إنشاء وحدة تخزين للانضغاط داخل الطائرة وتخفيف أو ينفي تأثير النفث من المحرك كهرضغطية. بينما تستعد المعدات، والقلق الرئيسي هو الإضرار فوهة الحبر الهشة. أخيرا، وترسب من الجلوكوز يتطلب أكبر قدر من الاهتمام خلال الخطوات السابقة جيل حويصلة، وهذا يضع طبقة ثنائية المادة الدهنية لالنفث اللاحقة.

الجيل الحويصلة بواسطة النفث ميكروفلويديك هو موثوق بها وقابلة للتكرار، ولكن التناقضات بين الحبرية تتطلب بعض الألفة وتحديد المعايير والثوابت. في تجربتنا، وإدخال فوهة النافثة للحبر في غرفة اللانهاية قبل النفث قد تصل إلى عدة تهجير ميكرولتر من الجلوكوز تبعا لأبعاد فوهة، مما ينتج عنه منحنى طفيف في طبقة ثنائية بعيدا عنالنافثة للحبر. عن طريق تشتيت بشكل غير متناسب على محلول الجلوكوز عند وضع أصلا طبقة ثنائية، وهذا التأثير يمكن أن يعوض وسوف طبقة ثنائية مستو ينتج. هذا ليس فقط يعزز الاستقرار طبقة ثنائية ولكنه يسمح أيضا للسيطرة أفضل على تشكيل الحويصلة. تم استخدام فوهة قطرها 20 ميكرومتر من النافثة للحبر للحصول على نتائج مبين في هذه الورقة. وأوصى قطر الفتحة من 10-20 ميكرون. ينصح التقليل من الاهتزازات أيضا؛ استخدمت القواطع المطاط بسيطة لدعم الجدول المجهر وتخفيف الاهتزازات المختبر.

على الرغم من أن هذا البروتوكول ينطبق على كثير من الدهون، وقد تم اختيار DPhPC للكيمياء في خاصة وعالية الاستقرار طبقة ثنائية. وكانت نسبة الدهون الأولية الأخرى اختبار 1،2-dipalmitoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (DPPC) و1،2-dioleoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (DOPC). نسبيا، كان DPhPC نزعة أقوى لتشكيل الحبرية متسقة واجهة طبقة ثنائية، وإنتاج الحويصلات unilamellar. عند الأوليتشكيل، وكان طبقة ثنائية في هذا البروتوكول على سماكة واضحة بسبب واجهة nonplanar وإدماج النفط. شكل قطرات مائية شكلت طبقة ثنائية المنحنية، وهذا بدا كأنه سمك في مجال معين من الرأي. يسمح DPhPC منطقة الاتصال الأولي على واجهة بين اثنين من قطرات لتوسيع، والقيادة النفط بعيدا عن طبقة ثنائية. بسبب هذه العملية مواتية بقوة، أكثر وأكثر من منطقة الاتصال بين اثنين من قطرات أصبحت طبقة ثنائية، وانخفض سمك ملاحظتها مع مرور الوقت. تم اختبار هذا النمو في المنطقة تحت طبقة ثنائية تقلب طول طبقة ثنائية؛ تم تعديل تصميم غرفة الأولية قليلا (تصميم الجيل الثاني يتكون من دائرتين قطرها 0.15 في مفصولة مسافة مركز إلى مركز 0.13 في) إلى أحجام أصغر تستلزم وأسفرت عن واجهة طبقة ثنائية أصغر. كل من التصميم الجديد والأولي يسمح لتوليد حويصلة دقيقة، ولكن لا أظهر تصميم dominميزة النمل في طبقة ثنائية رقيق. وكان آخر اختبار احداهما الأمثل الكمبيوتر التي تسيطر عليها تطبيقها على كهرضغطية النافثة للحبر. في حين أن هذا أعطى المزيد من السيطرة الكمية على معدل التدفق في حين النفث، ولم يتم استخدام ذلك في جميع أنحاء غالبية التجريب.

يقدم هذا الأسلوب مزايا الجمع بين عدة تقنيات القائمة. يمكن أن تتولد GUVs متعددة في الترددات العالية (200 هرتز ~) نظرا لتركيز عال من جزيئات الدهون، على الرغم من أن الجيل حويصلة السريع لم يكن التركيز في هذا العمل. منذ هذه التقنية الطائرات ضد طبقة ثنائية الدهن واحد، ومن المتوقع unilamellarity الغشاء وقد لوحظ. بالإضافة إلى ذلك، مجموعة واسعة من الحلول التي يمكن أن تكون مغلفة مستقلة عن خصائص المذاب محددة مثل الوزن الجزيئي أو تهمة، وبالتالي تمكين المزيد من التطبيقات المحتملة 17. أيضا، وذلك بسبب حجم الحويصلات شكلت (مجموعة هو ممكن من> 10 ميكرون إلى <400 ميكرون)، والمراقبة الدقيقة من قبل التقليديةتقنيات SCOPY غير كافية 13.

يمكن تطبيقها النفث ميكروفلويديك لمجموعة متنوعة من المشاكل البيولوجية. واحدة مثال محدد هو الميكانيكا الحيوية الخلوية، والتشوه للGUVs يجعلها أداة مثالية لدراسة توليد القوة والذات الجمعية من شبكات الأكتين مغلفة التي أظهرت تأثيرات مثيرة للاهتمام عند تجميعها على سطح GUV 4،19. وتشمل تطبيقات إضافية نظم لتقديم الأدوية، المفاعلات الحيوية خلية الحجم، وأنظمة معيارية لعلم الأحياء الاصطناعية، الفيزياء الحيوية، ومجموعة متنوعة من غيرها من المجالات في العلوم الأساسية، والصناعة، والطب حيث يتم المطلوب الجزيئات الحيوية مجزأة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

أعلن عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر مايك Vahey من مختبر فليتشر في جامعة كاليفورنيا، بيركلي لتقديم المشورة بشأن المعلمات microjetting. وقد رعت هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح HL117748 DP2-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Piezoelectric Inkjet MicroFab Technologies MJ-AL-01-xxx xxx denotes orifice diameter in microns
Jet Drive III Controller MicroFab Technologies CT-M3-02
High-speed camera Vision Research MiroEX2
DPhPC lipid in chloroform Avanti 850356C Ordered in small aliquots in vials
33 mm PVDF filters, 0.2 µm Fisher Scientific SLGV033RS
1 ml Syringes Fisher Scientific 14823434
n-Decane Acros Organics 111871000
Glucose Acros Organics 410950010
Sucrose Sigma-Aldrich S7903-1KG
Methylcellulose Fisher Scientific NC9084958
1/8 in Acrylic McMaster Carr 8560K239 CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request
0.2 mm Acrylic Astra Products Clarex clear 001
Acrylic Cement TAP Plastics 10693
Loctite 495 Superglue Fisher Scientific NC9011323
Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive Strobels Supply 30765
Natural rubber McMaster Carr 85995K14
Custom stage homemade N/A CAD designs are available upon request

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature reviews. Mol. Cell Biol. 10, 644-650 (2009).
  2. Yeh, B. J., Lim, W. A. Synthetic biology: lessons from the history of synthetic organic chemistry. Nat. Chem. Biol. 3, 521-525 (2007).
  3. Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A. 108, 9431-9436 (2011).
  4. Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nat. Phys. 4, 789-793 (2008).
  5. Brown, K. S., et al. Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle. J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).
  6. Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro. Science. 320, 789-792 (2008).
  7. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Disc. Chem. Soc. 81, 301-311 (1986).
  8. Bucher, P., Fischer, A., Luisi, L. P., Oberholzer, T., Walde, P. Giant Vesicles as Biochemical Compartments: The Use of Microinjection Techniques. Langmuir. 14, 2712-2721 (1998).
  9. Shum, H. C., Lee, D., Yoon, I., Kodger, T., Weitz, D. A. Double emulsion templated monodisperse phospholipid vesicles. Langmuir. 24, 7651-7653 (2008).
  10. Matosevic, S., Paegel, B. M. Stepwise Synthesis of Giant Unilamellar Vesicles on a Microfluidic Assembly Line. J. Am. Chem. Soc. 133, 2798-2800 (2011).
  11. Hu, P. C. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic Fabrication of Asymmetric Giant Lipid Vesicles. ACS Appl. Mater. Inter. 3, 1434-1440 (1021).
  12. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. J. Am. Chem. Soc. 130, 5878-5879 (2008).
  13. Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Brochard-Wyart, F., Fletcher, D. A. Inkjet formation of unilamellar lipid vesicles for cell-like encapsulation. Lab Chip. 9, 2003-2009 (2009).
  14. Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).
  15. Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. J. Colloid Interface Sci. 376, 119-125 (2012).
  16. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet Microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
  17. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4697-4702 (2008).
  18. Osaki, T., Yoshizawa, S., Kawano, R., Sasaki, H., Takeuchi, S. Lipid-coated microdroplet array for in vitro protein synthesis. Anal. Chem. 83, 3186-3191 (2011).
  19. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers. Biophys. J. 91, 4064-4070 (2006).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 84، النفث ميكروفلويديك، البيولوجيا الاصطناعية، وحويصلة التغليف، دهن طبقة ثنائية، إعادة الكيمياء الحيوية، والحويصلات unilamellar العملاقة
الدهون طبقة ثنائية الحويصلة انشاء طريق ميكروفلويديك النفث
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Coyne, C. W., Patel, K., Heureaux,More

Coyne, C. W., Patel, K., Heureaux, J., Stachowiak, J., Fletcher, D. A., Liu, A. P. Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting. J. Vis. Exp. (84), e51510, doi:10.3791/51510 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter