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Bioengineering

Lipid Bilayer Vesicle Geração Usando Microfluidic jateamento

Published: February 21, 2014 doi: 10.3791/51510

Summary

Jorrando Microfluidic contra uma bicamada lipídica interface de gota fornece uma maneira confiável para gerar vesículas com controle sobre a assimetria da membrana, a incorporação de proteínas transmembrana, e encapsulamento do material. Esta técnica pode ser aplicada ao estudo de uma grande variedade de sistemas biológicos, onde são desejados biomoléculas compartimentadas.

Abstract

Biologia sintética Bottom-up apresenta uma nova abordagem para investigar e reconstituir sistemas bioquímicos e, potencialmente, organismos mínimos. Este campo emergente envolve engenheiros, químicos, biólogos e físicos para projetar e montar componentes biológicos básicos em funcionamento de sistemas complexos, a partir de baixo para cima. Tais sistemas bottom-up pode levar ao desenvolvimento de células artificiais para investigações biológicas fundamentais e terapias inovadoras 1,2. Vesículas unilamelares gigantes (GUVs) pode servir como um modelo para a plataforma de biologia sintética, devido à sua estrutura da membrana celular-como e tamanho. Jacto de microfluidos, ou microjetting, é uma técnica que permite a geração de GUVs com tamanho controlado, a composição da membrana, a incorporação da proteína transmembranar, e encapsulação 3. O princípio de base deste método é o uso de vários impulsos de fluido, de alta-frequência gerados por um dispositivo de jacto de tinta piezo-actuada para deformar uma l suspensobicamada IPID num GUV. O processo é semelhante ao soprar bolhas de sabão a partir de uma película de sabão. Através da variação da composição da solução de hidromassagem, a composição da solução que engloba, e / ou os componentes incluídos na camada dupla, os investigadores podem aplicar esta técnica para criar vesículas personalizadas. Este artigo descreve o procedimento para gerar vesículas simples a partir de uma bicamada interface de gota por microjetting.

Introduction

Tornou-se cada vez mais claro que a biologia celular é um problema multi-escala que envolve a integração de nossa compreensão a partir de moléculas às células. Consequentemente, sabendo exatamente como as moléculas trabalhar individualmente não é suficiente para compreender os comportamentos celulares complexos. Isto é em parte devido à existência de comportamentos emergentes de sistemas multi-componentes, como exemplificado pela reconstituição de interação da rede de actina com vesículas bicamada lipídica 4, montagem do fuso mitótico em Xenopus extrair 5 e dinâmica espacial de bactérias máquinas divisão celular 6. Uma maneira de complementar a abordagem do reducionista de dissecar os processos moleculares dos sistemas vivos é tomar o caminho inverso de reconstituir comportamentos celulares usando um conjunto mínimo de componentes biológicos. Uma parte crítica dessa abordagem envolve o encapsulamento confiável de biomoléculas em um volume confinado, uma característica fundamental de uma célula.

e_content "> Várias estratégias existentes para o encapsulamento de biomoléculas para estudar sistemas biomiméticos. O sistema mais biologicamente relevante é membranas de bicamadas de lípidos, que imitam os constrangimentos físicos e bioquímicos impostas pela membrana plasmática da célula. Formação de vesículas unilamelares gigantes (GUVs) por eletropolimerização 7, uma das técnicas mais amplamente utilizadas para a geração de GUV 14, tem, tipicamente, uma baixa eficiência de encapsulação devido à sua incompatibilidade com tampão de alto teor salino 8. eletropolimerização também requer grandes volumes de amostra (> 100 mL), o qual pode ser um problema para o trabalho com proteínas purificadas , e de forma ineficiente incorpora moléculas grandes, devido à dificuldade de difusão entre as camadas lipídicas espaçados. Várias abordagens de microfluidos para gerar vesículas lipídicas foram desenvolvidos. Os métodos de emulsão dupla, que passam através de duas componentes de interfaces entre as camadas de água-óleo-água (W / O / W), baseia-se na evaporação de um volatile solvente para conduzir a formação de bicamada lipídica 9. Outros utilizaram uma linha de montagem de microfluidos, que produz um fluxo contínuo de vesículas lipídicas de duas camadas 10 ou em duas etapas independentes de 11. Desenvolvemos uma técnica alternativa baseada em rápida aplicação de impulsos de fluido de encontro a uma bicamada de interface gota 12 para produzir GUVs de tamanho controlado, composição, e de encapsulamento. A nossa abordagem, conhecida como jacto de microfluidos, oferece as vantagens combinadas de várias técnicas de geração de vesículas existentes, proporcionando uma abordagem para a criação de sistemas de biomoléculas funcionais para investigar uma variedade de problemas biológicos.

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Protocol

1. Infinito Câmara Fabricação

  1. Projetar a câmara infinito (nomeado para a sua forma), utilizando um software de desenho assistido computador (CAD), e salve o arquivo de tal forma que seja compatível com um cortador de laser. Para criar esta forma, separados dois círculos de diâmetro 0,183, em por uma distância centro-a-centro de 0,15 cm Corte da câmara de 1/8- 3/16 em acrílico transparente com o cortador a laser. A forma infinito facilita interface de formação em bicamada gota e estabilidade.
  2. Broca de 1/16 em buraco através da borda da caixa de acrílico para o infinito em forma de poço. Repita no lado oposto. Corte um pequeno rectângulo de uma folha de acrílico 0,2 milímetros com uma tesoura ou um cortador a laser para servir como uma base para os poços.
  3. Aplicar uma camada fina, mas completa da cola de secagem rápida, para um lado do acrílico 0,2 mm e colá-la para o fundo da câmara. Segurar o acrílico 0,2 milímetros firmemente no lugar contra o fundo da câmara e dispensara cola na interface para permitir que a cola para criar uma vedação, mas evitar que cobre a área de visualização. Certifique-se de alinhar o acrílico de modo que sua borda fique nivelada com a borda da parede da câmara e cobre completamente o recorte câmara infinito. Isto irá permitir a penetração de jacto suficientes e evitar fugas do poço.
  4. Corte dois pequenos pedaços de borracha natural para cobrir os furos. Aplicar a cola de secagem rápida ao redor do buraco. Coloque a borracha em cima do buraco e de imprensa em todas as áreas com um par de fórceps para fixar. Repita o procedimento para os dois furos. Certifique-se de que todas as ligações são coladas juntas completas, de modo a impedir qualquer fuga.
  5. Usando um 23 L, 1 em agulha, fazer um buraco na borracha natural em ambos os lados da câmara a fim de facilitar a inserção da ponta do jacto de tinta piezoeléctrica.

2. Preparação Experimental

Solução estoque loja de lipídios em clorofórmio em um freezer -20 ° C. Para este estudo, ou 1,2-diphytanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPhPC) ou 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) foi usado. 2 ml de 25 mg / ml de solução de lípido é tipicamente preparado neste protocolo e vai durar durante dois meses, quando armazenada a -20 ° C.

  1. Para voltar a suspender o lípido em n-decano, primeiro transferi-lo de um frasco de estoque para um pequeno frasco de vidro, e seca suavemente sob árgon ou azoto. Segurar o frasco num ângulo durante a secagem para expor mais a área de superfície para o gás, permitindo o lípido para secar mais rapidamente.
  2. Com a tampa do frasco apenas ligeiramente enroscada, permitir que a solução foi seca ao sentar-se sob vácuo num exsicador durante 1-2 horas. Em seguida, adicionar n-decano, para ressolubilizar o lípido de 25 mg / ml. Vortex a solução brevemente lipídico e sonicate-lo em um banho de ultra-sons para 15 min. Armazenar o lípido reconstituído em n-decano, a -20 ° C.
  3. Prepara-se uma solução estoque de sacarose. Num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, adicionar 900 ul de 300 mM de sacarose e 100 ulde 1% de metilcelulose (MC). A metilcelulose é adicionado para aumentar a viscosidade da solução, o que ajuda no jacto. Etapa opcional: Adicionar um opcionais 1 ml de corante alimentar de cor escura ou partículas fluorescentes para dar mais contraste ou fluorescência em imagem, respectivamente. Esta solução é uma solução de 300 mOsm sacarose concebido para corresponder a osmolaridade celular e para proporcionar contraste durante microjetting.
  4. Desenhar a solução numa seringa de 1 ml descartável de plástico. Enquanto segura a seringa com a ponta virada para cima, apertar o eixo várias vezes para expulsar as bolhas em direção à ponta, e empurre o êmbolo para retirar o ar aprisionado. Certifique-se de evacuar todo o ar da seringa antes de prosseguir, uma vez que irá interferir com a contração adequada piezoelétrico responsável por jateamento.
  5. Instalar um filtro de 0,22 um na extremidade da seringa. Para evitar que o ar fique preso no filtro, segure a seringa na vertical e empurre o êmbolo até que uma gota se forma acima da ponta. Nota: A33 milímetros de diâmetro unidade de filtro de seringa foi encontrada a funcionar melhor, mas os filtros alternativos tão pequeno como um diâmetro de filtro seringa de 3 mm podem ser utilizados para reduzir o volume morto.
  6. Soltar o adaptador Luer fêmea do jato de tinta, e pressione-o firmemente no lugar durante o fim do filtro. Mais uma vez, ejetar fluido para evitar a retenção de ar. Aperte a parte superior do jato de tinta. Fluid deve viajar para a ponta do jato de tinta depois que ele é completamente conectado.

3. Preparando o Equipamento

  1. Usando um v-braçadeira, montar o conjunto de seringa na platina do microscópio. Ligue o fio do jato de tinta para o controlador de jato de tinta. Nota: A fase de costume foi construído para este protocolo, enquanto que a concepção fase pode ser determinada pelo utilizador, que é crítico para o controle xyz independente da seringa e controlo xy do suporte da amostra.
  2. Determinar a ampliação e combinação necessária para atingir a lente de imagem desejada. Aqui, uma objetiva de 10X e 10X ocular são usados. Use uma câmera de alta velocidade (≥ 1.000 fps) para visualizar a jorrar e geração de vesícula. Antes de imagem, executar necessário calibração da câmara. Utilize auto-trigger com base em imagens dentro do software da câmera para iniciar a captura de imagem.
  3. Monte a câmara infinito para o palco microscópio. Fixe a câmara gravando-o no lugar no palco.
  4. Alinhe cuidadosamente a ponta de jato de tinta com o buraco perfurado na borracha natural (ver Figura 1b). Para fazer isso, trazer a jato de tinta próximo da câmara e ajustar o posicionamento por olho, em seguida, fazer ajustes mais precisos através da lente do microscópio. Proceda com cautela, como movimentos grosseiros pode danificar a ponta de jato de tinta.
  5. Uma vez que o jacto de tinta é alinhada, voltar o conjunto da seringa para fora da câmara para impedir qualquer dano para o jacto de tinta, durante o carregamento dos poços. Certifique-se que o movimento do jato de tinta é unidirecional para que ele permaneça alinhado com o furo na membrana.
  6. Pressione suavemente sobre a plunger do conjunto da seringa até que uma pequena gota de formas no bico jato de tinta. Isso irá fornecer algum contrapressão inicial.
  7. Introduza os parâmetros de jateamento. Para uma onda bipolar trapezoidal, utilize os seguintes parâmetros: frequência de 20 kHz de pulso, tempo de 3 ms ascensão, 35 ms de duração de pulso, tempo de 3 ms queda, 65 V de tensão aplicada (amplitude de pulso), e 100 pulsos por jato de gatilho (número de pulsos) . No entanto, a tensão aplicada (a amplitude do pulso) e o número de impulsos (pulsos de jacto por gatilho) pode ser variado para controlar o tamanho das vesículas.

4. Vesícula Geração

  1. Adicionar 25-30 uL solução lipídica suspensa em n-decano, para a câmara de infinito, que cobre toda a superfície de ambos os poços.
  2. Adicionar 25 mL de glicose (de mesma osmolaridade que a solução de sacarose) para a borda externa de um bem, pipetagem lenta e suavemente. Após a deposição, uma queda de glicose devem formar, porque a glicose e de lipídios não se misturam. Adicione mais 251; l de glicose para o bem de frente, o que fará com que uma gota e formar a membrana de dupla camada de lípido no meio da câmara dentro de 5-10 min.
  3. Insira a jato de tinta através da borracha natural e, cuidadosamente, orientá-la para a bicamada interface de gota. Aproxime-se da bicamada lentamente, como a jato de tinta introduzida deslocará volume e pode romper a bicamada.
  4. Quando o jato de tinta é dentro de ~ 200 mM, aplique o jateamento com as definições descritas no passo 3.8. A distância a partir da bicamada pode variar dependendo principalmente da quantidade de tensão e de impulso, entre outros parâmetros. Este protocolo recomenda aumentando lentamente configurações (tensão e número de pulsos) e observando a deformação bicamada.

5. Limpeza do equipamento

  1. Separe o conjunto seringa do estágio do microscópio, e dispor do 1 ml seringa de plástico e filtro.
  2. Para limpar a jato de tinta, aspirar as seguintes soluções na ordem mergulhando a ponta na solution 7-10x cada: etanol a 70%, solução a 2% Neutrad em água quente, etanol a 70%, e ddH 2 O. Se a jato de tinta não se encaixa com segurança na pipeta de aspiração, corte uma ponta de pipeta para formar um adaptador.
  3. Seca-se a câmara com o tecido. Coloque a câmara de infinito em um copo de 250 ml com 2% v / v Neutrad em água morna, e sonicado por 5-10 min. Após sonicação, seque cuidadosamente os poços sob ar comprimido. Qualquer humidade em poços pode comprometer a estabilidade da membrana de bicamada lipídica, de modo que também é recomendável que as câmaras são colocadas num forno a 60 ° C durante 15 min.

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Representative Results

Nós montamos uma configuração jorrando microfluídicos em um microscópio de fluorescência invertido convencional com um palco personalizado montado a partir de peças usinadas e micrômetros manuais (Figura 1). Caracterização do jato de tinta fornece insights sobre o processo de geração de vesícula. Variando a distância entre o bico de jacto de tinta e bicamada lipídica afecta a força aplicada para provocar a deformação da membrana. Perto da bicamada concentra a corrente de jacto e impede a membrana a partir de dispersão de energia de distância a partir do ponto de geração das vesículas. Os aumentos de vórtice de viagens com a voltagem aplicada ao actuador piezoeléctrico, consistente com as expectativas (figura 2). Formação de vesículas e representativo de hidromassagem vesículas são mostrados na Figura 3. Figura 3a mostra uma sequência representativa de imagem para a formação de vesícula pelo microjetting. Após a formação, a estabilidade das vesículas tende a variar com vesícula diameter, em que as vesículas mais pequenas são mais estáveis.

Figura 1
Figura 1. Ilustração da técnica e do equipamento. (A) esquemática do processo de jateamento-driven piezoelétrico contra a bicamada interface de gota. Vários pulsos empurrado para fora em rápida sucessão formar uma estrutura em anel vórtice que deforma a bicamada para produzir GUVs. Representação canto inferior direito mostra a localização da deposição de glicose e dimensão do poço. Depois solução de lípido foi adicionado à câmara de infinito, 25 ul de glucose é adicionada para as arestas periféricas do bem, primeiro em (1), em seguida, em (2). (B) O conjunto montado seringa, segurando plataforma personalizada e câmara infinito. A câmara é fixada no seu lugar, e a ponta do jacto de tinta estiver alinhado com o hol e em que a borracha natural, no lado do poço. (C) O conjunto microscópio e estágio costume completo. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 2
Figura 2. Caracterização do jacto de tinta. (A) impulsos rápidos de jacto de tinta a 20 kHz (50 pulsos a 55 V de amplitude de pulso) se sobrepõem para formar um único anel de vórtice. (B) Líquido deslocamento jato frente em função do tempo ao longo do pulso faixa de amplitude (40-65 V) para o número de pulso fixo (200 pulsos). Clique aqui para ver imagem ampliada.

sempre "> Figura 3
Figura 3. Vesicle Generation. Imagens do processo de geração da vesícula e várias vesículas produzidas. (A) Deformação da bicamada interface de gota (DPhPC) produzido por pulsos rápidos de solução causar a membrana para beliscar fora e formar uma GUV. (B) Muitas vesículas gerados utilizando jateamento microfluídicos.

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Discussion

Muitas técnicas têm sido desenvolvidas para a produção de vesículas, incluindo eletropolimerização, emulsão, e de geração de gotículas 14-16. No entanto, novas técnicas experimentais são necessários para permitir a concepção de sistemas biológicos com a crescente semelhança com os sistemas vivos. Métodos microfluídicos em particular, têm oferecido um aumento do nível de controle que regem unilamellarity membrana, monodispersity de tamanho e conteúdo interno 17,18, trazendo modelos vesícula mais perto de biologia. Além disso, a caracterização e experimentação utilizando jateamento microfluídicos mostrou efetiva incorporação de proteínas de membrana orientados, a assimetria da membrana, e encapsulamento 3,13.

Esta técnica é simples, mas inclui algumas etapas, onde o cuidado deve ser tomado. Tanto a folha de acrílico e borracha natural devem formar selos completas com a câmara infinito durante a fabricação. Caso contrário, os poços em forma de infinito vai vazar e restabilidade bicamada ISK. Durante a preparação experimental, o pesquisador deve ter certeza de evacuar completamente o conjunto da seringa de ar, inicialmente e depois de anexar cada componente. Bubbles dentro desta assembléia criar um volume compressível dentro do jato e mitigar ou anular o efeito de jateamento do atuador piezoelétrico. Enquanto preparando o equipamento, a principal preocupação está danificando o bico de jato de tinta frágil. Finalmente, a deposição de glicose exige mais atenção durante as etapas anteriores de geração de vesícula, tal como este estabelece a bicamada lipídica para jacto subsequente.

Geração Vesicle com jato de microfluídica é confiável e repetível, no entanto, discrepâncias entre injetores exigem alguma familiaridade e parametrização. Na nossa experiência, a introdução do bocal de jacto de tinta para dentro da câmara anterior para o infinito de jacto pode deslocar-se para vários microlitros de glucose em função das dimensões dos bocais, produzindo uma ligeira curvatura na bicamada de distância a partir dea jato de tinta. Por desproporcionalmente dispersar a solução de glicose quando originalmente institui a bicamada, este efeito pode ser compensado e uma bicamada planar será o resultado. Isto não só melhora a estabilidade bicamada, mas também permite um melhor controle sobre a formação de vesículas. Um orifício de diâmetro de 20 um de jacto de tinta foi utilizada para obter os resultados apresentados no presente documento. Recomenda-se um orifício de diâmetro de 10-20 ^ m. A minimização das vibrações também é recomendada; recortes de borracha simples foram usadas para suportar a mesa de microscópio e amortecer as vibrações de laboratório.

Embora este protocolo é aplicável para muitos lípidos, DPhPC foi escolhido para a sua composição química e em particular a estabilidade a alta bicamada. Outros lípidos primários testados foram de 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) e 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC). Comparativamente, DPhPC teve uma tendência mais forte para formar uma gota de interface bicamada consistente e para produzir vesículas unilamelares. Após a inicialformação, da bicamada neste protocolo tinha uma espessura aparente devido a uma interface não-plana e a incorporação de óleo. A forma das gotículas aquosas formada uma bicamada curvo, e este apareceu como uma espessura num dado campo de visão. DPhPC permitiu a zona de contacto inicial na interface entre as duas gotas de expandir, óleo de condução afastado da bicamada. Devido a este processo energeticamente favorável, mais e mais da zona de contacto entre as duas gotas tornou-se uma camada dupla, e da espessura observável diminuiu ao longo do tempo. Este crescimento na região de bicamada foi testado sob variabilidade do comprimento da camada dupla, o design inicial câmara foi ligeiramente ajustada (a segunda geração de criação consistiu de dois círculos de diâmetro 0,15 em separado por uma distância centro-a-centro de 0,13 in) para exigir volumes menores e resultou em uma interface bicamada menor. Tanto o design novo e inicial permitido para a geração de vesícula preciso, ainda nem projeto mostrou um dominvantagem formiga em bicamada desbaste. Uma outra optimização testado foi contrapressão controlado por computador aplicada a jacto de tinta piezoeléctrica. Enquanto este deu um controlo mais quantitativa sobre a taxa de fluxo de jacto, enquanto, que não foi utilizado ao longo da maioria da experimentação.

Este método proporciona as vantagens combinadas de várias técnicas existentes. Várias GUVs pode ser gerado em alta frequência (aproximadamente 200 Hz), devido à alta concentração de partículas lipídicas, embora a geração rápida de vesículas não foi o foco deste trabalho. Uma vez que esta técnica de jactos contra uma única bicamada lipídica, unilamellarity membrana é esperado e foi observada. Além disso, uma grande variedade de soluções pode ser encapsulado independente das propriedades do soluto específicas tais como peso molecular ou de carga, permitindo, assim, mais as aplicações potenciais 17. Além disso, devido ao tamanho das vesículas formadas (uma faixa é possível de> 10 mM de <400 um), por observação de micro convencionaltécnicas SCOPY é adequada 13.

Jacto de microfluidos pode ser aplicada a uma variedade de problemas biológicos. Um exemplo específico é a biomecânica celulares, a deformabilidade de GUVs torna uma ferramenta ideal para estudar a montagem e a geração de forças de auto redes de actina encapsulados que mostrou efeitos interessantes, quando montado sobre a superfície de um GUV 4,19. Outras aplicações incluem sistemas de entrega de drogas, biorreatores do tamanho de células e sistemas modulares para a biologia sintética, biofísica, e uma variedade de outros campos da ciência básica, indústria e medicina, onde são desejados biomoléculas compartimentadas.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Agradecemos a Mike Vahey do Lab Fletcher, da Universidade da Califórnia, em Berkeley para aconselhamento sobre os parâmetros microjetting. Este trabalho foi patrocinado pelo NIH conceder DP2 HL117748-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Piezoelectric Inkjet MicroFab Technologies MJ-AL-01-xxx xxx denotes orifice diameter in microns
Jet Drive III Controller MicroFab Technologies CT-M3-02
High-speed camera Vision Research MiroEX2
DPhPC lipid in chloroform Avanti 850356C Ordered in small aliquots in vials
33 mm PVDF filters, 0.2 µm Fisher Scientific SLGV033RS
1 ml Syringes Fisher Scientific 14823434
n-Decane Acros Organics 111871000
Glucose Acros Organics 410950010
Sucrose Sigma-Aldrich S7903-1KG
Methylcellulose Fisher Scientific NC9084958
1/8 in Acrylic McMaster Carr 8560K239 CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request
0.2 mm Acrylic Astra Products Clarex clear 001
Acrylic Cement TAP Plastics 10693
Loctite 495 Superglue Fisher Scientific NC9011323
Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive Strobels Supply 30765
Natural rubber McMaster Carr 85995K14
Custom stage homemade N/A CAD designs are available upon request

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Coyne, C. W., Patel, K., Heureaux, J., Stachowiak, J., Fletcher, D. A., Liu, A. P. Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting. J. Vis. Exp. (84), e51510, doi:10.3791/51510 (2014).

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