Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Mikroakışkan jeti kullanarak çift katlı lipid Vesikül Üretimi

Published: February 21, 2014 doi: 10.3791/51510

Summary

Bir damlacık arayüz lipid ikili tabakasına karşı mikroakışkan jeti zar asimetri, zar proteinlerinin dahil edilmesi, ve malzeme kapsülleme üzerinde kontrol ve veziküllerin üretilmesi için güvenilir bir yöntem sağlar. Bu teknik, bölümlere biyomoleküllerin istenen biyolojik sistemlerin çeşitli çalışma uygulanabilir.

Abstract

Aşağıdan yukarıya sentetik biyoloji potansiyel biyokimyasal sistemleri ve, minimal organizmalar soruşturma ve yeniden yapılandırmak için yeni bir yaklaşım sunuyor. Bu gelişmekte olan bir alan aşağıdan yukarıya karmaşık, işleyen sistemlere temel biyolojik bileşenlerini tasarlamak ve oluşturmak için mühendisleri, kimyagerler, biyologlar, ve fizikçileri yürütmektedir. Bu gibi alt-up sistemleri temel biyolojik öğrenmek ve yeni tedavilerin 1,2 yapay hücre gelişimine neden olabilir. Dev tek tabakalı veziküller (GUVs) nedeniyle hücre benzeri zar yapısı ve boyutu sentetik biyoloji için bir model platform olarak hizmet edebilir. Mikroakışkan jeti veya microjetting, kontrollü boyutu, zar kompozisyonu, transmembran protein dahil edilmesi, ve kapsülleme 3 GUVs üretimi sağlayan bir tekniktir. Bu yöntemin temel ilkesi, bir süspansiyon haline l deforme edilmesi için bir piezo-mürekkep püskürtme çalıştırılan cihazı tarafından oluşturulan birden çok, yüksek frekanslı darbe sıvı kullanılmasıdırBir GUV içine IPID iki tabakalı. Süreç bir sabun filmden sabun baloncukları üfleme benzer. Jeti çözeltisi kapsayan çözeltisinin kompozisyon ve / veya bileşenlerin bileşimi değiştirilerek ikili katmanın dahil, araştırmacılar özelleştirilmiş vezikülleri oluşturmak için bu tekniği uygulayabilir. Bu kağıt microjetting bir damlacık arayüzü bilayeri basit veziküller oluşturmak için prosedürü açıklar.

Introduction

Bu hücre biyolojisi moleküllerin hücrelere anlayışımızı entegre içeren çok-ölçekli bir sorun olduğunu giderek daha açık hale gelmiştir. Sonuç olarak, moleküller tek tek çalışmak nasıl tam bilmeden kompleks hücresel davranışları anlamak için yeterli değildir. Bu 5 özü Xenopus lipid iki katmanlı kesecikler 4, mitotik iğ takımı ile aktin ağ etkileşim yeniden oluşturulması ile örneklendiği gibi, kısmen çok bileşenli sistemlerin ortaya çıkan davranış varlığına ve bakteriyel hücre bölünmesi makine 6 mekânsal dinamiği. Canlı sistemlerin moleküler süreçleri diseksiyon indirgemeci yaklaşımını tamamlamak için tek yolu, biyolojik bileşenlerin en az bir dizi kullanarak hücresel davranışları yeniden yapılandırma tersi bir yaklaşım almaktır. Bu yaklaşımın önemli bir parçası, bir kapalı hacim içinde biyomoleküllerin güvenilir kapsülleme, bir hücrenin önemli bir özelliği içerir.

e_content "> birkaç strateji biomimetik sistemlerin çalışılması için biyomoleküllerin kapsülleyici için vardır. biyolojik olarak en uygun sistem, hücrenin plazma zarının tarafından uygulanan biyokimyasal ve fiziksel kısıtlamaları taklit eder. electroformation 7 tarafından dev tek katmanlı veziküller (GUVs) oluşturulması lipid iki katmanlı membranlar, olduğu, saflaştırılmış proteinler ile çalışmak için bir sorun olabilir GUV nesil 14 için en yaygın kullanılan tekniklerden biri, tipik olarak yüksek tuz tamponu 8 ile uyumsuzluk nedeniyle kötü kapsülleme verim vardır. Electroformation de büyük örnek hacimleri gerektirir (> 100 ul), ve verimsiz yakın aralıklı lipid tabakaları arasında difüzyon zorluğu nedeniyle büyük molekülleri kapsar. lipid veziküllerin üretilmesi için çeşitli yaklaşımlar mikroakışkan. W / O (katmanlar, su-yağ-su arasında iki arayüzleri üzerinden geçiş bileşeni çift emülsiyon yöntemleri geliştirilmiştir / W), bir vo buharlaşması dayanırlipid iki katmanlı oluşum 9 sürücüye latile solvent. Diğer lipid iki katmanlı veziküller 10 ya da iki bağımsız adımda 11 içinde sürekli bir akış üreten bir mikroakışkan montaj hattı kullanılmıştır. Biz hızla kontrollü boyutu, kompozisyon ve kapsülleme GUVs üretmek için bir damlacık arayüz çift-katlı 12 karşı sıvı darbeleri uygulamadan dayalı alternatif bir teknik geliştirdiler. Microfluidic jeti olarak bilinen bizim yaklaşım, biyolojik sorunları çeşitli araştırılması için fonksiyonel biyomoleküler sistemleri yaratmak için bir yaklaşım sağlayarak, mevcut birkaç vezikül üretim teknikleri kombine avantajlar sunuyor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Infinity Odası Fabrikasyon

  1. Bir bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanılarak (şekli adını) sonsuzluk odasını tasarlayın ve bir lazer kesici ile uyumlu şekilde dosyayı kaydedin. Lazer kesici ile açık olarak akrilik 1/8- 3/16 arasındaki bölmeyi kesme kriteri: 0.15 'lik bir merkez-merkez mesafe ile de bu şekil, çapı 0,183 ayrı iki daire oluşturmak. Sonsuzluk şekli damlacık arayüzü iki tabakalı oluşumunu ve istikrar kolaylaştırır.
  2. Sonsuzluk şeklindeki oyuğa akrilik odasının kenarı boyunca bir 1/16 bir delik delin. Karşı tarafta tekrarlayın. Makas ile bir 0.2 mm akrilik levha ya da bir alt oyuklara olarak hizmet etmek üzere bir lazer kesici küçük bir dikdörtgen kesin.
  3. 0.2 mm akrilik bir tarafına çabuk kuruyan bir yapışkan ince fakat tam bir tabaka uygulanır ve odacığın dibine tutkal. Bölmenin tabanına sıkıca yerine 0.2 mm akrilik tutun ve dağıtmakTutkal, bir mühür oluşturmak ancak görüntüleme alanı kapsayan önlemek için izin vermek için ara-yapıştırıcı. Onun kenarı oda duvarının kenarı ile aynı hizada ve tamamen sonsuzluk odası kesme kapsar şekilde akrilik hizalamak için emin olun. Bu yeterli jet nüfuz etmesi için izin vermek ve kuyu sızmasını engeller.
  4. Delinmiş delikleri kapatmak için doğal kauçuk iki küçük parçalar kesin. Deliğin etrafında çabuk kuruyan yapıştırıcı uygulayın. Sabitlemek için forseps bir çift ile tüm alanlarda delik ve basın üzerinde lastik yerleştirin. Her iki delinmiş delikler için tekrarlayın. Herhangi bir sızıntıyı önlemek amacıyla tüm yapıştırılmış bağlantıların tam mühürler emin olun.
  5. Iğne, bir 23 G 1 kullanarak, piezoelektrik inkjet ucu sokulmasını kolaylaştırmak için bölmenin her iki yanında, doğal kauçuk bir delik açmak.

2. Deneysel Hazırlık

-20 ° C derin dondurucuda kloroform Mağaza stok lipid çözüm. Bu çalışmada, 1,2-diphytano yail-sn-glisero-3-fosfokolin (DPhPC) veya 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC) kullanılmıştır. 2 ml 25 mg / ml lipid çözeltisi, tipik olarak, bu protokolde hazırlanır ve -20 ° C'de saklandığında iki ay sürecektir

  1. N-dekan içinde lipid tekrar süspansiyon, önce küçük bir cam kavanoza bir stok şişesinden aktarmak ve argon veya azot altında hafifçe kurulayın. Lipid daha hızlı kurumasına izin gaza daha fazla yüzey alanı ortaya çıkarmak için kurutma sırasında bir açıyla kavanoz tutun.
  2. Sadece biraz vidalanmış kavanozun kapağı ile kurutuldu, çözelti, 1-2 saat boyunca bir desikatör içinde vakum altında bekletin. Daha sonra 25 mg / ml 'de lipide resolubilize n-dekan ekleyin. Vortex lipid çözelti kısa bir süre için ve 15 dakika boyunca bir banyo sonikatörü içinde sonikasyon. -20 ° C'de n-dekanda yeniden lipidin saklayın
  3. Bir stok sakaroz çözeltisini hazırlayın. Bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, 300 mM sukroz 900 ul ve 100 ul ekle% 1 metilselüloz (MC) içinde. Metilselüloz jeti yardımcıları çözeltinin viskozitesini arttırmak için eklenir. İsteğe bağlı adım: Sırasıyla, görüntülemede daha fazla kontrast veya floresan ödünç koyu renkli gıda boyası veya floresan boncuk, isteğe bağlı 1 ul ekleyin. Bu çözüm hücresel ozmolariteyi maç ve microjetting sırasında kontrast sağlamak için tasarlanmış bir 300 mOsm sakaroz çözümdür.
  4. Bir tek 1 ml plastik şırıngaya çözüm çizin. Ucu yukarı bakacak şekilde şırınga tutarken, ucuna doğru kabarcıkları çıkarmak için tekrar tekrar mili fiske ve sıkışan havayı çıkarmak için pistonu itmek. O jeti sorumlu uygun piezoelektrik kasılması engel olacak şekilde, devam etmeden önce şırınga tüm havayı tahliye etmek için emin olun.
  5. Şırınganın ucunda bir 0.22 um filtre takın. Filtrenin içinde kalmasını önlemek için hava, dikey olarak şırınga tutun ve bir damla ucu üzerinde oluşturulmuştur kadar pistonu itin. Not: A33 mm çaplı bir şırınga filtre ünitesi, en iyi olarak çalıştığı bulunan, ancak, 3 mm çapında bir şırınga filtresi kadar küçük alternatif filtresi ölü hacim azaltmak için kullanılabilir.
  6. Inkjet dişi luer adaptörü sökün ve güvenli bir filtrenin ucuna yere basın. Yine, hava yakalama önlemek için sıvının püskürtülmesi. Inkjet üstüne vidalayın. Tamamen takıldıktan sonra sıvı mürekkep püskürtmeli ucuna alması gerekir.

3. Ekipman Readying

  1. V-kelepçe kullanarak, mikroskop sahnede şırınga monte. Inkjet kontrol için mürekkep püskürtmeli tel takın. Not: Özel bir sahne bu protokol için inşa edilmiş, sahne tasarımı kullanıcı tarafından tespit edilebilir iken, şırınga ve numune sahibinin xy kontrolünden bağımsız xyz kontrolünü olması önemlidir.
  2. Istenen görüntüleme elde etmek için büyütme ve gerekli lens kombinasyonunu belirleyin. İşte 10X objektif ve 10X mercek kullanılır. Jeti ve vezikül nesil görselleştirmek için yüksek hızlı bir kamera (≥ 1,000 fps) kullanın. Önce görüntüleme, gerekli kamera kalibrasyonu gerçekleştirin. Görüntü yakalama başlatmak için kamera yazılım içinde görüntü-tabanlı otomatik tetik yararlanın.
  3. Mikroskop sahneye sonsuzluk odasını monte edin. Sahnede yerine Kaydettiğini tarafından odasına sabitleyin.
  4. Dikkatle doğal kauçuk delinmiş delik (Şekil 1b bakınız) ile mürekkep püskürtmeli ucu hizalamak. Bunu yapmak odasına yakın inkjet getirmek ve göz tarafından konumunu ayarlamak için, daha sonra mikroskop merceğinden daha hassas ayarlamalar yapmak. Kaba hareketler inkjet ucu zarar verebilir gibi, dikkatle devam edin.
  5. Inkjet hizalanmış sonra, kuyuların yükleme sırasında mürekkep püskürtmeli hasar görmesini önlemek için uzak odasından şırınga geri. Bu zar içindeki delik ile hizalanmış kalır, böylece mürekkep püskürtmeli hareket tek yönlü olduğundan emin olun.
  6. Plun hafifçe basınMürekkep püskürtmeli meme küçük bir damlacık oluşana kadar şırınganın ger. Bu bazı ilk backpressure sağlayacaktır.
  7. Girdi püskürtme parametreleri. Bir trapez bipolar dalga için, aşağıdaki parametreleri kullanın: 20 kHz darbe frekansı, 3 mikro saniye olduğu yükselme zamanı, 35 mikro-saniye darbe süresi, 3 mikro saniye olduğu düşme zamanı, 65 V gerilim uygulanmıştır (darbe genlik) ve tetik başına 100 jet bakliyat (darbe sayısı) . Bununla birlikte, uygulanan gerilim (darbe genlik) ve darbe sayısı (tetik başına jet darbeler) vezikül boyutunu kontrol etmek için de değiştiirlebilir.

4. Vezikül Üretimi

  1. Her ikisi de kuyu tüm yüzeyini kaplayan, sonsuz bölmeye n-dekanda süspansiyon 25-30 ul lipid çözeltisi ekleyin.
  2. Bir de, pipetleme yavaş ve düzgün bir en dış kenarı (sakaroz çözeltisi ile aynı ozmotik basıncı) 25 ul glikoz eklenmektedir. Glükoz ve lipid çözeltisi karışmaz çünkü birikimi üzerine, glikoz, bir damla, oluşturmalıdır. Ekle başka 251, bir damla yapmak ve 5-10 dakika içinde bölmenin ortasında lipid iki katmanlı zar oluşturacak ters kuyu, glukoz l.
  3. Doğal kauçuk sayesinde mürekkep püskürtmeli yerleştirin ve dikkatli bir damlacık arayüzü bilayeri doğru yol gösterir. Tanıtılan inkjet hacmi yerinden ve bilayeri kopma gibi, yavaş yavaş bilayeri yaklaşın.
  4. İnkjet ~ 200 um içinde olduğunda, aşama 3.8 'de tarif edilen ayarlarla jeti geçerlidir. Iki tabaka arasındaki mesafe, diğer değişkenler arasında, gerilim ve darbe sayısı ile ilgili olarak temel olarak değişebilir. Bu protokol yavaş ayarlarını (gerilim ve darbe sayısı) giderek artan ve bilayeri deformasyon gözlemleyerek önerir.

5. Ekipman Temizleme

  1. Mikroskop aşamasından şırınga ayırın ve 1 ml plastik şırınga ve filtre atmayın.
  2. Inkjet temizlemek için, eriyik içindeki daldırma ucu ile sırayla aşağıdaki çözümleri aspiren 7-10x her: ılık su,% 70 etanol ve GKD 2 O.% 70 etanol,% 2 Neutrad çözüm Inkjet aspirasyon pipet üzerinde güvenli bir şekilde uymazsa, bir adaptör oluşturmak için bir pipet kesti.
  3. Doku ile odası kurutun. 5-10 dakika süreyle% 2 v / v ılık suda Neutrad ve sonikasyon ile 250 ml çanak içinde sonsuz odası yerleştirin. Sonikasyon sonrasında, iyice sıkıştırılmış hava altında kuyu kurutun. Kuyularda nem, lipid iki katmanlı membran stabilitesini tehlikeye atabilir ve bu, odalar 15 dakika boyunca 60 ° C'de bir fırına yerleştirilir önerilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu makine parçaları ve manuel mikrometreden monte özel bir kademe (Şekil 1) ile, geleneksel bir ters flüoresan mikroskop üzerinde bir mikro-akışkan püskürtme kurulum toplandı. Inkjet karakterizasyonu kese oluşturma işlemi içgörü sağlar. Mürekkep püskürtmeli meme ve lipid çift katlı arasındaki mesafeyi değiştirilmesi kuvvet, zarı deformasyonuna neden olmak için uygulanan etkiler. Çift-katlı yakınlık jet akışı odaklanır ve uzak vezikül kuşağın alanına enerji dağıtıcı gelen membran engeller. Girdap seyahat beklentileri (Şekil 2) ile uyumlu piezoelektrik aktüatör, uygulanan gerilim ile artar. Vezikül oluşumu ve Örnek veziküller, Şekil 3'te gösterilmiştir jeti. Şekil 3a, microjetting ile vezikül oluşumu için örnek bir görüntü dizisini göstermektedir. Oluşumunun ardından, vesikül stabilite vesikül Diamete göre değişir eğilimindedirr, küçük kesecikler daha istikrarlı nerede.

Şekil 1
Teknik ve teçhizat Şekil 1.. Çizim. Damlacık arayüz karşı iki tabakalı piezoelektrik tahrik püskürtme işleminin (a) şematik. Birden bakliyat GUVs üretmek için bilayeri deforme bir girdap halka yapısını oluşturmak hızlı arkaya itti. Alt sağ tasviri glukoz birikimi ve kuyunun boyutunun yerini gösterir. Lipid çözeltisi sonsuz bölmeye eklendikten sonra, 25 ul glikoz daha sonra (2) de, (1) de, kuyunun en dıştaki kenarlarına kadar ilave edilir. (B) monte edilmiş şırınga montaj, özel tutma platformu ve sonsuzluk odası. Odacık yerine tespit edilir ve mürekkep püskürtmeli ucu hol ile hizalanır Kuyunun tarafında doğal kauçuk e. (C) tam mikroskop ve özel sahne montaj. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 2,
Inkjet Şekil 2.. Karakterizasyonu. (A) 20 kHz (55 V darbe genlik 50 darbeler) en hızlı inkjet darbeler tek bir girdap halkası oluşturmak üzere üst üste. Darbe genlik aralığında sabit nabız sayısı (200 bakliyat) için (40-65 V) üzerinde zamanın bir fonksiyonu olarak (b) Sıvı jet ön deplasman. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

hep "> Şekil 3,
Şekil 3.. Vesikül Nesil. Vesikül oluşturma sürecinin Görüntü ve çeşitli veziküller üretti. (A) çözeltisi hızla darbe ile üretilen damla arabirim iki tabakalı (DPhPC) deformasyon çimdik ve patron oluşturmak üzere membran neden olur. (B) mikroakışkan jeti kullanılarak üretilen çok veziküller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Birçok teknik electroformation, emülsiyon ve damlacık oluşturma 14-16 dahil olmak üzere, kabarcık üretimi için geliştirilmiştir. Ancak, yeni deneysel teknikler canlı sistemler için artan benzerliği olan biyolojik sistemlerin tasarımı için izin vermek için gereklidir. Özellikle mikroakışkan yöntemler yakın biyoloji kesecik modelleri getirerek, membran unilamellarity, büyüklüğü monodispersiteye ve iç içeriği 17,18 yöneten kontrol artan bir düzeyde teklif var. Ayrıca, mikroakışkan jeti kullanarak tanımlanması ve etkili bir deney yönelik membran proteinlerinin dahil edilmesi, membran asimetri ve kapsülleme 3,13 göstermiştir.

Bu teknik basittir, ancak dikkatli alınması gereken bazı adımlar bulunmaktadır. Akrilik levha ve doğal kauçuk hem de imalat sırasında sonsuzluk odası ile komple mühürler oluşturmak gerekir. Aksi halde, sonsuzluk şeklindeki kuyular sızıntı ve r olacakISK iki tabakalı istikrar. Deneysel hazırlanması sırasında, araştırmacı başlangıçta ve her bileşeni taktıktan sonra, tamamen hava şırınga tahliye emin olmalıdır. Bu derleme içinde Bubbles jet içinde bir sıkıştırılabilir hacim oluşturmak ve piezoelektrik püskürtme etkisini azaltmak veya ortadan. Ekipman readying ederken, ana endişe kırılgan inkjet memesini zarar veriyor. Bu sonraki jeti için lipid ikili tabakasına kurar Son olarak, glikoz depozisyon, vesikül önceki nesil adımları sırasında en dikkat gerektirir.

Microfluidic jeti ile vezikül nesil, güvenilir ve tekrarlanabilir, ancak, mürekkep püskürtmeli arasında farklılıklar bazı aşinalık ve parametrelendirmesini gerektirir. Bizim tecrübelerimize göre, önce jeti için sonsuzluk odasına inkjet memenin giriş uzak bilayeri hafif bir viraj üreten, meme boyutlarına bağlı olarak glikoz birkaç mikrolitre kadar yerinden olabilirinkjet. Ilk çift katlı kurulurken orantısız glukoz çözeltisi dağıtıcı olarak, bu etki telafi edilebilir ve bir iki-tabaka düzlemsel neden olur. Bu iki tabakalı kararlılığını artırır hem de kesecik oluşumu üzerinde daha iyi bir kontrol sağlar sadece. Mürekkep püskürtmeli bir 20 mikron çaplı menfez Bu çalışmada gösterilen sonuçlar elde etmek için kullanıldı. 10-20 um'lik bir delik çapı önerilir. Titreşimlerin en aza indirilmesi de tavsiye edilir; basit kauçuk kesikler mikroskop tabloyu desteklemek ve laboratuvar titreşimleri engellemek için kullanıldı.

Bu protokol çok lipidler için geçerli olmakla birlikte, DPhPC kendi özel kimyası ve yüksek iki tabakalı bir stabilite için seçildi. Diğer test edilen birincil lipitler, 1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DPPC) ve 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC). Nispeten, DPhPC tutarlı bir damlacık arabirim oluşturmak için çift katlı ve tek lamelli veziküllerin üretilmesi için güçlü bir eğilim vardı. İlk Uponoluşumu, bu protokolde iki katmanlı nedeniyle düzlemsel olmayan bir arayüz için belirgin bir kalınlığı ve yağın dahil edilmesi vardı. Sulu damlacıkların şekli kavisli bir çift tabakası oluşturulmuş ve bu bakış belirli bir alanda bir kalınlık olarak ortaya çıktı. DPhPC iki damlacıklar arasındaki arabirimde ilk temas bölgesi uzak bilayeri yağ itici, genişletmek için izin verdi. Bu nedenle enerjetik olarak elverişli bir işlem için, iki damlacıkları arasındaki temas bölgesinin daha fazla bir iki tabakalı olmuş ve gözlemlenebilir kalınlığı zamanla azalmıştır. Iki tabakalı bölgenin bu büyüme iki tabaka uzunluğunun değişkenliği altında test edilmiştir, ilk odası tasarımı hafif ayarlandı (ikinci kuşak tasarımı çapı 0,15 iki daire oluşmuştur içinde 0.13 bir merkez-merkez mesafe ile ayrılmış) Daha küçük hacimleri gerektiren ve daha küçük bir iki katmanlı bir arayüz sonuçlanmıştır. Doğru vezikül nesil için izin yeni ve ilk tasarım, henüz ne tasarım hem domin gösterdiiki katmanlı incelme karınca avantaj. Başka bir test optimizasyonu piezoelektrik mürekkep püskürtmeli uygulanan bilgisayar kontrollü geri basınç oldu. Püskürtme sırasında bu akış hızı üzerinde daha nicel bir kontrol sağladı iken, deney çoğunluğu boyunca kullanılmadı.

Bu yöntem, çok sayıda, mevcut teknikler kombine avantajlar sunmaktadır. Hızlı vezikül nesil bu işin odağı olmamasına rağmen birden fazla GUVs nedeniyle lipit moleküllerin yüksek konsantrasyonu yüksek frekansta (~ 200 Hz) oluşturulabilir. Tek bir lipid iki katmanlı karşı bu teknik jetler için, zar unilamellarity beklenir ve gözlenmiştir. Ayrıca, geniş bir çözüm yelpazesi dolayısıyla daha fazla potansiyel uygulamalar 17 sağlayarak, bu tür molekül ağırlığı veya ücret gibi belirli çözünen özelliklerinden bağımsız kapsüllü olabilir. Ayrıca nedeniyle oluşan veziküllerin boyutuna (aralık> 10 um'lik mümkündür <400 um), geleneksel mikro ile, gözlemscopy teknikleri yeterli 13'tür.

Mikroakışkan jeti biyolojik sorunları çeşitli uygulanabilir. Bir spesifik bir örnek hücresel biyomekanik değil, GUVs arasında deformabilite onlara GUV 4,19 yüzeyinde monte zaman ilginç efektler gösterdi kapsüllü aktin ağların kuvvet oluşturma ve kendini düzeneğini incelemek için ideal bir araç vermektedir. Ek uygulamalar ilaç dağıtım sistemleri, hücre boyutu Reaktörler ve sentetik biyoloji, biyofizik, ve temel bilim, sanayi ve bölümlere biomoleküller istenen tıpta diğer alanlarda çeşitli modüler sistemlerini kapsar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Biz microjetting parametreleri üzerinde tavsiye California, Berkeley Üniversitesi'nde Fletcher Lab Mike Vahey teşekkür ederim. Bu çalışma NIH hibe DP2 HL117748-01 tarafından sponsor oldu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Piezoelectric Inkjet MicroFab Technologies MJ-AL-01-xxx xxx denotes orifice diameter in microns
Jet Drive III Controller MicroFab Technologies CT-M3-02
High-speed camera Vision Research MiroEX2
DPhPC lipid in chloroform Avanti 850356C Ordered in small aliquots in vials
33 mm PVDF filters, 0.2 µm Fisher Scientific SLGV033RS
1 ml Syringes Fisher Scientific 14823434
n-Decane Acros Organics 111871000
Glucose Acros Organics 410950010
Sucrose Sigma-Aldrich S7903-1KG
Methylcellulose Fisher Scientific NC9084958
1/8 in Acrylic McMaster Carr 8560K239 CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request
0.2 mm Acrylic Astra Products Clarex clear 001
Acrylic Cement TAP Plastics 10693
Loctite 495 Superglue Fisher Scientific NC9011323
Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive Strobels Supply 30765
Natural rubber McMaster Carr 85995K14
Custom stage homemade N/A CAD designs are available upon request

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature reviews. Mol. Cell Biol. 10, 644-650 (2009).
  2. Yeh, B. J., Lim, W. A. Synthetic biology: lessons from the history of synthetic organic chemistry. Nat. Chem. Biol. 3, 521-525 (2007).
  3. Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A. 108, 9431-9436 (2011).
  4. Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nat. Phys. 4, 789-793 (2008).
  5. Brown, K. S., et al. Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle. J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).
  6. Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro. Science. 320, 789-792 (2008).
  7. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Disc. Chem. Soc. 81, 301-311 (1986).
  8. Bucher, P., Fischer, A., Luisi, L. P., Oberholzer, T., Walde, P. Giant Vesicles as Biochemical Compartments: The Use of Microinjection Techniques. Langmuir. 14, 2712-2721 (1998).
  9. Shum, H. C., Lee, D., Yoon, I., Kodger, T., Weitz, D. A. Double emulsion templated monodisperse phospholipid vesicles. Langmuir. 24, 7651-7653 (2008).
  10. Matosevic, S., Paegel, B. M. Stepwise Synthesis of Giant Unilamellar Vesicles on a Microfluidic Assembly Line. J. Am. Chem. Soc. 133, 2798-2800 (2011).
  11. Hu, P. C. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic Fabrication of Asymmetric Giant Lipid Vesicles. ACS Appl. Mater. Inter. 3, 1434-1440 (1021).
  12. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. J. Am. Chem. Soc. 130, 5878-5879 (2008).
  13. Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Brochard-Wyart, F., Fletcher, D. A. Inkjet formation of unilamellar lipid vesicles for cell-like encapsulation. Lab Chip. 9, 2003-2009 (2009).
  14. Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).
  15. Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. J. Colloid Interface Sci. 376, 119-125 (2012).
  16. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet Microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
  17. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4697-4702 (2008).
  18. Osaki, T., Yoshizawa, S., Kawano, R., Sasaki, H., Takeuchi, S. Lipid-coated microdroplet array for in vitro protein synthesis. Anal. Chem. 83, 3186-3191 (2011).
  19. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers. Biophys. J. 91, 4064-4070 (2006).

Tags

Biyomühendislik Sayı 84 mikroakışkan püskürtme sentetik biyoloji vezikül kapsülleme çift katlı lipid biyokimyasal sulandırılması dev tek tabakalı veziküller
Mikroakışkan jeti kullanarak çift katlı lipid Vesikül Üretimi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Coyne, C. W., Patel, K., Heureaux,More

Coyne, C. W., Patel, K., Heureaux, J., Stachowiak, J., Fletcher, D. A., Liu, A. P. Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting. J. Vis. Exp. (84), e51510, doi:10.3791/51510 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter