Summary
يصف المخطوطة الخطوات المطلوبة لإجراء عملية زرع قلب منتبذ في الماوس.
Abstract
هو الآن أكثر من أربعين عاما منذ أن تم الإبلاغ عن هذه التقنية لأول مرة كوري، وين وراسل. على الرغم من أنه استغرق عدة سنوات للمختبرات أخرى لإتقان واستخدام هذه التقنية، والآن تستخدم على نطاق واسع من قبل العديد من المختبرات في جميع أنحاء العالم. ووضعت صقل كبيرة لأسلوب الأصلي والتي أعلن عنها في عام 2001 من قبل Niimi. الموصوفة هنا هي التقنيات التي تطورت على مدى أكثر من عقد من الزمان في أيدي ثلاثة جراحين (Plenter، غراتسيا، بيترا) في مركزنا. ويجري الآن مرت هذه التقنيات إلى جيل أصغر من الجراحين والباحثين.
يستند إلى حد كبير على الخبرة Niimi، تطورت الإجراءات المستخدمة في التفاصيل الدقيقة - التفاصيل التي سوف نسعى لربط هنا في مثل هذه الطريقة أن الآخرين قد تكون قادرة على استخدام هذا النموذج مفيد جدا. مثل Niimi، وجدنا أن المساعدات الفيديو إلى التعلم هو مورد لا يقدر بثمن للمبتدئين.
Introduction
في عصر عندما يكون من الممكن لأداء الكلى والرئة والكبد والبنكرياس زرع في الفئران، وحجر الزاوية في زرع الأعضاء البحوث الأساسية وعلم المناعة منذ عام 1973 لا تزال 1-4 في منتبذ القلب نموذج زرع في الماوس. في السنوات الفاصلة وقد نشرت العديد من الصحف بالتفصيل تحسينات / التحسينات 5،6 لهذا الإجراء.
كنموذج للزرع الأعضاء الصلبة أوعية دموية في المقام الأول هذا الإجراء لا يعلى عليه. مرة واحدة يتقن هذا الإجراء يفسح المجال للبحث في الاستجابات رفض خيفي 7، وتطوير vasculopathies المزمنة 8 وآليات إصابة نقص التروية ضخه 9.
مفاتيح التعلم بنجاح هذا الإجراء هي تماما مثل أي عملية جراحية أخرى، والصبر من جانب المدرب والمتدرب والاهتمام بالتفاصيل. في بداية عملية للجراح جديدة سوف تجد أن رمهلا سوف يقضون ساعات طويلة على كل زرع. مع اكتساب الخبرة، وسوف مرات الجراحية، وبالتالي نقص التروية، والحد بشكل كبير. سوف الالتفات إلى تفاصيل كل خطوة تؤدي عاجلا أو آجلا إلى النجاح.
في حين أن مدرب يمكن أن تفعل أفضل ما لديهم لتمرير، وتوقع، كل حفرة من السقوط المحتملة التي قد يكون واجه خلال هذه العمليات الجراحية، فإن المتدرب "خلاقة" من المحتمل العثور على بعض من تلقاء نفسها!
أساسيات الإجراء هي كما يلي. الجهة المانحة قوس الأبهر الصاعد هو نهاية إلى الجانب anastomosed إلى الشريان الأورطي البطني المتلقية والمانحة الشريان الرئوي هو نهاية إلى الجانب anastomosed إلى المستلم البطن الوريد الأجوف السفلي (IVC). يتدفق الدم من الشريان الأورطي المتلقي في الأزياء إلى الوراء من خلال الشريان الأورطي المانحة إلى الشرايين التاجية. مرة واحدة وقد تدفقت الدماء من خلال نظام التاجي أنها تستنزف في الأذين الأيمن عبر الجيب التاجي، وضخها في البطين الأيمن وثم عبر الشريان الرئوي إلى المتلقي IVC. بهذه الطريقة يتم توفير نظام التاجية الدم الشرياني والجيوب الأنفية إيقاع يعود إلى الكسب غير المشروع في غضون 1-2 دقيقة من ضخه. منذ غرف الأيسر من القلب هي أساسا تحت ضغط تحميل جدار البطين الأيسر الحرة سوف ضمور مع مرور الوقت.
Protocol
وتم إيواء جميع الحيوانات تحت ظروف خالية من مسببات الأمراض في جامعة كولورادو مركز باربرا ديفيس مرفق الحيوان تحت موافقة IACUC ورعايتهم وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة.
يتم الحكم على عمق التخدير عن طريق قرصة أخمص قدميه في البداية ومراعاة معدل التنفس بمجرد بدء الإجراء.
1. المانحين القلب الحصاد
- تخدير الماوس المانحة عن طريق حقن بنتوباربيتال (60 ملغم / كغم IP).
- لشل حركة الماوس بنسبة 4 في اتجاه والقيود ومقطع الفراء. مسح الجلد مع الكحول.
- بعد تشريح بعيدا الجلد، وفتح تجويف البطن عن طريق إجراء شق عرضية أدنى لمجرد الحجاب الحاجز.
- قطع الخلفي الحجاب الحاجز إلى الإدراج الساحلية ورفع جدار الصدر الأمامي الأمامية ومتفوق تعريض القلب.
- تمديد سمك كامل تقطيع الخلفي تجويف الصدري الوحشي على الجانبين الأيمن والأيسر من الصدر.
- عزلالوريد الأجوف السفلي (IVC) ووضع فضفاضة 5-0 خياطة الحرير حول IVC المتاخمة لإدخاله داخل الأذين الأيمن.
- ضخ 1.0 سم مكعب من 4 ° C المالحة heparinized (200 يو / سم مكعب) في IVC، ثم ligate السفينة مع خياطة الحرير 5-0 والانقسام.
- عزل الحق الوريد الأجوف العلوي (rSVC) بطريقة مماثلة وligate مع خياطة الحرير 5-0 والانقسام.
- بلطف لفة القلب نحو الجانب الأيمن الحيوانات وعزل الوريد الأجوف العلوي الأيسر (lSVC)، ligate مع خياطة الحرير 5-0 وتقسيم فضح الشريان الرئوي الأيسر.
- تأمين قلب تحت الشاش الرطب في حين أن الغدة الصعترية يتم تشريح حادة بعيدا عن الشريان الرئوي الرئيسي (PA) واليسار واليمين والسلطة الفلسطينية فروع قوس الأبهر الصاعد.
- بلانت تشريح قوس الأبهر خالية من الأنسجة المحيطة بها. وتستخدم الصغيرة المقص لتقسيم الشريان الأورطي القريبة إلى اليمين الشريان العضدي الرأسي،، أي يجب أن يكون هناك فروع بين القلب وتقسيمنقطة من الشريان الأورطي.
- هذا القسم من قوس الأبهر يشكل صفعة الشرياني لعملية الزرع.
- تعكس الكفة الأبهر دون المستوى لفضح السلطة الفلسطينية الجذع والفروع اليسار واليمين من السلطة الفلسطينية.
- بلانت تشريح فروع PA اليسار واليمين بعيدا عن الأنسجة المحيطة بها بقدر من القلب ممكن. وهذا يسمح للتشريح سهلة من الجذع السلطة الفلسطينية من الأنسجة المحيطة بها.
- تقسيم الجذع السلطة الفلسطينية كما بشكل أقصى قدر ممكن، الداني فقط لالتشعب لها. هذا الجزء من الشريان الرئوي يشكل صفعة الوريدي لعملية الزرع.
- وضع الحرير خياطة 5-0 حول قاعدة القلب وربطة عنق. يتم قطع القلب ثم حرة في القاعدة، وضعت في 4 ° C المالحة. مجموع وقت الحصاد تقريبا. 10-15 دقيقة.
2. زرع القلب وتقنيات
- تخدير الفئران المتلقي مع بنتوباربيتال (60 ملغ / كغ الجرعة الأولي IP، 25 ملغ / كغ جرعة تكميلية IP إذا لزم الأمر).
- مقطع الفراء ولشل حركة الماوس بنسبة 4 في اتجاه والقيود والإعدادية الجلد مع بوفيدون اليود وثنى بطريقة عقيمة.
- جعل 2 سم خط الوسط شق البطن العمودية وتدخل في تجويف البطن.
- سحب الأمعاء متفوق وتخريجها إلى صدره. إبقاء ملفوفة في شاش معقمة رطبة (ملحي معقم) في جميع أنحاء القضية.
- عزل الشريان الأورطي البطني والوريد الأجوف السفلي (IVC) أدناه الأوعية الكلوية وتضع 4-0 العلاقات القطن حول الأبهر وIVC متفوقة ثم أدنى إلى موقع مفاغرة.
- تحديد أي السفن القطني داخل الميدان وligate مع النايلون 10-0 خياطة.
- عقدة العلاقات القطن، لأول مرة أدنى تليها متفوقة. بهذه الطريقة يتم الاحتفاظ بعض الدم في الشريان الأورطي مما يجعل بضع الأبهر أسهل.
- تشكل بضع الأبهر مع إبرة 30 G لدخول تجويف الشريان الأورطي. تمديد شق بالمقص الصغير غرامة على طول حوالي 2 مم. يرصد هذا الشق في خط مستقيم على طول طويلةمحور itudinal السفينة.
- جعل حد للمفاغرة الجانب من الشريان الأورطي إلى الشريان الأورطي المانحة المستلم في الأزياء التالية. وضع النايلون 10-0 خياطة إقامة غرزة في الشريان الأورطي المانحة وإلى الزاوية السفلية من شق في الشريان الأورطي المتلقي وربطة عنق. وضع الثاني 10-0 النايلون قبالة الأولى في الشريان الأورطي المانحة والزاوية متفوقة من شق في الشريان الأورطي البطني وربطة عنق.
- جعل خط يمتد من خياطة متفوقة على أقل شأنا في الجدار الجانبي من الشريان الأورطي والتعادل ضد غرزة إقامة ضعت سابقا. تأكد من إحضار intimas (سطح السفينة الداخلية) معا كما كنت غرزة. ثم خياطة الجانب الإنسي بطريقة تشغيل وربطة عنق. يجب وضع غرزة الأول والأخير على كل جانب أقرب إلى إقامة غرز ممكن. ثم نهدف إلى أن 3 غرز متباعدة بشكل متساو بين هذين صنع ما مجموعه 5 غرز.
- جعل حد للمفاغرة الجانب من الشريان الرئوي المانحة إلى IVC المستلم في الأزياء التالية. Punctولدى عودتهم IVC مع 30 G إبرة وتوسيع شق تقريبا. 2 ملم مع المقص الصغير يرام. يرصد هذا الشق في خط مستقيم على طول المحور الطولي للسفينة.
- ربط الشريان الرئوي المانحة إلى الزاوية السفلية من شق في IVC مع 10-0 النايلون. وضع الثاني 10-0 النايلون قبالة الأولى في الشريان المانحة والزاوية متفوقة من شق في IVC وربطة عنق.
- جعل خط الدرز الذي يمتد بين الشريان الرئوي وIVC وربطة عنق. يجب وضع غرزة الأول والأخير على كل جانب أقرب إلى إقامة غرز ممكن. ثم نهدف إلى 5 غرز متباعدة بشكل متساو بين هذين صنع ما مجموعه 7 غرز.
- الافراج عن القاصي 4-0 القطن التعادل انهاض تدفق الوريدي.
- مرة واحدة وقد لوحظ الارقاء من مفاغرة وريدية وخففت الداني 4-0 القطن التعادل تدريجيا ولاحظ مفاغرة شريانية لالارقاء. عندما تعتبر كل من anastomoses آمنة، وإزالة جيربط أوتون من الماوس.
- عودة الأمعاء إلى البطن. إغلاق جدار البطن في طبقتين باستخدام 5-0 الحرير خياطة بطريقة التشغيل.
- إدارة بلعة 1.0 مل من العقيمة، ملحي دافئ في البطن كما إنعاش السوائل بعد اقفال، و 0.8 مل من محلول ملحي يتم حقنه تحت الجلد بعد العملية. ليس هناك حاجة لاتخاذ تدابير داعمة أخرى أثناء الجراحة. استرداد الحيوان على بطانية الاحترار. مجموع وقت الزرع تقريبا. 90-120 دقيقة للمبتدئين، 45-60 دقيقة مع الخبرة. إدارة تسكين البوبرينورفين، 0.05 مغ / كغ، SC، 0.1-0.2 مل في بداية الإجراء وكل 6-12 ساعة لمدة 72 ساعة بعد العملية.
3. تقييم الكسب غير المشروع
- تقييم وظيفة الكسب غير المشروع يوميا من قبل الجس عبر البطن.
- عقد الماوس كما لو أنه كان لا بد من إعطاء حقنة داخل الصفاق.
- اضغط بلطف غيض من السبابة ضد جدار البطن والتأكد من شارع الضربength وانتظام الكسب غير المشروع.
- تعطي نوعية الجس على درجة من 4 (السعة العادية والتردد) إلى 0 (غير الضرب، رفض الكسب غير المشروع).
ملاحظات هامة:
يتم تعقيم جميع الأدوات، وارتداء القفازات المعقمة في جميع أنحاء الداخلي والحفاظ حقل معقمة. وتجرى العمليات الجراحية المانحة والمتلقية مع استخدام المجهر التشغيل. تأكد من أن anastomoses هي "نظيفة". وهذا هو، أن الجدران مرة أخرى لا اشتعلت عند وضع غرز. وهذا يسبب انقباض كبير في التدفق من شأنها أن أكثر من المرجح أن النتيجة في الكسب غير المشروع وفشلت في الحالات القصوى إلى Hind-أطرافهم الشلل. من المهم أيضا بمكان أن يمر سمك كامل بما في ذلك البرانية وتتحقق البطانية من الإبرة خياطة الأوعية الدموية. Evertion من حواف يضمن أيضا أن هناك البطانية إلى البطانية الاتصال، والذي يساعد في الشفاء والختم من anastomoses. وثمة حقيقة أخرى ذات أهمية حيويةأو هو ضمان أن التوتر من خطوط الدرز توصيلي هو أيضا الأمثل. فضفاضة جدا، وسوف يكون هناك تسريب رجعة فيه، ضيقة جدا وتضيق لتدفق سينتج. إذا على الجانب الشرياني وهذا سوف يؤدي ذلك إلى ضعف التروية من الكسب غير المشروع، إذا على الجانب الوريدي فإن القلب يؤدي ازدحام.
Representative Results
الاستفادة من هذه التقنية الجراحية يفتح الطريق أمام إما بسيطة دراسات بقاء الكسب غير المشروع / الرفض، أو بروتوكولات تجريبية معقدة جدا. في هذه الدراسة بإيجاز في الشكل أدناه، سعينا إلى تحديد المشاركة، إن وجدت، من فاس و / أو perforin كآليات من CD4 T الخلية بوساطة رفض القلب. وقد أصبح هذا ممكنا من قبل مجموعة غير عادية من سلالات الفئران التي تتوفر اليوم. تثبت النتائج أن الرفض المباشر من المغايرة القلب بواسطة CD4 خلايا T المستجيب يتطلب مساهمة بديلة من التعبير والكسب غير المشروع فاس T perforin خلية التعبير. على حد علمنا، وهذا هو اول دليل على ان النشاط لحل الخلايا من خلايا CD4 T يمكن أن تلعب دورا تلزم لهذا الرفض الحاد طعم خيفي الأساسي في الجسم الحي.
1.JPG "/>
. الرقم 1 Perforin وفاس تمثل تلزم ومسارات متوازية من CD4 T الخلية بوساطة رفض القلب B6، B6 PFPKO (perforin تدق التدريجي)، وB6 GLD استخدمت خلايا CD4 T (ناقص فاس يجند) لإعادة B6 خرقة - / - المستفيدين من C3H النوع البري أو C3H فاس التي تعاني من نقص LPR المغايرة القلب. إزالة فاس وحدها (♦، ع = NS مقابل السيطرة بالوزن C3H + B6 خلايا CD4 T) من قلوب المانحة أو إزالة أو perforin وحده من خلايا CD4 T (■، ع = NS مقابل السيطرة بالوزن C3H + CD4 T B6 لم الخلايا) لا تلغي الرفض. ومن المثير للاهتمام، لم إزالة فصل المقال من المستجيب CD4 خلايا تي الرفض تأخير ملحوظ (●، ع <0.02 مقابل خلايا وزن C3H + CD4 T B6، ف <0.01 مقابل خلايا وزن C3H + B6 PFPKO CD4 T، و p <0.01 مقابل . LPR C3H + B6 خلايا CD4 T). ومع ذلك، فإن معظم المغايرة لا يزال رفض (4 من 5). بشكل ملحوظ، وإزالة وقت واحد من كل من الجهات المانحة وCD4 T فاس perforin الخليةرفض إلغاؤها تماما (○، ع <0.002 مقابل السيطرة بالوزن C3H + B6 خلايا CD4 T، وزن C3H + B6 خلايا CD4 T PFPKO، وC3H LPR خلايا CD4 T + B6). كان هذا الإلغاء بشكل ملحوظ أكثر قوة من إزالة الفردية CD4 T خلية فصل المقال (○، ع <0.003 مقابل السيطرة بالوزن C3H + B6 GLD CD4 خلايا تي). من غراتسيا وآخرون 10. طبع بإذن.
Discussion
هذه التقنية الجراحية ليست سهلة لإتقان، ولكن بمجرد يتقن هو أداة بحث قوية. يكافأ الباحث / الجراح التي كتبها اتساق الأسلوب والاهتمام بالتفاصيل. الصبر أثناء مرحلة التعلم هو مفتاح الحل. والتي نشرتها Niimi 3، مع المعونة من أداة تعليمية الفيديو يقوم يأخذ في المتوسط من 11 محاولات لتحقيق أول الإجراء الناجح و78 محاولات لتحقيق نسبة نجاح 90٪. أصبحت أشرطة الفيديو أداة تعليمية هامة في جراحة 11،12.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها
نزيف من anastomoses قد تحدث وهذا هو الأرجح بسبب إما عدم وجود التوتر الصحيح في الغرز، أو عدد قليل جدا من الغرز. في حين أن وكيل تخثر حمل مثل جلفوم يمكن أن تكون مفيدة للحد من التسريبات، ونحن نوصي بأن الجراح يجب أن تعتمد على أسلوب جيد. ازدحام غير الضرب القلب هو الأكثر شيوعا نظرا لanastomoses التي هي ضيقة جدا، لا سيما في الجانب الوريدي. A غير beati-نانوغرام، هو سبب الكسب غير المشروع غير perfused-عادة من قبل فقاعة الهواء التي قد سافر إلى واحد من الشرايين التاجية. فمن المهم للحفاظ على حقل الرطوبة إلى الرطب لتجنب دخول فقاعات في الأوعية.
قيود تقنية
هذه التقنية ليست مناسبة إذا كان الباحث يريد التحقيق في الآثار المترتبة على قلب يعمل بشكل كامل. وهذا يتطلب تقنية زرع مثلي، الذي أثبت حتى الآن من المستحيل القيام بها.
أهمية فيما يتعلق بأساليب موجود
إذا كان أحد يرغب في دراسة الآثار على أوعية دموية بالكامل، زرع الأعضاء الصلبة في الماوس، ثم نموذج القلب وربما كان أبسط لإتقان. نماذج الماوس من الرئة والكلى وزراعة الكبد لا وجود لها، ولكن هي أصعب بكثير للتعلم والكمال.
الخطوات الحاسمة ضمن البروتوكول
فمن الأهمية بمكان أن سمك كامل عوتتحقق الحمير بما في ذلك الأوعية الدموية البرانية والبطانية من الإبرة خياطة. Evertion من حواف يضمن أيضا أن هناك البطانية إلى البطانية الاتصال، والذي يساعد في الشفاء والختم من anastomoses. وثمة عامل آخر في غاية الاهمية هو ضمان أن التوتر من خطوط الدرز توصيلي هو أيضا الأمثل. فضفاضة جدا، وسوف يكون هناك تسريب رجعة فيه، ضيقة جدا وتضيق لتدفق سينتج. إذا على الجانب الشرياني وهذا سوف يؤدي ذلك إلى ضعف التروية من الكسب غير المشروع، إذا على الجانب الوريدي فإن القلب يؤدي ازدحام.
قبل كل شيء، سوف التكرار، والاتساق الداخلي والاهتمام المستمر بالتفاصيل تسفر عن نتائج كبيرة وقابلة للتمويل والبيانات للنشر.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
الكتاب أود أن أشكر الدكتور بياجيو بيترا لعمله السابق في مختبرنا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | Roboz # | Fine Science Tools # | Arosurgical # |
| Straight micro-dissecting forcep #5 | RS-5015 | 11295-51 | |
| Curved micro-dissecting forcep #7 | RS-5047 | 11297-00 | |
| Curved serrated forcep | RS-5137 | 11052-10 | |
| Vannas micro-dissecting scissors, short | RS-5610 | 09.140.08 | |
| Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long | 11.602.11 | ||
| Micro spring handle needle holder | 11.549.15 | ||
| Straight mosquito forcep | 91308-12 | ||
| Micro-dissecting scissors, straight, blunt | RS-5962 | 14078-10 | |
| Micro-dissecting scissors, curved, blunt | RS-5981 | 14079-10 | |
| Micro retractor | RS-6540 | ||
| Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾” | RT-1350S | ||
| Silk suture, 5/0, 22.5 m spool | 18020-50 | ||
| 10/0 nylon | T4A10Q07 | ||
| 5/0 silk | E19A05N | ||
| Gloves | Biogel from Medex Supply | ||
| Drapes | Precept, #64-9012-9 | ||
| Syringes | B-D 1 cc insulin, #329424 | ||
| Cotton applicators | Fisher-brand, #23-400-100 | ||
| Povidone-Iodine swabs | PDI, #B40600 | ||
| 4/0 Cotton ties | Domestic cotton autoclaved with instruments |
References
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplant Proc. 5 (1), 733 (1973).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343 (1973).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3,000 operations by one surgeon. J Heart Lung Transplant. 20 (10), 1123 (2001).
- Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse. J Invest Surg. 26 (4), 223 (2013).
- Su, S., et al. Modified suture technique in a mouse heart transplant model. Asian J Surg. 34 (2), 86 (2011).
- Mao, M., et al. A novel and knotless technique for heterotopic cardiac transplantation in mice. J Heart Lung Transplant. 28 (10), 1102 (2009).
- Csencsits, K. L., Bishop, D. K. Contrasting alloreactive CD4+ and CD8+ T cells: there's more to it than MHC restriction. Am J Transplant. 3 (2), 107 (2003).
- Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy. Nat Protoc. 2 (3), 471 (2007).
- Linfert, D., Chowdhry, T., Rabb, H. Lymphocytes and ischemia-reperfusion injury. Transplant Rev. 23 (1), (2009).
- Grazia, T. J., et al. Acute cardiac allograft rejection by directly cytotoxic CD4 T cells: parallel requirements for Fas and perforin. Transplantation. 89 (1), 33 (2010).
- Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. J Vis Exp. (6), (2007).
- Plenter, R. J. Heterotopic heart transplantation in mice. European Society for Surgical Research. 45th Annual Congress. , (2010).
