Summary
Рукопись описывает шаги, необходимые для выполнения гетеротопической пересадку сердца у мышей.
Abstract
В настоящее время более сорока лет с тех пор этот метод был впервые сообщил Корри, Wynn и Рассела. Хотя на это потребовалось несколько лет для других лабораториях, чтобы стать специалистами в и использовать эту технику, в настоящее время широко используется во многих лабораториях по всему миру. Значительное уточнение к оригинальной методике была разработана и представлена в 2001 году на Niimi. Описанный здесь являются методы, которые развивались на протяжении более чем десяти лет в руках трех хирургов (Plenter, Grazia, Pietra) в нашем центре. Эти методы в настоящее время переданы молодому поколению хирургов и исследователей.
Опираясь главным образом на опыте Niimi, используемые процедуры развивались в мелких деталей - детали, которые мы постараемся рассказать здесь таким образом, что другие могут быть в состоянии использовать эту очень полезную модель. Как Niimi, мы обнаружили, что видео помощь обучения является бесценным ресурсом для новичка.
Introduction
В эпоху, когда это возможно, чтобы выполнить в почках, легких, печени и поджелудочной железы, пересадка на мышах, краеугольным камнем основной трансплантации органов и иммунологии исследований с 1973 года 1-4 остается гетеротопическая сердце модель трансплантации у мышей. За прошедшие годы несколько работ были опубликованы подробно улучшения / уточнения 5,6 к этой процедуре.
В качестве модели твердого органов, прежде всего, васкуляризированной трансплантации эта процедура является первоклассным. После того, как освоили эту процедуру поддается исследованию в аллогенных ответов отторжения 7, развитию хронических васкулопатий 8 и механизмов ишемии реперфузии 9.
Ключи для успешного обучения этой процедуры такие же, как и любая другая операция, терпения со стороны преподавателя и обучаемого и вниманием к деталям. В начале процесса новый хирург найдет, что тэй будет тратить много часов на каждом пересадки. По мере накопления опыта, хирургические раз, и поэтому ишемия, будет резко сократить. Обращая внимание на детали каждого шага, рано или поздно приведет к успеху.
В то время как инструктор может делать все возможное, чтобы пройти дальше, и предвидеть, все возможные падений ямы, которые могут возникнуть во время этих операций, "творческая" стажер, скорее всего, найти некоторые из своих собственных!
Основы процедуры заключаются в следующем. Донор возрастанию дуги аорты является конец-в-бок анастомозировали для получателя брюшной аорты и доноров легочной артерии является конец-в-бок анастомозировали для получателя брюшной нижней полой вены (НПВ). Кровь поступает из аорты реципиента в ретроградным способом через аорты донора к коронарных артерий. После того как кровь протекает через коронарной системы она стекает в правое предсердие через коронарный синус, перекачивается в правый желудочек изатем через легочную артерию в получателя IVC. Таким образом, коронарная система снабжена артериальной крови и синусовый ритм возвращается к трансплантата в течение 1-2 мин реперфузии. Поскольку левые камеры сердца, по существу, давление под загружены левого желудочка свободной стенки атрофируются со временем.
Protocol
Все животные были размещены под свободных от патогенов условиях в Университете Колорадо Барбара Дэвис Центр вивария под одобрения IACUC и заботу в соответствии с директивами NIH.
Глубина анестезии судят по ног крайнем случае первоначально и соблюдением частоты дыхания как только процедура началась.
1. Донорского сердца Урожай
- Обезболить мыши-донора путем введения пентобарбитала (60 мг / кг IP).
- Остановите мышь на 4-полосных ограничений и клип мех. Протрите кожу спиртом.
- После вскрытия от кожи, вскрыть брюшную полость, сделав поперечный разрез просто уступает диафрагмы.
- Отрежьте заднюю мембраны до реберной вставки и поднимите переднюю грудную стенку вперед и сверху подвергая сердце.
- Расширение полную толщину разрезать заднюю боковую грудную полость на левой и правой сторонах груди.
- Изолироватьнижняя полая вена (НПВ) и поместите свободную 5-0 шелковой нити вокруг IVC, прилегающей к его включения в правом предсердии.
- Введите 1.0 куб.см. 4 ° C гепаринизированным физиологическим раствором (200 ед / см) в НПВ, то перевязывать сосуд с 5-0 шелковой нити и разделить.
- Изолировать правильный верхней полой вены (rSVC) аналогичным образом и перевязывать с 5-0 шелковой нити и разделить.
- Аккуратно свернуть сердце к правой стороне животных и изолировать левую верхней полой вены (LSVC), перевязывать с 5-0 шелковой нити и разделить подвергая левую легочную артерию.
- Закрепите сердце под мокрой марли в то время как тимус является тупым, расчлененный от главной легочной артерии (ПА) и левой и правой ветвей ПА и восходящей аорты арку.
- Блант препарировать дуги аорты без окружающих тканей. Микро-ножницы используются для разделения аорты проксимальнее правой плечевой-головной артерии, то есть не должно быть никаких филиалов между сердцем и разделенияточка аорты.
- В этом разделе дуги аорты формирует артериальное манжету для процесса имплантации.
- Отражение аорты манжету книзу, чтобы выставить багажник PA и левые и правые ветви ПА.
- Блант рассекают левую и правую ветви PA от окружающих тканей, как недалеко от сердца, как это возможно. Это позволяет легко рассечения ствола Звуковая от окружающих тканей.
- Разделите ствол PA как дистально это возможно, только проксимальнее ее бифуркации. В этом разделе легочной артерии формирует венозный манжету для процесса имплантации.
- Поместите 5-0 шелковой нити вокруг основания сердца и галстук. Сердце затем разрезают бесплатно в основе, и помещают в 4 ° C физиологического раствора. Общее время сбора урожая составляет ок. 10-15 мин.
2. Сердце Имплантат Техника
- Обезболить мышей-реципиентов пентобарбиталом (60 мг / кг IP начальная доза 25 мг / кг IP дополнительной дозы при необходимости).
- Клип мех ииммобилизации мышь на 4-полосных ограничений и приготовительному кожу повидон-йода и драпировка в стерильных моды.
- Сделайте 2 см срединный вертикальный разреза брюшной полости и проникновения в брюшную полость.
- Уберите кишечника сверху и вовне на груди. Держите завернутый в стерильный влажной марлей (стерильный физиологический раствор) в течение случае.
- Изолировать брюшной аорты и нижней полой вены (НПВ) ниже почечных сосудов и поместить 4-0 хлопка связей вокруг аорты и IVC превосходит то уступает анастомоза.
- Выявление любых поясничные сосуды внутри области и перевязывать с 10-0 нейлоновой ниткой.
- Узел хлопковые связей, в первую уступает затем начальника. Таким образом некоторые сохраняется в крови в аорте решений aortotomy легче.
- Сформируйте aortotomy с иглой 30 G, чтобы войти в просвет аорты. Расширить разрез с мелкими микро ножницами до длины примерно 2 мм. Этот разрез сделан по прямой линии вдоль длиннойпродольный оси судна.
- Сделать конец в сторону анастомоза доноров аорты в аорту получателя в следующем виде. Наведите 10-0 нейлона шов пребывания стежок в в донорской аорты и в нижний угол разреза в аорте получателя и галстук. Поместите вторую 10-0 нейлона напротив первой в донорской аорты и верхней углу разрез в брюшной аорте и галстук.
- Сделайте работает линии шва от начальника к уступают в боковой стенке аорты и галстук против ранее размещенных пребывания стежка. Не забудьте принести интим (поверхностные Внутренний сосуд) вместе, как вы стежка. Тогда шов медиальной стороны в бегущей моды и галстук. Первый и последний стежок на каждой стороне должны быть размещены как можно ближе к отдыху стежков, насколько это возможно. Тогда цель иметь 3 равномерно расположенных швов между этими двумя, делая в общей сложности 5 строчек.
- Сделать конец в сторону анастомоза доноров легочной артерии получателю IVC в следующим образом. PunctЮр IVC с 30 G иглы и продлить разрез для ок. 2 мм с мелкими микро ножницы. Этот разрез сделан по прямой линии вдоль продольной оси судна.
- Свяжите доноров легочной артерии к нижней углу разрез в НПВ с 10-0 нейлона. Поместите вторую 10-0 нейлона напротив первой в донорской артерии и верхней углу разрез в НПВ и галстук.
- Сделайте работает линии шва между легочной артерией и НПВ и галстук. Первый и последний стежок на каждой стороне должны быть размещены как можно ближе к отдыху стежков, насколько это возможно. Тогда цель иметь 5 равномерно расположенных швов между этими двумя, делая в общей сложности 7 строчек.
- Отпустите дистального 4-0 хлопка галстук восстановлении венозный приток.
- После того, как было отмечено, гемостаз венозной анастомоза ближний 4-0 хлопок галстук постепенно ослабил и артериальная анастомоза наблюдается для гемостаза. Когда оба анастомозы считаются безопасными, удалите грОттон связывает с помощью мыши.
- Вернуться кишечника в брюшную полость. Брюшная стенка закрыта в два слоя с использованием 5-0 шелковых шва в запущенном моды.
- Администрирование 1,0 мл болюс стерильной теплой физиологического раствора в брюшную полость в виде инфузионной терапии при закрытии, и 0,8 мл физиологического раствора вводят подкожно после операции. Никакие другие меры поддержки не требуется во время операции. Восстановление животное на потепление одеяло. Всего имплантат время составляет ок. 90-120 мин для начинающих, 45-60 мин с опытом. Администрирование бупренорфин обезболивание, 0,05 мг / кг, SC, 0,1-0,2 мл в начале процедуры и каждые 6-12 ч в течение 72 ч после соч.
3. Оценка трансплантата
- Оценка функции трансплантата ежедневно транс-пальпации живота.
- Держите мышь, как будто это были быть переданы внутрибрюшинным.
- Аккуратно нажмите на кончик указательного пальца по отношению к брюшной стенке и выяснить, как бьется улength и регулярность трансплантата.
- Дайте КАЧЕСТВА пальпации оценку от 4 (нормальная амплитуда и частота) в 0 (не избиение отклонил трансплантата).
ВАЖНЫЕ ПРИМЕЧАНИЯ:
Все инструменты стерилизуются, стерильные перчатки носят в течение всей процедуры и стерильный поле поддерживается. Донор и реципиент операции выполняются с использованием операционного микроскопа. Убедитесь, что анастомозы "чистыми". То есть, что задние стены не поймали при размещении швов. Это приведет к значительным сужение течь, что, скорее всего, результат в неудачной трансплантата и в крайних случаях, чтобы задних конечностей паралич. Это также важно, чтобы толщина полный проходит в том числе адвентиции сосудов и внутренней оболочкой из шовной иглы будут достигнуты. Evertion краев также гарантирует, что есть интим-на-интиме контакт, который помогает в герметизации и заживление анастомоза. Другой жизненно важный фактили является обеспечение того, натяжение анастомоза линий швов, также является оптимальным. Слишком свободный и там будет необратимым утечка, слишком туго и стриктуры течь приведет. Если на артериальной стороне это приведет к недостаточной перфузии трансплантата, если на венозной стороне сердца перегруженным приведет.
Representative Results
Использование этой хирургической техники открывает путь как для простых выживаемость трансплантата / отторжения исследований или достаточно сложных экспериментальных протоколов. В исследовании кратко описанного на рисунке ниже, мы стремились определить причастность, если таковые имеются, ФАС и / или перфорина как механизмов лимфоцитов CD4 опосредованной сердечной отторжения. Это стало возможным внеочередным массив линий мышей, которые доступны сегодня. Результаты показывают, что прямой отказ от сердечных аллотрансплантатов по CD4 эффекторных Т-клеток требуется альтернативный вклад трансплантата Fas выражения и выражения ячейки перфорина T. Насколько нам известно, это первая демонстрация, что цитолитическую активность лимфоцитами CD4 может играть облигатным роль первичного острого отторжения трансплантата в естественных условиях.
1.jpg "/>
. Рисунок 1 Перфорин и Fas Представляете облигатных и параллельные пути из CD4 Т-клеточно-опосредованный отторжение сердечных В6, В6 PFPKO (перфорин выбивки) и B6 GLD (Fas-лиганд дефицитные) CD4 Т-клетки были использованы для восстановления B6 тряпку - / - получатели С3Н дикого типа или Fas-дефицитных C3h LPR сердечных аллотрансплантатов. Удаление только Fas (♦, р = NS по сравнению с контрольной Вт C3h + В6 CD4 T-клетки) от донора сердца или удаления или только перфорина от CD4 Т-клеток (■, р = NS по сравнению с контрольной Вт C3h + В6 CD4 Т клетки) не отменил отказ. Интересно, что удаление FasL от эффекторных лимфоцитов CD4 сделал отказ задержки значительно (●, р <0,02 в сравнении Вт С3Н + В6 лимфоцитов CD4, р <0,01 по сравнению с Вт С3Н + В6 PFPKO лимфоцитов CD4, и р <0,01 по сравнению с . С3Н LPR + B6 CD4 T-клетки). Однако большинство аллотрансплантатов все еще отклонены (4 из 5). Важно отметить, что одновременное удаление обоих доноров Fas и CD4 Т-клеток перфоринаполностью аннулировал отказ (○, р <0,002 по сравнению с контрольной Вт C3h + B6 CD4 Т-клетки, Вт С3Н + B6 PFPKO CD4 Т-клетки, и С3Н LPR + B6 CD4 Т-клетки). Это отмена была значительно более надежными, чем индивидуального удаления лимфоцитов CD4 FasL (○, р <0,003 по сравнению с контроль-Вес С3Н + В6 GLD CD4 T-клетки). От Grazia и др. 10. Печатается с разрешения.
Discussion
Эта хирургическая техника не прост в освоении, но после освоения является мощным инструментом исследования. Исследователь / хирург награжден консистенции техники и вниманием к деталям. Терпение на этапе обучения является ключевым фактором. По опубликованным на Niimi 3, с помощью видео на основе учебного пособия, которое требуется в среднем 11 попыток достичь первый успешный порядок и 78 попытки по достижению 90% успеха. Видео стали важным инструментом обучения в хирургии 11,12.
Поиск неисправностей
Кровотечение из анастомозов может произойти, и это, скорее всего, в результате либо отсутствие правильного напряженности в швами, или слишком мало швов. Хотя свертывания вызывая агента, такого как Gelfoam может быть полезным для снижения утечек, мы рекомендуем, чтобы хирург должен полагаться на хорошей техникой. Насыщенный без бьющееся сердце является чаще всего из-за анастомозов, которые слишком туго, особенно на венозной стороне. Не-Beatiнг, не перфузии трансплантата обычно вызывается пузырька воздуха, который прошел в одном из коронарных артерий. Важно поддерживать влажную к влажным поле, чтобы избежать попадание пузырьков в сосудах.
Ограничения техники
Этот метод не подходит, если исследователь хочет расследовать влияние на полностью функционирующего сердца. Это потребует Ортотопическая технику трансплантации, которая на сегодняшний день оказалось невозможным выполнить.
Значение в отношении существующих методов
Если кто-то хочет, чтобы изучить эффекты на полностью васкуляризированной, твердой трансплантации органов у мышей, то модель сердца, вероятно, самый простой в освоении. Мышиные модели из легких, почек и трансплантации печени действительно существуют, но гораздо труднее учиться и совершенным.
Критические шаги в рамках протокола
Это жизненно важно, что полная толщина рослы, включая адвентиции сосудов и внутренней оболочкой шовной иглы будут достигнуты. Evertion краев также гарантирует, что есть интим-на-интиме контакт, который помогает в герметизации и заживление анастомоза. Другой жизненно важным фактором является обеспечение того, чтобы натяжение анастомоза линий швов, также является оптимальным. Слишком свободный и там будет необратимым утечка, слишком туго и стриктуры течь приведет. Если на артериальной стороне это приведет к недостаточной перфузии трансплантата, если на венозной стороне сердца перегруженным приведет.
Прежде всего, повторения, последовательность процедуры и постоянного внимания к деталям даст большие результаты и финансируемыми и публикуемые данные.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить доктора Бьяджо Pietra за его предыдущей работы в нашей лаборатории.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | Roboz # | Fine Science Tools # | Arosurgical # |
| Straight micro-dissecting forcep #5 | RS-5015 | 11295-51 | |
| Curved micro-dissecting forcep #7 | RS-5047 | 11297-00 | |
| Curved serrated forcep | RS-5137 | 11052-10 | |
| Vannas micro-dissecting scissors, short | RS-5610 | 09.140.08 | |
| Micro-dissecting scissors, straight, sharp, long | 11.602.11 | ||
| Micro spring handle needle holder | 11.549.15 | ||
| Straight mosquito forcep | 91308-12 | ||
| Micro-dissecting scissors, straight, blunt | RS-5962 | 14078-10 | |
| Micro-dissecting scissors, curved, blunt | RS-5981 | 14079-10 | |
| Micro retractor | RS-6540 | ||
| Instrument tray, 10” x 6 ½” x ¾” | RT-1350S | ||
| Silk suture, 5/0, 22.5 m spool | 18020-50 | ||
| 10/0 nylon | T4A10Q07 | ||
| 5/0 silk | E19A05N | ||
| Gloves | Biogel from Medex Supply | ||
| Drapes | Precept, #64-9012-9 | ||
| Syringes | B-D 1 cc insulin, #329424 | ||
| Cotton applicators | Fisher-brand, #23-400-100 | ||
| Povidone-Iodine swabs | PDI, #B40600 | ||
| 4/0 Cotton ties | Domestic cotton autoclaved with instruments |
References
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplant Proc. 5 (1), 733 (1973).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343 (1973).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3,000 operations by one surgeon. J Heart Lung Transplant. 20 (10), 1123 (2001).
- Plenter, R. J., Zamora, M. R., Grazia, T. J. Four decades of vascularized heterotopic cardiac transplantation in the mouse. J Invest Surg. 26 (4), 223 (2013).
- Su, S., et al. Modified suture technique in a mouse heart transplant model. Asian J Surg. 34 (2), 86 (2011).
- Mao, M., et al. A novel and knotless technique for heterotopic cardiac transplantation in mice. J Heart Lung Transplant. 28 (10), 1102 (2009).
- Csencsits, K. L., Bishop, D. K. Contrasting alloreactive CD4+ and CD8+ T cells: there's more to it than MHC restriction. Am J Transplant. 3 (2), 107 (2003).
- Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy. Nat Protoc. 2 (3), 471 (2007).
- Linfert, D., Chowdhry, T., Rabb, H.
- Grazia, T. J., et al. Acute cardiac allograft rejection by directly cytotoxic CD4 T cells: parallel requirements for Fas and perforin. Transplantation. 89 (1), 33 (2010).
- Liu, F., Kang, S. M.
- Plenter, R. J.
