Introduction
तंत्रिका ऊतक इंजीनियरिंग में चल रही चुनौतियों में से एक तंत्रिकाओं स्वाभाविक रूप से बढ़ने जहां अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स, mimics कि एक तंत्रिका नाली (नेकां) पैदा कर रही है. रिसर्च कोशिकाओं यांत्रिक, स्थलाकृतिक, चिपकने वाला और रासायनिक संकेतों 1-3 सहित अपने वातावरण में कई कारकों का जवाब है कि दिखाया गया है. इस क्षेत्र में प्राथमिक चुनौतियों में से एक संकेत के उचित संयोजन का निर्धारण करने और कोशिकाओं की वृद्धि 4 समर्थन करने के लिए एक विस्तारित अवधि के लिए संकेतों बनाए रख सकते हैं कि एक प्रणाली fabricating है. परिधीय न्यूरॉन्स एक नरम सब्सट्रेट पसंद करने के लिए जाना जाता है, गठबंधन फाइबर द्वारा निर्देशित किया, और तंत्रिका वृद्धि कारक (NGF) 5-7 का जवाब. सप्ताह के लिए रासायनिक संकेतों प्रदान कर सकते हैं कि NCS करीब allografts, तंत्रिका मरम्मत 8,9 के लिए वर्तमान सोने के मानक की है कि सुधार कार्यात्मक वसूली प्रदान करने के लिए दिखाया गया है.
माल और उत्पादन के तरीके विभिन्न यांत्रिक और स्थलाकृतिक निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैअल 10-13 cues. यांत्रिक संकेतों 1,13 महत्वपूर्ण आवेदन के लिए उपयुक्त सामग्री का चयन करने, सामग्री चुना करने के लिए निहित हैं. उत्पादन के तरीके स्थलाकृतिक संकेतों चरण जुदाई, स्वयं विधानसभा और 1,13 electrospinning शामिल नियंत्रित करने के लिए. Microscale अनुप्रयोगों, microfluidics, photopatterning, नक़्क़ाशी, नमक leaches, या गैस foams के लिए भी 14-17 इस्तेमाल किया जा सकता है. Electrospinning कारण अपने लचीलापन और उत्पादन 13,18-23 की आसानी के लिए टिशू कल्चर के लिए रेशेदार substrates इंजीनियर सबसे लोकप्रिय तरीके के रूप में उभरा है. Electrospun nanofibers वह खुद को पीछे हटाना और 24 का निर्वहन करने के लिए एक कम अंतराल में खिंचाव पैदा करने के लिए एक बहुलक समाधान के लिए एक उच्च वोल्टेज लगाने से गढ़े हैं. एक गठबंधन पाड़ एक उड़ान घूर्णन खराद का धुरा पर फाइबर इकट्ठा करके बनाया जा सकता है और Nonaligned scaffolds के एक स्थिर थाली 25 पर एकत्र कर रहे हैं. आसंजन संकेतन रेशेदार पाड़ बुद्धि कोटिंग से प्राप्त किया जा सकता हैज फ़ाइब्रोनेक्टिन या 26 electrospinning पहले हेक्टेयर में ऐसे RGD रूप में एक आसंजन पेप्टाइड, conjugating.
वे नियंत्रित रिहाई के लिए एक स्रोत की जरूरत है क्योंकि इस तरह की वृद्धि कारकों के रूप में रासायनिक संकेतों, विस्तारित अवधि में बनाए रखने के लिए सबसे मुश्किल है. कई प्रणालियों सफलता के स्तर पर अलग से electrospun रेशेदार नेटवर्क को नियंत्रित रिहाई जोड़ने का प्रयास किया गया है. इन तरीकों मिश्रण electrospinning, पायस electrospinning, कोर खोल electrospinning और प्रोटीन संयुग्मन 27 में शामिल हैं. साथ ही, electrospinning परंपरागत इसलिए प्रोटीन की bioactivity विचार किया जाना चाहिए बनाए रखने, प्रोटीन 28 की व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकते हैं, जो एक अस्थिर विलायक, में किया जाता है.
यह दृष्टिकोण विशेष रूप से परिधीय तंत्रिका के विकास के लिए एक tunable पाड़ बनाने के लिए यांत्रिक, स्थलाकृतिक, रासायनिक और चिपकने वाला संकेतों के संयोजन पते. पाड़ यांत्रिकी ठीक synthesizing द्वारा नियंत्रित किया जाता हैmethacrylated Hyaluronic एसिड (हेक्टेयर). methacrylation साइटों फोटो प्रतिक्रियाशील crosslinkers संलग्न करने के लिए उपयोग किया जाता है. Crosslinked सामग्री अब पानी में घुलनशील है और विशेष रूप से एंजाइम 29 से टूट जाता है. crosslinking की राशि गिरावट की दर, यांत्रिकी और सामग्री के अन्य भौतिक गुणों में परिवर्तन. ~ 500 Pa की तन्यता मापांक है जो 30% methacrylation, साथ हा का प्रयोग, तंत्रिका ऊतक के देशी यांत्रिकी के करीब है और आम तौर पर न्यूरॉन्स 26,29 द्वारा पसंद किया जाता है कि एक नरम सब्सट्रेट बनाता है. एक घूर्णन खराद का धुरा पर electrospinning एक स्थलाकृतिक क्यू के लिए गठबंधन फाइबर बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है. Microspheres के साथ electrospinning का उपयोग बढ़ाया अवधि में पाड़ के भीतर रासायनिक संकेतों प्रदान करता है. रासायनिक संकेत बनाने के लिए उपयोग किया जाता है NGF युक्त neurite विकास microspheres का समर्थन करने के लिए. NGF उत्पादन के दौरान कठोर सॉल्वैंट्स का सामना नहीं करता है तो सबसे electrospun सामग्री के विपरीत हा पानी में घुलनशील है. , एससीए एक चिपकने वाला संकेत जोड़ने के लिएffold फ़ाइब्रोनेक्टिन साथ लेपित है. NGF फ़ाइब्रोनेक्टिन (चिपकने वाला) के साथ लेपित microspheres (कैमिकल) जारी करने के साथ नरम (मैकेनिकल) गठबंधन (स्थलाकृतिक) फाइबर: पूरा सिस्टम ऊपर वर्णित संकेतों के सभी चार प्रकार के होते हैं. उत्पादन और इस प्रणाली का परीक्षण इस प्रोटोकॉल में वर्णित है.
प्रक्रिया एक पानी में तेल में जल डबल पायस साथ microspheres के उत्पादन के साथ शुरू होता है. पायस एक surfactant, polyvinyl शराब (PVA) के साथ स्थिर है. भीतरी पानी चरण प्रोटीन होता है. यह DICHLOROMETHANE (डीसीएम) में भंग PLGA खोल सामग्री युक्त, तेल चरण में जोड़ा जाता है, surfactant डीसीएम से प्रोटीन की रक्षा चरणों के बीच एक बाधा पैदा करता है. इस पायस microspheres की बाहरी सतह बनाने के लिए PVA युक्त एक और पानी चरण में छितरी से है. स्थिर पायस डीसीएम लुप्त हो जाना करने की अनुमति हड़कंप मच गया है. Rinsing और lyophilizing बाद आप सूखी microspheres शेष भाग के साथ छोड़ दिया जाता हैप्रोटीन aining.
Microspheres पूरा करने के बाद वे scaffolds में electrospun होने के लिए तैयार हैं. सबसे पहले आप electrospinning समाधान तैयार है. समाधान की चिपचिपाहट उचित फाइबर के गठन के लिए महत्वपूर्ण है. शुद्ध हा का समाधान इस आवश्यकता को पूरा नहीं करते; पीईओ electrospinning के लिए अनुमति देने के लिए एक वाहक बहुलक के रूप में जोड़ा गया है. microspheres भर में वितरित microspheres के साथ एक रेशेदार पाड़ में जिसके परिणामस्वरूप समाधान और electrospun में जुड़ जाते हैं.
उत्पादन पूरा हो गया है एक बार, प्रोटीन इसकी व्यवहार्यता को सत्यापित करने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए. ऐसा करने के लिए, NGF का जवाब है कि एक प्राथमिक सेल का इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल 8-10 दिन पुरानी चिकन भ्रूण से पृष्ठीय रूट ganglia (डीआरजी) का उपयोग करता है. सेल बंडलों NGF या खाली हैं कि लोगों के साथ भरा microspheres युक्त scaffolds पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं. NGF अभी भी व्यवहार्य है, तो आप NGF युक्त scaffolds पर बढ़ाया neurite विकास देखना चाहिए. NGF अब कोई व्यवहार्य है, तो यह होगानहीं करने के लिए विस्तार neurites को बढ़ावा देने और नियंत्रण के समान दिखाई देनी चाहिए.
यहाँ बताया सटीक प्रक्रिया सामग्री को सरल संशोधनों, electrospinning विधि, और प्रणाली विभिन्न सेल और ऊतक प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है प्रोटीन के साथ, तथापि, तंत्रिका समर्थन पर ध्यान केंद्रित किया है.
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Protocol
1 पानी / तेल / पानी डबल पायस Microsphere उत्पादन
- पहले 2% और विआयनीकृत पानी में polyvinyl शराब (PVA) के वी समाधान w / 0.5% तैयार करते हैं. स्पष्ट जब तक 50 डिग्री सेल्सियस पर समाधान हिलाओ, यह कई घंटे लग सकते हैं. विआयनीकृत पानी में 2% वी / वी isopropyl शराब की एक समाधान तैयार है.
- वांछित हाइड्रोफिलिक प्रोटीन की एक जलीय घोल तैयार करें. नीचे दी गई तालिका उदाहरण योगों प्रदान करता है.
तालिका 1:. उदाहरण प्रोटीन समाधान निम्नलिखित प्रोटीन समाधान सफलतापूर्वक समझाया और electrospun इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया गया है. जरूरत के रूप में अन्य हाइड्रोफिलिक प्रोटीन समाधान किया जा सकता है.
- एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में 0.5% PVA समाधान के 40 मिलीलीटर प्लेस और रद्द करना.
- एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में 65:35 के 300 मिलीग्राम भंगपाली DICHLOROMETHANE के 3 मिलीलीटर में (लैक्टिक सह एसिड) (PLGA). एक भंवर मिक्सर PLGA विघटन में तेजी लाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- प्रोटीन समाधान के 200 μl और 2% PVA समाधान के 4 μl जुडा है. PLGA समाधान में प्रोटीन मिश्रण डालो (1.4 कदम). समाधान ज्यादातर अलग रहेगा.
- बर्फ के पानी की एक बीकर में ट्यूब रखें. ~ 10 वाट (आरएमएस) पर एक छड़ी sonicator का उपयोग करना, एक समान मलाईदार सफेद पायस बनाई गई है जब तक कुछ ही सेकंड (5-10) के लिए समाधान आंदोलन.
- 0.5% PVA (कदम 1.3) युक्त 50 मिलीलीटर ट्यूब में पायस डालो. ~ 20 सेकंड के लिए एक भंवर मिक्सर पर उच्च गति से समाधान मिलाएं. समाधान एक बादल उपस्थिति का विकास होगा.
- 2 मिनट के लिए 350 rpm पर एक हलचल प्लेट पर एक 200 मिलीलीटर बीकर और जगह पर पायस स्थानांतरण. हलचल थाली पर बीकर 2% isopropyl शराब के 50 मिलीलीटर जोड़ें. मिश्रण कठोर डीसीएम लुप्त हो जाना करने की अनुमति 1 घंटा की एक न्यूनतम और PLGA के लिए सरगर्मी जारी रखने की अनुमति दें.
- स्थानांतरण टीवह अपकेंद्रित्र ट्यूबों में समाधान microsphere.
- 3 मिनट के लिए 425 XG पर अपकेंद्रित्र. microspheres ट्यूब के नीचे इकट्ठा और सफेद दिखाई देगा. ध्यान microspheres ऊपर, ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला हटाने, और एक 500 मिलीलीटर की बोतल में स्टोर.
- पूर्ण ट्यूब तीन तिमाहियों भरने और यह तरल में microspheres फिर से विभाजित करने के झटकों से विआयनीकृत पानी के साथ microspheres कुल्ला.
- दोहराएँ 1.10 और 1.11 में चार बार दोहराएँ.
- अंतिम कुल्ला के बाद, अन्य नमूनों के साथ 500 मिलीलीटर की बोतल में फिर से और जगह सतह पर तैरनेवाला हटायें. तो कम से कम 24 घंटे के लिए lyophilize, अपकेंद्रित्र ट्यूब में एकत्र microspheres रुक.
- एक प्रकाश खुर्दबीन के नीचे या एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ microspheres कल्पना. 60 माइक्रोन से भी बड़ा microspheres प्रभावी electrospinning के लिए कर रहे हैं. Microspheres भी बड़े हैं, अब sonicating या vortexing बार कदम 1.6 या 1.7 में आवश्यक हो सकता है. <ली> एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में सूखे microspheres स्टोर.
- वैकल्पिक: कदम 1.10 30 से 500 मिलीलीटर की बोतल में प्रोटीन की मात्रा का परीक्षण करने के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार, एक प्रोटीन परख का प्रयोग करें. इस microspheres में समझाया प्रोटीन के उत्पादन की प्रक्रिया में इस्तेमाल किया गया था क्या से समाधान की राशि को घटाकर द्वारा प्रतिशत की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
. Microsphere में प्रोटीन स्थान PLGA समाधान 31 Rhodamine मिलीलीटर 2 माइक्रोग्राम / जोड़ने और एक FITC संयुग्मित प्रोटीन encapsulate कल्पना करने के लिए 1 एक उदाहरण से पता चलता है: ध्यान दें.
Microspheres के साथ 2 Electrospinning
- पहले electrospinning समाधान की तैयारी करने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस भंग करके विआयनीकृत पानी में photoinitiator के एक 0.5% w / v समाधान, बनाएँ. इस प्रक्रिया में कई घंटे लग सकते हैं.
- Hyaluronic एसिड (MeHA) methacrylated वी 29, 3% (Burdick एट अल. संश्लेषण के लिए देखें) w / 2% बनाएँ/ वी 900 केडी पाली (ethylene ऑक्साइड) (पीईओ) और डब्ल्यू 0.05% / विआयनीकृत पानी में वी फोटो सर्जक समाधान डब्ल्यू.
- वांछित मात्रा के लिए MeHA और पीईओ की सही मात्रा की गणना. उदाहरण के लिए, समाधान electrospinning के 10 एमएल MeHA की 200 मिलीग्राम और पीईओ की 300 मिलीग्राम की आवश्यकता है.
- वांछित अंतिम मात्रा (इस उदाहरण के लिए 9 मिलीलीटर) के 90% से कम विआयनीकृत पानी में पीईओ भंग. यह कई घंटे लग सकते हैं, 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म हलचल थाली या पानी स्नान प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- अगला MeHA जोड़ने और स्पष्ट जब तक समाधान हलचल एक भंवर मिक्सर का उपयोग करें. यह केवल कुछ ही मिनट लगेंगे.
- अंत में शेष 10% मात्रा (इस उदाहरण के लिए 1 मिलीलीटर) को भरने के लिए 0.5% फोटो सर्जक समाधान जोड़ने.
- 400 मिलीग्राम / एमएल अप करने के लिए वांछित एकाग्रता में microspheres जोड़ें. Microspheres समान रूप से समाधान में वितरित कर रहे हैं जब तक एक भंवर मिक्सर पर समाधान मिलाएं.
- एक सिरिंज का हल स्थानांतरण और एक 6 इंच 18 गेज बीएल देतेUNT टिप सुई.
- एक सिरिंज पंप में सिरिंज प्लेस और यह 1.2 मिलीग्राम / घंटा पर वितरित करने के लिए निर्धारित किया है.
- संग्रह थाली या खराद का धुरा पर एल्यूमीनियम पन्नी की एक परत टेप. यह समाप्त पाड़ की आसान सफाई और भंडारण के लिए अनुमति देता है. एक घूर्णन खराद का धुरा गठबंधन फाइबर बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है. एक फ्लैट प्लेट या स्थिर खराद का धुरा बेतरतीब ढंग से व्यवस्था की तंतुओं में परिणाम होगा.
- संग्रह तंत्र के लिए एक उच्च वोल्टेज बिजली स्रोत से जमीन तार कनेक्ट करें. सुई को सकारात्मक नेतृत्व कनेक्ट करें.
- सुई टिप और संग्रह की सतह के बीच 15 सेमी है कि वहाँ तो सिरिंज पंप और संग्रह की सतह को समायोजित करें.
- समाधान सिरिंज के अंत में दिखाई देता है जब, बहुलक पम्पिंग शुरू, वोल्टेज स्रोत पर बारी और 24 केवी चेतावनी वोल्टेज निर्धारित:. प्रणाली के किसी भी धातु हिस्सा नहीं टिकते पर वोल्टेज चालू हो जाने के बाद. प्रभारी भी त्वचा को विद्युतीकृत हिस्सों से कम दूरी कूद सकता है.
- डी तक हल चलानेesired पाड़ मोटाई हासिल की है. पूरा वोल्टेज स्रोत और सिरिंज पंप बंद कर देते हैं.
- पाड़ संलग्न साथ पन्नी निकालें. प्रोटीन युक्त पूरे किए scaffolds के एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में जमा हो जाती है.
3 प्रोटीन bioactivity परीक्षण
- सेल संस्कृति मीडिया तैयार करें. जोड़ें 10% वी / वी भ्रूण गोजातीय सीरम Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम करने के लिए, 1% वी / वी एल glutamine, और 1% वी / वी पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन.
- एक अच्छी तरह से थाली में पूरी तरह से फिट है कि चयन कांच coverslips.
- निर्माता द्वारा वर्णित के रूप में coverslips के इलाज के लिए 3 (Trimethoxysilyl) propyl methacrylate का प्रयोग करें. Methacrylation coverslips को पाड़ पालन को बढ़ाता है.
- Electrospinning से पहले हटाने योग्य दो तरफा टेप के साथ electrospinner का संग्रह क्षेत्र को methacrylated coverslips संलग्न. Coverslips पर स्पिनिंग हैंडलिंग और देखने को आसान बनाता है.
- ऊपर वर्णित के रूप में वांछित मोटाई को Electrospin.
- एकfter ध्यान से खराद का धुरा से coverslips निकालें electrospinning. एक स्पष्ट नाइट्रोजन कक्ष में पाड़ लेपित coverslips प्लेस और सभी ऑक्सीजन पर्ज है कि यह सुनिश्चित करें.
- 15 मिनट के लिए एक 10 मेगावाट / 2 सेमी 365 एनएम प्रकाश के तहत कक्ष और पाड़ रखें. उचित आकार अच्छी तरह से थाली में जगह crosslinking के बाद. पाड़ पक्ष का सामना करना पड़ रहा है कि यह सुनिश्चित करें.
- 30 मिनट के लिए एक कीटाणुनाशक दीपक के तहत जगह scaffolds बाँझ. वांछित फ़ाइब्रोनेक्टिन या अन्य प्रोटीन कोशिका आसंजन बढ़ाने के लिए एक परत के रूप में प्रयोग किया जाता है. कोट scaffolds के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें.
- हार्वेस्ट पृष्ठीय रूट ganglia (डीआरजी) के रूप में पहले Hollenbeck 32 से वर्णन किया. एक डीआरजी का परीक्षण प्रत्येक पाड़ कवर coverslip के लिए आवश्यक हो जाएगा.
- अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक पाड़ पर मीडिया के 100-200 μl रखें. सावधानी मीडिया छोटी बूंद में प्रत्येक पाड़ पर एक DRG जगह है. मोटी पाड़ के लिए अधिक मीडिया की जरूरत हो सकती है; डीआरजी पूरी तरह से जलमग्न और floa नहीं करने की आवश्यकता हैting.
- सेल पाड़ का पालन करने के लिए अनुमति देने के लिए 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पाड़ और DRG सेते हैं.
- अच्छी तरह के लिए उचित स्तर पर मीडिया भरें और वापस इनक्यूबेटर में जगह है. 4-6 दिनों के लिए incubating जारी रखें.
- ऊष्मायन अवधि के बाद ध्यान से अच्छी तरह से प्रत्येक से मीडिया को दूर करने और धीरे पीबीएस के साथ एक बार धो लो. / वी paraformaldehyde डब्ल्यू 4% का उपयोग कर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक करें.
- Neurofilament के लिए एक एंटीबॉडी दाग का उपयोग कोशिकाओं दाग. इस मात्रा का ठहराव के लिए neurite परिणाम की visualizing अनुमति देगा. DAPI भी कोशिकाओं के नाभिक देखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक उदाहरण धुंधला प्रोटोकॉल Sundararaghavan और उनके सहयोगियों ने 14 से वर्णित किया गया था.
- एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कोशिकाओं कल्पना.
- खुर्दबीन के मंच पर अच्छी तरह से थाली रखें.
- DAPI के लिए फिल्टर और उत्तेजना सेटिंग्स का उपयोग सेल जन जानें.
- सेल एक बार विस्तारित neurites कल्पना करने के लिए FITC के लिए फिल्टर स्विच है. यूइकट्ठा करने और पूरा ढांचा देखने के लिए आवश्यक के रूप में कई चित्र संयोजन माइक्रोस्कोप पर सिलाई समारोह गाते हैं. DAPI, FITC और उज्ज्वल क्षेत्र के लिए दोहराएँ.
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Representative Results
एक 85% से अधिक प्रोटीन encapsulation के साथ व्यास में microspheres ± 14 माइक्रोन 50 लगातार उत्पादन और scaffolds में electrospun किया गया है. साइज तीन अलग उत्पादन बैचों से microspheres के नमूने इमेजिंग द्वारा निर्धारित किया गया था. वाणिज्यिक प्रयोगशाला सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मापा जाता है जहां एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप और लंबाई पर कब्जा कर लिया जहां छवियों. 1 चित्रा आकार के वितरण की एक हिस्टोग्राम से पता चलता है. इनकैप्सुलेशन दर भी उत्पादन की प्रक्रिया के दौरान भाग निकले कि प्रोटीन बढ़ाता द्वारा, तीन अलग microsphere बैचों से परीक्षण किया गया था.
चित्रा 2 के भीतर समझाया PLGA खोल और गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) -FITC में Rhodamine (2 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ प्रतिनिधि microspheres से पता चलता है. छवियों को एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लिया गया. खोल स्पष्ट रूप से आंतरिक (हरा) पर केंद्रित प्रोटीन के साथ (लाल) को देखा जा सकता है.
, Microsphere encapsulation का मूल्यांकन करने के लिएएस बीएसए से भरा है और एक ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख के साथ प्रोटीन रिहाई के लिए परीक्षण किया गया. PLGA प्रोटीन से बचने के लिए बड़े अंतराल बनाने, एस्टर बांड की hydrolysis से टूट जाती है. microspheres 60 से अधिक दिनों (चित्रा 3) के लिए जारी करने के लिए जारी है. microspheres नीचे तोड़ने के रूप में एक प्रारंभिक फट तो जारी है साथ रिलीज शुरू होता है.
Microspheres electrospinning बाद 3 डी रेशेदार संरचना भर में देखा जा सकता है. 4 (तीर द्वारा संकेत) क्षेत्रों कई परतों में देखा जा सकता है जहां पूरा पाड़ की एक SEM छवि से पता चलता है. Scaffolds में microspheres का वितरण 15.3 ± 3.6 क्षेत्रों / 2 मिमी होना मापा गया था. पाड़ लक्ष्य साइट से दूर प्रवास को रोकने के लिए जगह में microspheres रखती है. Microspheres नीचे तोड़ के रूप में वे neurite विकास 33,34 प्रोत्साहित करने के लिए पाड़ में NGF जारी. इस के विकास का समर्थन करने के लिए पाड़ भर में प्रोटीन की एक निरंतर वितरण बनाता है कोशिकाओं और प्रोत्साहित कोशिकाओं पाड़ में घुसपैठ करने के लिए.
अंत में, पृष्ठीय रूट ganglia (डीआरजी) पाड़ के भीतर, microspheres में NGF की व्यवहार्यता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया. 5 एक DRG उन में कोई प्रोटीन के साथ अगले एक युक्त microspheres को NGF के साथ लोड microspheres युक्त पाड़ पर वरीयता प्राप्त पता चलता है. NGF व्यवहार्य बने रहे और विकास उत्तेजक है यह दर्शाता है कि NGF पाड़ पर DRG से विस्तार दिखाई अब neurite एक्सटेंशन, कर रहे हैं.
चित्रा 1 Microsphere आकार वितरण. इस प्रोटोकॉल के द्वारा उत्पादित microspheres व्यास में ± 14 माइक्रोन 50 हैं. ग्राफ 5 माइक्रोन डिब्बे में microsphere व्यास की एक हिस्टोग्राम से पता चलता है.
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Microspheres. 2 माइक्रोग्राम / एमएल Rhodamine चित्रा 2 फ्लोरोसेंट छवि microsphere खोल (लाल) और बीएसए-FITC प्रोटीन (हरा) कल्पना करने के लिए समझाया था कल्पना करने PLGA समाधान में शामिल किया गया था. प्रोटीन स्पष्ट रूप से क्षेत्र के भीतर देखा जा सकता है. स्केल बार = 20 माइक्रोन. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3 प्रोटीन रिलीज वक्र. 60 से अधिक दिनों एक ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख का उपयोग करके मापा गया था microspheres से बीएसए रिहाई. प्रारंभिक फट बाहरी सतह से जुड़ा था कि बीएसए की वजह से होने की संभावना है. PLGA टूट जाती है, प्रोटीन समय के साथ जारी किया गया है.
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चित्रा microspheres युक्त 4 पाड़. Electrospinning प्रक्रिया microspheres पाड़ की गहराई भर में शामिल किए जाने की अनुमति देता है. Microspheres के स्थान का संकेत (ए) तीर. यह ऊपर पाड़ से nanofibers साथ एक microsphere की स्केल बार = 500 माइक्रोन. (ख) उच्च बढ़ाई छवि. स्केल बार = 20 माइक्रोन. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 5 NGF bioactivity टेस्ट. पृष्ठीय रूट ganglia प्राथमिक कोशिकाओं 8 दिन पुराने लड़की अंडे से काटा और NGF भरा microspheres (ए) या खाली microspheres (बी) के साथ scaffolds पर वरीयता प्राप्त थे. DRGsसेल नाभिक कल्पना करने के लिए एक neurofilament एंटीबॉडी, FITC माध्यमिक एंटीबॉडी और DAPI साथ दाग रहे थे. FITC दाग neurites (हरी) ने संकेत दिया छवियां NGF लोड microspheres की उपस्थिति में neurite परिणाम में वृद्धि हुई दिखा. इस NGF व्यवहार्य है और विकास को बढ़ावा देने के कर सकते हैं जारी पता चलता है. छवियाँ एक confocal खुर्दबीन के साथ ले जाया गया. स्केल बार = 200 माइक्रोन. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
कई अध्ययनों से तंत्रिका कोशिकाओं स्थलाकृतिक संकेतों (फाइबर संरेखण) और रासायनिक संकेतों (वृद्धि कारक) 1,2,10,11,35 द्वारा निर्देशित किया जा सकता है कि पता चला है. Electrospinning गठबंधन फाइबर बनाने के लिए एक सरल तरीका है. वृद्धि कारकों तंत्रिका वृद्धि लेकिन तंत्रिका conduits (नेकां) में उन्हें शामिल करने के क्रम में, निरंतर जारी करने के लिए एक विधि की आवश्यकता है प्रोत्साहित करते हैं. दोनों cues के साथ एक और अधिक मजबूत प्रणाली बनाने के लिए, इन दो संकेतों जोड़ा जाना चाहिए. कई तरीकों पहले से तंत्रिका उत्थान के लिए electrospun रेशेदार पाड़ के भीतर प्रोटीन की विस्तारित रिलीज प्रदान करने के लिए अध्ययन किया गया है लेकिन आज तक कोई भी 60 से अधिक दिनों के लिए निरंतर जारी करने में सक्षम किया गया है. साथ ही, वृद्धि कारक रिहाई के patterning संभव नहीं रहा है. इस के साथ साथ हम दोनों का संकेत प्रदान करने के लिए PLGA Microsphere वितरण के साथ electrospinning गठबंधन करने के लिए एक प्रणाली का वर्णन.
पारंपरिक तरीकों ऐसी डे बोअर एट अल द्वारा उल्लिखित प्रोटोकॉल के रूप में, PLGA microspheres बनाना. </ Em>, Electrospinning प्रक्रिया का सामना नहीं कर सकता कि (300 ± 100 माइक्रोन) बहुत बड़ा microspheres 33 का उत्पादन किया. Scaffolds में उन्हें शामिल करने के लिए कई प्रयास असफल रहे थे. यह बेहतर पहला पायस फैलाने और छोटे क्षेत्रों को बनाने के लिए, भंवर मिक्सर के स्थान पर एक sonicator, का उपयोग करने के लिए नेतृत्व किया. Microspheres काफी छोटे थे, वे आसानी से समाधान के बाकी के साथ सुई और electrospun के माध्यम से पारित कर दिया. इस प्रोटोकॉल में प्राथमिक electrospinning समाधान NGF को नुकसान को रोकने और कोशिकाओं की वृद्धि 28 के लिए एक मेहमाननवाज सब्सट्रेट प्रदान करने के लिए, बल्कि एक कठोर विलायक से, पानी में भंग कर रहा है.
कई तरीकों तंत्रिका चोट साइटों को स्थलाकृतिक और रासायनिक संकेतों प्रदान करने के लिए परीक्षण किया गया है. चोटों के NGF प्रदान करने के शुरुआती प्रयासों में से कुछ एक ठोस सिलिकॉन तंत्रिका नाली (नेकां) 36 के केंद्र में नि: शुल्क NGF या NGF युक्त microspheres की समाधान डाल शामिल किया गया. ये हैupported तंत्रिका विकास; हालांकि वे अतिरिक्त संकेतों को जोड़ने या पैटर्न की क्षमता नेकां में वृद्धि कारकों के स्थान की अनुमति नहीं थी. एक और अधिक हाल के उदाहरण यान एट में. . अल इस्तेमाल किया पाली [(लैक्टिक एसिड) सह - [(एसिड) -alt- (एल Lysine)]] Gly-Arg-Gly-एएसपी Gly (RGD पेप्टाइड) कलम बांधने का काम द्वारा संशोधित (PLGL) और NGF बनाना PLGL-RGD-NGF तंत्रिका conduits 37. इसी तरह, इन तंत्रिका विकास को बढ़ावा दिया है कि रासायनिक संकेत प्रदान की है, लेकिन अन्य संकेतों प्रदान नहीं किया. NGF इस्तेमाल किया एक अन्य अध्ययन से ऊपर है और उन्हें 38 से नीचे electrospun scaffolds के साथ microspheres में समझाया. इस प्रणाली के एक रासायनिक संकेत के रूप में NGF के साथ संयोजन में एक रेशेदार पाड़ की स्थलाकृतिक संकेतों दोनों प्रदान करता है. हालांकि, जारी ही परिधीय तंत्रिका मरम्मत का समर्थन करने के लिए पर्याप्त समय नहीं है, जो एक हफ्ते तक चली, और microspheres के स्थान अच्छी तरह से नियंत्रित नहीं है.
अन्य शोधकर्ताओं तंतुओं में रासायनिक संकेतों को शामिल करने पर जोर दिया है. एक मुलाकातविभागाध्यक्ष बनाता है और एक हाइड्रोफोबिक बहुलक साथ हाइड्रोफिलिक प्रोटीन की पायस. इस विधि प्रोटीन की हालांकि 60% पहले 12 दिनों में 39 में जारी किया गया था, स्थलाकृतिक और रासायनिक संकेतों प्रदान करने में सक्षम था. समाक्षीय electrospinning इस्तेमाल किया एक और उदाहरण पाली (लैक्टिक एसिड caprolactone) (पी (LLA सीएल)) फाइबर 40,41 भीतर NGF encapsulate करने के लिए. यह विधि एक चूहे sciatic तंत्रिका मॉडल में हस्ताक्षर करने के लिए इसी तरह के परिणाम प्रदान की है. हालांकि, विशेष उपकरण समाक्षीय electrospinning के लिए की जरूरत है और यह निरंतर हो सकता है अगर यह प्रोटीन जारी किया गया था दर क्या पर स्पष्ट नहीं है, और. यहाँ वर्णित के रूप में 2 महीने के लिए जारी है कि microspheres के माध्यम से गठबंधन electrospun फाइबर और रासायनिक संकेतों के रूप में स्थलाकृतिक संकेतों के संयोजन, कई synergistic संकेतों प्रदान करता है और एक अनुकूलित वातावरण प्रदान करने के लिए अत्यधिक ट्यून करने योग्य है.
Electrospinning जब विचार करने की आवश्यकता है कि कई मुद्दे हैं; पर्यावरणीय कारकों electros प्रभावित कर सकते हैंकिसी भी समाधान के लगाए. नमी में एक अप्रत्याशित परिवर्तन, उदाहरण के लिए, electrospinning परिणामों पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव है और असंगत फाइबर पैदा कर सकता है. पर्यावरण की दृष्टि से नियंत्रित किया जा सकता है कि एक अलग कमरे होने बहुत उपयोगी है. 50% नमी के साथ 70 डिग्री एफ के एक तापमान इन प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया था. एक electrospinning प्रणाली के साथ एक अन्य संभावित समस्या शॉर्ट सर्किट है; वे अक्सर पंप पर सिरिंज और धातु के टुकड़े के बीच स्पष्ट स्पार्क्स बना. यह जगह प्लास्टिक या उन दोनों के बीच एक और इन्सुलेटर रोकने के लिए; खाद्य भंडारण बैग वजन प्लास्टिक अच्छी तरह से काम करता है. इसी प्रकार, वातावरण में आवारा विद्युत शुल्क सामग्री अप्रत्याशित स्थानों में जमा करने के लिए पैदा कर सकता है. इससे बचने के लिए आप एक्रिलिक शीट या अन्य इन्सुलेट सामग्री के साथ एक बाड़े बना सकते हैं. Electrospinning शर्तों को एडजस्ट करने पर अधिक जानकारी देहली 24 द्वारा समीक्षा में पाया जा सकता है.
इस प्रक्रिया के लिए अगले कदम अन्य gro encapsulating शामिल होंगेकारकों wth कई वृद्धि कारकों से युक्त अधिक गतिशील scaffolds बनाने के लिए. उदाहरण के लिए, NGF संवेदी और मोटर न्यूरॉन्स 3 का समर्थन करने के glial सेल व्युत्पन्न वृद्धि कारक synergistically के साथ काम करने के लिए दिखाया गया है. PLGA microspheres का उपयोग करना, हम एल बदलकर रिहाई की दर को नियंत्रित कर सकते हैं: हमें अलग दर पर विभिन्न विकास कारकों वितरित करने की अनुमति होगी जो जी अनुपात,. Microspheres की एक ढाल भी सेल व्यवहार का निर्देशन है कि एक अधिक जटिल समर्थन प्रणाली का निर्माण करने के लिए उत्पन्न किया जा सकता है. साथ ही, आसंजन कारकों एक माइकल के अलावा प्रतिक्रिया 26 के माध्यम से पाड़ सामग्री को सीधे संयुग्मित किया जाएगा. अंत में, प्रणाली एक vivo में चूहे sciatic तंत्रिका मॉडल के साथ परीक्षण किया जाएगा.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Irgacure 2959 | BASF | 24650-42-8 | Protect from light |
| PEO 900 kDa | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Syringe Pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Power Source | Gamma High Voltage | ES30P-5W | |
| Motor | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | EXFO | S1000 | |
| Needles | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Polyvinyl Alcohol | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Isoporopyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-500mL | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
| BSA-FITC | Sigma-Aldrich | 080M7400 | |
| β-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 1156-NG | |
| 65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | 1001554270 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-2L | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Thermo Scientific | 1856209 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 1001558456 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| Glutamine | Fisher Scientific | G7513 | |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 |
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