Introduction
Eine der aktuellen Herausforderungen in neuronalen Gewebe-Engineering ist die Schaffung einer Nervenleitung (NC), die die extrazelluläre Matrix, wobei Nerven wachsen natürlich imitiert. Die Forschung hat gezeigt, dass Zellen reagieren auf verschiedene Faktoren in ihrer Umgebung einschließlich der mechanischen, topographisch, Klebstoff und chemische Signale 1-3. Eine der primären Herausforderungen in diesem Bereich ist die Bestimmung der geeigneten Kombination von Signalen und Herstellung ein System, das Hinweise für einen längeren Zeitraum aufrecht erhalten kann, das Zellwachstum 4 unterstützt. Peripheren Neuronen bekannt sind, um eine weiche Substrat bevorzugen, von ausgerichteten Fasern ausgerichtet werden, und auf den Nervenwachstumsfaktor (NGF) 5-7. NCs, die chemische Signale für Wochen liefern können, sind gezeigt worden, um eine verbesserte funktionelle Erholung näher an der Allografts, der aktuelle Gold-Standard für die Nervenreparatur 8,9 bieten.
Zu produzieren mechanische und topographische können verschiedene Materialien und Produktionsmethoden verwendet werdenal Queues 10-13. Mechanische Signale sind inhärent für das gewählte Material, so dass die Auswahl des geeigneten Materials für die Anwendung kritischen 1,13. Produktionsmethoden zu kontrollieren topographische Hinweise sind Phasentrennung, die Selbstorganisation und das Elektro 1,13. Für Mikroanwendungen, Mikrofluidik, Photostrukturierung, Ätzen, Salz Laugen oder Gas Schäume können auch verwendet werden, 14-17. Elektro hat als beliebteste Weg, um Fasersubstraten für die Gewebekultur-Ingenieur durch seine Flexibilität und Leichtigkeit der Produktion 13,18-23 entstanden. Elektrogesponnene Nano werden durch Anlegen einer Hochspannung zu einer Polymerlösung so dass es zu sich selbst abzuwehren und erstrecken sich über eine kurze Lücke zu entladen 24 hergestellt. Eine ausgerichtete Stützgerüst kann durch Sammeln der Fasern auf einer geerdeten rotierenden Dorn erzeugt werden und blockfreien Gerüsten sind auf einer stationären Platte 25 gesammelt. Haftung Signalisierung kann durch Beschichtung der Fasergerüst wit erreicht werdenh Fibronectin oder Konjugation eines Haft Peptid, wie RGD, zu dem HA, bevor das Elektro 26.
Chemische Signale, wie Wachstumsfaktoren, die am schwierigsten über längere Zeiträume aufrecht zu erhalten, weil sie benötigen eine Quelle für die gesteuerte Freisetzung. Viele Systeme wurden versucht, um eine kontrollierte Freisetzung zu elektro faserigen Netzen mit unterschiedlichem Erfolg hinzuzufügen. Diese Methoden umfassen Mischung Elektro, Emulsion Elektro, Kern-Schale-Elektro und Protein-Konjugation 27. Zusätzlich wird Elektro traditionell in einem flüchtigen Lösungsmittel, das die Lebensfähigkeit des Proteins 28 beeintrachtigt wird daher beibehalten Bioaktivität des Proteins berücksichtigt werden.
Dieser Ansatz befasst sich speziell die Kombination von mechanischen, topographische, chemische und Klebesignale, um eine abstimmbare Gerüst für periphere Nerven Wachstum zu schaffen. Gerüstmechanik genau gesteuert durch Synthetisierenmethacrylierten Hyaluronsäure (HA). Die Methacrylierung Websites verwendet werden, um reaktive Vernetzer Foto anhängen. Das vernetzte Material ist nicht mehr wasserlöslich und wird ausschließlich durch Enzyme 29 gebrochen. Die Menge des Vernetzungs ändert die Abbaurate, Mechanik und anderen physikalischen Eigenschaften des Materials. Verwendung von HA mit 30% Methacrylierung, das einen Zugmodul von ca. 500 Pa hat, erzeugt ein weiches Substrat, das in der Nähe der Mutter Mechanik des Nervengewebe ist, und wird typischerweise durch Neuronen 26,29 bevorzugt. Elektrospinning auf eine rotierende Spindel wird verwendet, um ausgerichteten Fasern für eine topographische Cue erstellen. Mit Elektro zusammen mit Mikrosphären bietet chemische Signale innerhalb des Gerüsts über längere Zeiträume. Um Neuritenwachstum Mikrokügelchen, die NGF verwendet werden, um das chemische Signal erzeugen unterstützen. Anders als die meisten elektro Materialien HA ist in Wasser löslich, so dass die NGF nicht aggressiven Lösungsmitteln bei der Produktion auftreten. Um eine Haft Signal hinzuzufügen, das SCAffold mit Fibronectin beschichtet ist. Das fertige System enthält alle vier oben beschriebenen Arten von Signalen: soft (mechanisch) ausgerichtet (topographische) Fasern mit NGF freiMikroSphären (chemischen) mit Fibronektin (Klebstoff) beschichtet. Herstellung und Prüfung des Systems wird in diesem Protokoll beschrieben.
Das Verfahren beginnt mit der Herstellung der Mikrokugeln mit einer Wasser-in-Öl-in-Wasser-Doppelemulsion. Die Emulsion wird mit einem Tensid, Polyvinylalkohol (PVA) stabilisiert. Die innere Wasserphase enthält das Protein. Wie es zu der Ölphase zugegeben wird, die das in Dichlormethan (DCM) gelöst PLGA Schalenmaterial, erzeugt das Tensid eine Barriere zwischen den Phasen Schutz des Proteins aus der DCM. Diese Emulsion wird als in einem anderen Wasserphase PVA enthält, um die äußere Oberfläche der Mikrokügelchen zu schaffen dispergiert. Die stabile Emulsion wird gerührt, um das DCM verdampft. Nach dem Spülen und Gefriertrocknen Sie mit dem trockenen Mikro Fortsetzung gelassen werdenaining des Proteins.
Nachdem die Mikrosphären abgeschlossen werden, sind sie bereit, in Gerüste versponnen werden. Zuerst wird die Elektro Lösung herzustellen. Die Viskosität der Lösung ist wichtig, um die richtige Faserbildung. Lösungen von reinem HA diese Anforderung nicht zu erfüllen; PEO wird als Trägerpolymer zur Elektro ermöglichen zugegeben. Die Mikrokugeln werden in die Lösung und elektro was eine faserige Gerüst mit Mikrokugeln gleichmäßig verteilt zugegeben.
Sobald die Produktion abgeschlossen ist, sollte das Protein getestet werden, um ihre Lebensfähigkeit zu überprüfen. Um dies zu tun, kann eine Primärzelle, die NGF reagiert werden. Dieses Protokoll verwendet Hinterwurzelganglien (DRG) 8-10 Tage alten Hühnerembryonen. Die Zellbündel werden auf das Gerüst Mikrosphären mit NGF oder diejenigen, die leer sind gefüllt ausgesät. Wenn die NGF noch lebensfähig ist, sollten Sie verbesserte Neuritenwachstum auf den NGF enthält Gerüste sehen. Wenn die NGF ist nicht mehr lebensfähig, es wirdNeuriten zu verlängern nicht fördern und sollte ähnlich der Steuerung angezeigt.
Das hierin beschriebene Verfahren wird genau auf neuronale Stütz konzentriert, jedoch mit einfachen Modifikationen der Material, Elektrospinnverfahren und Proteinen kann das System für unterschiedliche Zell-und Gewebetypen optimiert werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Wasser / Öl / Wasser-Doppelemulsion Microsphere Produktion
- Erste Herstellung von 2% bzw. 0,5% w / v Lösung von Polyvinylalkohol (PVA) in entionisiertem Wasser. Rühren Sie die Lösungen bei 50 ° C, bis klar ist, kann dies mehrere Stunden dauern. Eine Lösung aus 2% v / v Isopropylalkohol in entionisiertem Wasser.
- Bereiten einer wäßrigen Lösung eines hydrophilen Proteins erwünscht. Die folgende Tabelle enthält Beispielformulierungen.
Tabelle 1:. Beispiel Proteinlösungen Die folgenden Proteinlösungen wurden erfolgreich gekapselt und elektro mit diesem Protokoll. Andere hydrophile Proteinlösungen können nach Bedarf verwendet werden.
- Die 40 ml der 0,5% igen PVA-Lösung in ein 50 ml-Zentrifugenröhrchen und beiseite stellen.
- In ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen lösen 300 mg 65:35Poly (milchsäure-co-Glykolsäure) (PLGA) in 3 ml Dichlormethan. Einem Vortex-Mischer können verwendet werden, um PLGA Auflösung zu beschleunigen.
- Kombinieren Sie 200 ul der Proteinlösung und 4 ul 2% PVA-Lösung. Gießen Sie die Mischung in die Protein-PLGA-Lösung (Schritt 1.4). Die Lösungen werden meist getrennt bleiben.
- Das Röhrchen wird in ein Becherglas mit Eiswasser. Mit Hilfe eines Ultraschallgeräts Zauberstab bei ~ 10 Watt (RMS), rühren Sie die Lösung für ein paar Sekunden (5-10), bis eine gleichmäßige Emulsion creme-weiß erstellt wird.
- Gießen Sie die Emulsion in der 50-ml-Tube, die 0,5% PVA (Schritt 1.3). Mische die Lösung mit hoher Geschwindigkeit auf einem Vortex-Mischer für ungefähr 20 Sekunden. Die Lösung wird ein trübes Aussehen zu entwickeln.
- Die Emulsion wird in einem 200 ml-Becherglas und auf einer Rührplatte bei 350 rpm für 2 min. 50 ml 2% Isopropylalkohol in das Becherglas auf der Rührplatte. Lassen Sie die Mischung weiterhin Rühren mindestens 1 Stunde auf dem DCM erlauben, zu verdampfen und das PLGA zu härten.
- Transfer ter MICROSPHERE Lösung in Zentrifugenröhrchen.
- Zentrifuge bei 425 xg für 3 min. Die Mikrosphären werden am unteren Rand des Röhrchens zu sammeln und weiß erscheinen. Den Überstand vorsichtig aus dem Rohr, über den Mikrokügelchen, und speichern Sie in einem 500-ml-Flasche.
- Spülen Sie die Mikrosphären mit VE-Wasser durch das Rohr füllt drei Viertel voll und schüttelte es, die Mikrokügelchen in der Flüssigkeit zu verteilen.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.10 & 1.11 viermal.
- Nach dem letzten Spülgang, den Überstand wieder und in der 500 ml-Flasche mit den anderen Proben. Einfrieren der in dem Zentrifugenröhrchen gesammelt Mikrokugeln, dann für mindestens 24 Stunden lyophilisiert.
- Visualisieren Sie die Mikrokugeln unter einem Lichtmikroskop oder mit einem Rasterelektronenmikroskop. Mikrosphären, die nicht größer als 60 um sind für eine effektive Elektro. Wenn Mikrokügelchen zu groß sind, können länger Beschallen oder Vortexen mal im Schritt 1.6 oder 1.7 benötigt. <li> Bewahren Sie die getrockneten Mikrokügelchen in einem -20 ° C Gefrierschrank.
- Optional: Verwenden Sie ein Protein-Test, nach den Herstelleranweisungen, um die Menge an Protein in der 500-ml-Flasche von 1,10 Schritt 30 zu testen. Dies wird verwendet, um den Prozentsatz an Protein in den Mikrokügelchen eingekapselt ist, die durch Subtrahieren der Menge der Lösung ab, was in der Produktion verwendet zu berechnen.
Hinweis: Um das Protein sichtbar zu Lage in der Mikro hinzuzufügen Rhodamin 2 ug / ml zu dem PLGA-Lösung 31 und kapseln einen FITC-konjugierten Proteins Figur 1 zeigt ein Beispiel..
2. Das Elektro mit Mikrosphären
- Vor der Herstellung von Elektro Lösung, schaffen eine 0,5% w / v-Lösung des Photoinitiators in entionisiertem Wasser durch Lösen von 37 ° C. Dieser Prozess kann mehrere Stunden dauern.
- Erstellen Sie eine 2% w / v methacrylierte Hyaluronsäure (Meha) (siehe Burdick et al. Zur Synthese) 29, 3%w / v 900 kD Poly (ethylenoxid) (PEO) und 0,05% w / v Fotoinitiatorlösung in entionisiertem Wasser.
- Berechnen Sie die korrekte Menge von Meha und PEO für die gewünschte Lautstärke. B. 10 ml Lösung benötigt das Elektro 200 mg MEHA und 300 mg PEO.
- Auflösen des PEO in entionisiertem Wasser bei 90% des gewünschten Endvolumens (9 ml für dieses Beispiel). Dies kann mehrere Stunden dauern, können eine beheizte Platte rühren oder Wasserbad bei 37 ° C verwendet werden, um den Prozess zu beschleunigen.
- Nächstes fügen Sie den Meha und verwenden Sie einen Wirbelmischer auf der Lösung, bis klar rühren. Das dauert nur ein paar Minuten dauern.
- Schließlich fügen Sie die 0,5% Photoinitiator Lösung, um die restlichen 10% Volumen (1 ml für dieses Beispiel) zu füllen.
- Fügen Mikrokugeln bei der gewünschten Konzentration bis zu 400 mg / ml. Mischen Sie die Lösung auf einem Vortex-Mischer, bis die Mikrokugeln gleichmäßig in der Lösung verteilt.
- Die Lösung wird in einer Spritze und fügen Sie eine 6-Zoll-18-Gauge-blunt Spitze Nadel.
- Legen Sie die Spritze in einer Spritzenpumpe und legen Sie es auf 1,2 ml / h zu verzichten.
- Kleben Sie eine Schicht Aluminiumfolie auf der Sammelplatte oder Dorn. Dies ermöglicht eine einfache Reinigung und Lagerung des fertigen Gerüst. Einen rotierenden Dorn verwendet wird, um ausgerichteten Fasern zu schaffen. Eine flache Platte oder stationären Dorn resultieren in zufällig angeordneten Fasern.
- Schließen Sie das Erdungskabel von einer Hochspannungsquelle an die Auffangvorrichtung. Schließen Sie das Pluskabel an der Nadel.
- Stellen Sie die Spritzenpumpe und Auffangfläche, so dass es 15 cm zwischen der Nadelspitze und Sammelfläche.
- Starten Sie das Polymer Pumpen, wenn die Lösung am Ende der Spritze sichtbar ist, schalten Sie die Spannungsquelle und stellen Sie die Spannung auf 24 kV. VORSICHT: Sobald die Spannung eingeschaltet ist keine Metallteil des Systems berühren. Ladung kann auch springen kurzen Entfernungen von elektrifizierten Teile die Haut.
- Führen Sie die Lösung bis desired Gerüstdicke erreicht ist. Wenn komplett auszuschalten Spannungsquelle und Spritzenpumpe.
- Folie entfernen mit Gerüst befestigt. Abgeschlossen Gerüste Protein enthalten, werden in einem -20 ° C-Gefrierschrank gelagert.
3. Protein Bioaktivität Testing
- Vorbereitung der Zellkultur-Medien. Werden 10% v / v fötales Rinderserum, 1% v / v L-Glutamin und 1% v / v Penicillin-Streptomycin, um Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium.
- Wählen Deckgläser, die vollständig in eine Well-Platte passen.
- Verwenden 3 (Trimethoxysilyl) propyl-methacrylat, die Deckgläser zu behandeln, wie vom Hersteller beschrieben. Methacrylierung verbessert Gerüst Einhaltung der Deckgläser.
- Bringen methacrylierte Deckgläser an den Sammelbereich der Electro mit abnehmbarem doppelseitiges Klebeband, bevor das Elektro. Spinnen auf die Deckgläser erleichtert Handhabung und Betrachtung.
- Elektrospinnen, um die gewünschte Dicke, wie oben beschrieben.
- EinN ach Elektro vorsichtig Deckgläser von Dorn. Legen Sie das Gerüst beschichtete Deckgläser in eine klare Stickstoffkammer und sicherzustellen, dass alle Sauerstoff gespült.
- Legen Sie die Kammer und Gerüst unter 10 mW / cm 2 365-nm-Licht für 15 min. Nach der Vernetzung Ort in geeigneter Größe Well-Platte. Stellen Sie sicher, dass das Gerüst nach oben zeigt.
- Ort Gerüste unter einer keimtötenden Lampe 30 min sterilisiert. Falls gewünscht Fibronektin oder anderen Protein als eine Beschichtung verwendet, um die Zellhaftung zu verbessern. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers zu beschichten Gerüste.
- Ernte Hinterwurzelganglien (DRG), wie zuvor von Hollenbeck 32 beschrieben. Einer DRG für jeden Gerüst bedeckt Deck getestet benötigt.
- Zeigen 100-200 ul Medium auf jedem Gerüst in der Well-Platte. Vorsichtig eine DRG auf jedem Gerüst in den Medien Tropfen. Für dicke Gerüst mehr Medien erforderlich sein; DRG müssen vollständig eingetaucht werden und nicht FLOAting.
- Inkubieren des Gerüstes und DRG bei 37 ° C für 4 Stunden, damit die Zelle auf dem Gerüst haften.
- Füllen Sie die Medien auf der geeigneten Ebene für das Wohl und legen Sie wieder in den Inkubator. Weiter Inkubation für 4-6 Tage.
- Nach der Inkubationszeit vorsichtig die Medien von jedem gut und sanft einmal zu waschen mit PBS. Fix Zellen 30 min mit 4% w / v Paraformaldehyd.
- Fleck-Zellen mit einem Antikörper-Färbung für Neurofilament. Dies ermöglicht die Visualisierung von Neuritenwachstum für die Quantifizierung. DAPI kann auch verwendet werden, um Zellkerne zu schauen. Ein Beispiel Färbungsprotokoll wurde von Sundararaghavan und Kollegen 14 beschrieben.
- Visualisierung der Zellen unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops.
- Zeigen Well-Platte auf der Bühne des Mikroskops.
- Suchen Sie den Zellmasse mit Hilfe der Filter und Anregung Einstellungen für DAPI.
- Sobald die Zelle wechseln Sie den Filter auf FITC, um die erweiterten Neuriten zu visualisieren. Usingen die Stichfunktion am Mikroskop zu sammeln und kombinieren so viele Bilder wie nötig, um die gesamte Struktur zu sehen. Wiederholen Sie für DAPI, FITC und Hellfeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikrokugeln 50 ± 14 um im Durchmesser mit einer über 85% Protein Kapselung wurden konsequent produziert und elektro in Gerüsten. Größe wurde durch bildgebende Proben von Mikrosphären aus drei verschiedenen Produktionschargen bestimmt. Die Bilder, in denen auf einem optischen Mikroskop und Längen, wo gemessen mit handelsüblichen Labor-Software erfasst. Figur 1 zeigt ein Histogramm der Größenverteilung. Verkapselung Rate wurde ebenfalls aus drei separaten Mikrosphärenansätzen getestet, durch die Quantifizierung der Protein, die während des Produktionsprozesses entkommen.
Figur 2 zeigt repräsentative Mikrokügelchen mit Rhodamin (2 ug / ml) in der PLGA-Shell und Rinderserumalbumin (BSA) -FITC eingekapselt. Die Bilder wurden unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskops aufgenommen. Die Schale kann deutlich (rot) mit dem Protein an der Innenseite (grün) konzentriert angesehen werden.
Kapselung zu bewerten, die Mikrokügelchens wurden mit BSA aufgefüllt und für Protein-Release mit einem Bradford-Protein-Assay getestet. PLGA bricht durch Hydrolyse von Esterbindungen, wodurch größere Lücken für die Protein Flucht. Die Mikrokügelchen weiterhin die Freigabe für über 60 Tage (3). Die Freisetzung beginnt mit einem ersten Ausbruch dann wie Mikrosphären brechen.
Nachdem das Elektro die Mikrokugeln können in der gesamten 3D-Faserstruktur gesehen werden. 4 zeigt ein SEM-Bild des gesamten Gerüstes, wo die Kugeln in mehreren Schichten gesehen werden (durch Pfeile angedeutet). Verteilung der Mikrokugeln in den Gerüsten wurde gemessen, um 15,3 ± 3,6 Kugeln / mm 2 betragen. Das Gerüst hält die Mikrosphären an Ort und Stelle verhindert die Migration weg von der Zielstelle. Wie die Mikrosphären brechen sie in das Gerüst frei NGF an Neuritwachstum 33,34 fördern. Dies erzeugt eine kontinuierliche Lieferung von Protein in der gesamten Gerüst, um das Wachstum zu unterstützen Zellen und fördern Zellen in das Gerüst zu infiltrieren.
Schließlich Spinalganglien (DRG) verwendet wurden, um die Lebensfähigkeit von NGF in den Mikrokugeln zu testen, in dem Gerüst. 5 zeigt eine DRG ausgesät auf einem Gerüst enthaltende Mikrokugeln mit NGF geladen nebenMikroSphären ohne Protein in ihnen. Es gibt mehr Neuriten Erweiterungen sichtbar, die sich von der DRG auf der NGF-Gerüst, das anzeigt, dass die NGF blieb lebensfähig und wird das Wachstum stimulieren.
Abbildung 1. Microsphere Größenverteilung. Mikrosphären durch dieses Protokoll hergestellt werden, sind 50 ± 14 um im Durchmesser. Das Diagramm zeigt ein Histogramm der Durchmesser der Mikrosphäre in 5 um Behälter.
2highres.jpg "/>
Abbildung 2. Fluoreszenzbildmikrosphären. 2 ug / ml Rhodamin wurde in der PLGA-Lösung, um die Mikrokugelhülle (rot) und BSA-FITC wurde eingekapselt, um das Protein (grün) zu visualisieren visualisieren enthalten. Protein kann eindeutig in den Bereich gesehen werden. Maßstab = 20 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Protein Release-Kurve. BSA-Freisetzung aus den Mikrosphären in 60 Tagen wurde mit einem Bradford-Protein-Assay gemessen. Der Anfangs-Burst ist wahrscheinlich auf BSA, die an der äußeren Oberfläche befestigt wurde. Wie der PLGA bricht, wird das Protein mit der Zeit freigesetzt.
/ftp_upload/51517/51517fig4highres.jpg "/>
Abbildung 4. Gerüst Mikrosphären. Das Verfahren des Elektro ermöglicht Mikrosphären in der gesamten Tiefe des Gerüstes eingearbeitet werden. (A) Pfeile, die den Ort von Mikrokügelchen. Maßstab = 500 um. (B) Hohe Vergrößerung Bild von einem Mikrokügelchen mit den Nanofasern vom Gerüst über ihm. Maßstab = 20 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. NGF Bioaktivität-Test. Spinalganglien primären Zellen wurden 8 Tage alten Küken Eier geerntet und auf Gerüsten mit NGF gefüllt Mikrosphären (A) oder leer Mikrosphären (B) ausgesät. DRGswurden mit einem Neurofilament-Antikörper, FITC sekundären Antikörper und DAPI, um die Zellkerne sichtbar gefärbt. Bilder zeigen eine erhöhte Neuritenwachstum in Gegenwart von NGF beladenen Mikrosphären durch FITC Neuriten (grün) angezeigt. Dies zeigt, veröffentlicht NGF ist lebensfähig und kann das Wachstum zu fördern. Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen. Maßstab = 200 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Viele Studien haben gezeigt, dass Nervenzellen durch topographische Cues (Faserausrichtung) und chemische Signale (Wachstumsfaktoren) 1,2,10,11,35 gerichtet werden. Elektro ist ein einfaches Verfahren, um Fasern ausgerichtet erstellen. Wachstumsfaktoren fördern Nervenwachstums aber, um sie in die Nervenleitungen (NC) gehören, wird ein Verfahren zur verzögerten Freisetzung erforderlich. Um ein robustes System mit beiden Signale zu erzeugen, sollten diese beiden Signale kombiniert werden. Mehrere Verfahren wurden bereits untersucht worden, um mit verlängerter Freisetzung des Proteins innerhalb der elektroFaserGerüst für die Nervenregeneration bieten, aber keine waren bisher in der Lage, mit verzögerter Freisetzung über 60 Tage. Zusätzlich hat Strukturierung Wachstumsfaktor Freisetzung nicht möglich. Hier beschreiben wir ein System zur Elektro mit PLGA Mikrosphären Lieferung kombinieren, um beide Signale liefern.
Traditionelle Methoden zur PLGA-Mikrokügelchen herzustellen, wie das Protokoll von de Boer et al beschrieben. </ Em>, erzeugt viel größere Mikro 33 (300 ± 100 um), die nicht die Elektrospinnverfahren standhalten konnte. Mehrere Versuche, sie in die Gerüste einzubauen, waren nicht erfolgreich. Dies führte zu der Verwendung eines Ultraschallgeräts, anstelle des Wirbelmischers, um eine bessere Dispersion der ersten Emulsion und erzeugen kleinere Kugeln. Sobald die Mikrokügelchen klein genug sind, können sie leicht durch die Nadel und elektro zusammen mit dem Rest der Lösung geleitet. Der primäre Elektro Lösung in diesem Protokoll wird in Wasser gelöst, sondern als eine harte Lösungsmittel, um eine Beschädigung des NGF zu verhindern und eine gast Substrat für das Zellwachstum 28.
Viele Verfahren sind für die Bereitstellung von topographischen und chemischen Signalen zu Nervenverletzungsstellen getestet. Einige der frühen Versuche Bereitstellen NGF Verletzungen beteiligt indem Lösungen von freiem NGF oder Mikrosphären, die NGF in die Mitte eines festen Siliziums Nervenleitung (NC) 36. Diese snterstützte Nervenwachstums; aber sie haben keine weiteren Hinweise oder ermöglichen die Fähigkeit, Muster die Lage der Wachstumsfaktoren in der NC. In einer neueren Beispiel Yan et. . al Poly [(milchsäure)-CO - [(Glykolsäure) -alt- (L-Lysin)]] (PLGL) durch Pfropfen von Gly-Arg-Gly-Asp-Gly (RGD-Peptid) modifiziert und NGF herzustellen PLGL-RGD-NGF Nervenleitungen 37. Ebenso sind diese, sofern die chemischen Signals, das das Nervenwachstum fördern, aber nicht von anderen Cues. Eine weitere Studie verwendete NGF in Mikrokugeln mit elektro Gerüste über und unter ihnen 38 eingekapselt. Dieses System gibt sowohl dem topographischen Signale aus einem Fasergerüst in Kombination mit NGF als chemische Stichwort. Jedoch nur die Freisetzung dauerte eine Woche, die nicht lang genug ist, um periphere Nervenreparatur unterstützt, und die Lage der Mikrokügelchen wird nicht gut gesteuert.
Andere Forscher haben auf Einbeziehung der chemischen Signale in die Fasern ausgerichtet. Ein METNotenhalter schafft und Emulsion des hydrophilen Proteins mit einem hydrophoben Polymer. Dieses Verfahren konnte topographischen und chemischen Signale liefern, jedoch 60% des Proteins in der ersten 12 Tage 39 freigegeben. Ein weiteres Beispiel verwendet koaxialen Elektro NGF in Poly (milchsäure-caprolacton) (P (LLA-CL)) Fasern 40,41 einzukapseln. Diese Methode lieferte ähnliche Ergebnisse wie der Autogramm in einem Rattenmodell Ischiasnerv. Jedoch ist spezielle Ausrüstung für koaxiale Elektro brauchen und es ist unklar, in welchem Tempo das Protein freigelassen wurde, und, wenn dies fortgesetzt werden. Die Kombination von topographischen Signale in Form von ausgerichteten elektrogesponnenen Fasern und chemische Signale durch Mikrokügelchen, die für über 2 Monate freisetzen, wie hier beschrieben, stellt mehrere synergistische Signale und ist in hohem Maße einstellbar, um eine angepasste Umgebung.
Es gibt mehrere Punkte, die berücksichtigt werden, wenn das Elektro werden müssen; Umweltfaktoren können die Electro beeinflussenPinning jeder Lösung. Eine unerwartete Änderung in der Feuchtigkeit, zum Beispiel, kann eine erhebliche Auswirkung auf die Ergebnisse haben Elektro und inkonsistente Fasern. Mit einem separaten Raum, die umwelt gesteuert werden kann, ist sehr hilfreich. Eine Temperatur von 70 ° C mit 50% Feuchtigkeit, wurde für diese Experimente verwendet. Ein weiteres mögliches Problem mit einem Elektrosystem Kurzschluss; sie schaffen oft offensichtlich Funken zwischen der Spritze und Metallteile an der Pumpe. Um diese, statt Kunststoff oder einem anderen Isolator zwischen ihnen zu verhindern; Lebensmittel Aufbewahrungstasche Gewicht Kunststoff funktioniert gut. In ähnlicher Weise können elektrische Ladungen Streu in der Umwelt verursachen Material in unerwarteten Orten zu sammeln. Um dies zu vermeiden, können Sie ein Gehäuse mit Acrylplatten oder anderen isolierenden Material erstellen. Weitere Informationen zum Anpassen Elektrobedingungen können der Übersicht von Sill 24 gefunden werden.
Die nächsten Schritte für dieses Verfahren wird auch Kapselung anderen growth Faktoren zu mehr Dynamik Gerüste mit mehreren Wachstumsfaktoren zu schaffen. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass NGF synergistisch mit Gliazellen Derived Growth Factor arbeiten, sensorischen und motorischen Neuronen 3 unterstützt. Mit PLGA-Mikrokügelchen, können wir die Freisetzungsrate durch die Veränderung der L steuern: G-Verhältnis, das es uns erlaubt, verschiedene Wachstumsfaktoren bei verschiedenen Rate zu liefern. Ein Gradient der Mikrokügelchen können auch erzeugt werden, um eine komplexere Stützsystem, das Verhalten der Zelle lenkt aufzubauen. Zusätzlich Adhäsionsfaktoren wird direkt an den Gerüstmaterial durch eine Michael Addition 26 konjugiert werden. Schließlich wird das System mit einer in vivo-Ratten-Ischiasnerv-Modell getestet werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Irgacure 2959 | BASF | 24650-42-8 | Protect from light |
| PEO 900 kDa | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Syringe Pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Power Source | Gamma High Voltage | ES30P-5W | |
| Motor | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | EXFO | S1000 | |
| Needles | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Polyvinyl Alcohol | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Isoporopyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-500mL | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
| BSA-FITC | Sigma-Aldrich | 080M7400 | |
| β-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 1156-NG | |
| 65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | 1001554270 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-2L | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Thermo Scientific | 1856209 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 1001558456 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| Glutamine | Fisher Scientific | G7513 | |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 |
References
- Wrobel, M. R., Sundararaghavan, H. G. Directed migration in neural tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. , (2013).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5, 293-347 (2003).
- Madduri, S., di Summa, P., Papaloizos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
- Madduri, S., Gander, B. Growth factor delivery systems and repair strategies for damaged peripheral nerves. J Control Release. 161, 274-282 (2012).
- Madigan, N. N., McMahon, S., O'Brien, T., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J. Current tissue engineering and novel therapeutic approaches to axonal regeneration following spinal cord injury using polymer scaffolds. Respir Physiol Neurobiol. 169, 183-199 (2009).
- Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol. Bioeng. 102, 632-643 (2009).
- Hudson, T. W., Evans, G. R., Schmidt, C. E. Engineering strategies for peripheral nerve repair. Clin Plast Surg. 26, 617-628 (1999).
- Kokai, L. E., Bourbeau, D., Weber, D., McAtee, J., Marra, K. G. Sustained growth factor delivery promotes axonal regeneration in long gap peripheral nerve repair. Tissue Eng Part A. 17, 1263-1275 (2011).
- Bronzino, J. D., Peterson, D. R. The Biomedical Engineering Handbook, Third Edition - 3 Volume Set: Tissue Engineering and Artificial Organs. , 3 edition edn, CRC Press. (2006).
- Bell, J. H. A., Haycock, J. W. Next generation nerve guides: materials, fabrication, growth factors, and cell delivery. Tissue Eng Part B Rev. 18, 116-128 (2012).
- Ruiter, G. C. W., Malessy, M. J. A., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J., Spinner, R. J. Designing ideal conduits for peripheral nerve repair. Neurosurgical focus. 26, (2009).
- Olakowska, E., Woszczycka-Korczyńska, I., Jędrzejowska-Szypułka, H., Lewin-Kowalik, J. Application of nanotubes and nanofibres in nerve repair. A review. Folia Neuropathol. 48, 231-237 (2010).
- Gunn, J., Zhang, M. Polyblend nanofibers for biomedical applications: perspectives and challenges. Trends Biotechnol. 28, 189-197 (2010).
- Sundararaghavan, H. G., Masand, S. N., Shreiber, D. I. Microfluidic generation of haptotactic gradients through 3D collagen gels for enhanced neurite growth. Journal of Neurotrauma. 28, 2377-2387 (2011).
- Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. Electrospun fibrous scaffolds with multiscale and photopatterned porosity. Macromol Biosci. 10, 265-270 (2010).
- Edalat, F., Sheu, I., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Material strategies for creating artificial cell-instructive niches. Current Opinion in Biotechnology. 23, 820-825 (2012).
- Annabi, N., et al. Synthesis of highly porous crosslinked elastin hydrogels and their interaction with fibroblasts in vitro. Biomaterials. 30, 4550-4557 (2009).
- Castaño, O., Eltohamy, M., Kim, H. -W.
- Chew, S. Y., Wen, J., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Sustained release of proteins from electrospun biodegradable fibers. Biomacromolecules. 6, 2017-2024 (2005).
- Han, D., Gouma, P. -I. Electrospun bioscaffolds that mimic the topology of extracellular matrix. Nanomedicine. 2, 37-41 (2006).
- Prabhakaran, M. P., et al. Electrospun biocomposite nanofibrous scaffolds for neural tissue engineering. Tissue Eng Part A. 14, 1787-1797 (2008).
- Xie, J., MacEwan, M. R., Schwartz, A. G., Xia, Y. Electrospun nanofibers for neural tissue engineering. Nanoscale. 2, 35-44 (2010).
- Yao, L., O'Brien, N., Windebank, A., Pandit, A. Orienting neurite growth in electrospun fibrous neural conduits. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 90, 483-491 (2009).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
- Ifkovits, J. L., Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
- Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Gradients with depth in electrospun fibrous scaffolds for directed cell behavior. Biomacromolecules. 12, 2344-2350 (2011).
- Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P., Meinel, L. Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications. Eur J Pharm Biopharm. 81, 1-13 (2012).
- Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
- Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks. Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).
- Péan, J. M., et al. Optimization of HSA and NGF encapsulation yields in PLGA microparticles. International Journal of Pharmaceutics. 166, 105-115 (1998).
- Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. The Uptake and Intracellular Fate of PLGA Nanoparticles in Epithelial Cells. Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).
- Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , Gulf Professional Publishing. (2003).
- Boer, R., et al. Rat sciatic nerve repair with a poly-lactic-co-glycolic acid scaffold and nerve growth factor releasing microspheres. Microsurgery. 31, 293-302 (2011).
- Pujic, Z., Goodhill, G. J. A dual compartment diffusion chamber for studying axonal chemotaxis in 3D collagen. Journal of Neuroscience Methods. 215, 53-59 (2013).
- Madduri, S., di Summa, P., Papaloïzos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
- Xu, X., et al. Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor. Biomaterials. 23, 3765-3772 (2002).
- Yan, Q., Yin, Y., Li, B. Use new PLGL-RGD-NGF nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration. Biomed Eng Online. 11, (2012).
- Gungor-Ozkerim, P. S., Balkan, T., Kose, G. T., Sarac, A. S., Kok, F. N. Incorporation of growth factor loaded microspheres into polymeric electrospun nanofibers for tissue engineering applications. J Biomed Mater Res A. , (2013).
- Li, X., et al. Encapsulation of proteins in poly(L-lactide-co-caprolactone) fibers by emulsion electrospinning. Colloids Surf B Biointerfaces. 75, 418-424 (2010).
- Wang, C. -Y., et al. The effect of aligned core-shell nanofibres delivering NGF on the promotion of sciatic nerve regeneration. J Biomater Sci Polym Ed. 23, 167-184 (2012).
- Liu, J. -J., Wang, C. -Y., Wang, J. -G., Ruan, H. -J., Fan, C. -Y. Peripheral nerve regeneration using composite poly(lactic acid-caprolactone)/nerve growth factor conduits prepared by coaxial electrospinning. J Biomed Mater Res A. 96, 13-20 (2011).
