Introduction
Een van de voortdurende uitdagingen in zenuwweefsel techniek is het creëren van een zenuwleiding (NC) die de extra cellulaire matrix, waar zenuwen groeien natuurlijk nabootst. Onderzoek heeft aangetoond dat de cellen reageren op verschillende factoren in hun omgeving met inbegrip van mechanische, topografische, lijm en chemische signalen 1-3. Een van de belangrijkste uitdagingen op dit gebied bepalen van de juiste combinatie van signalen en het vervaardigen van een systeem dat signalen kan handhaven voor een langere periode celgroei 4 ondersteunen. Perifere neuronen is bekend dat ze een zachte ondergrond de voorkeur geven, worden geregisseerd door uitgelijnde vezels, en reageren op zenuw groeifactor (NGF) 5-7. NC chemische signalen kan voorzien weken bleken verbeterde functioneel herstel dichter bij die van allografts, de huidige gouden standaard voor zenuwreparatie 8,9 verschaffen.
Diverse materialen en productiemethoden worden gebruikt mechanische en topografische producerenal keuen 10-13. Mechanische signalen zijn inherent aan het gekozen materiaal, waardoor selectie van de geschikte materiaal voor de toepassing kritische 1,13. Productiemethoden te controleren topografische aanwijzingen bevatten fasescheiding, zelf-assemblage en electospinning 1,13. Voor microschaal toepassingen, microfluidics, photopatterning, etsen, zout bloedzuigers, of gas schuim kan ook worden gebruikt 14-17. Elektrospinproces heeft ontpopt als de meest populaire manier om vezelig substraten voor weefselkweek ingenieur vanwege de flexibiliteit en het gemak van de productie 13,18-23. Elektrogesponnen nanovezels zijn gefabriceerd door het toepassen van een hoge spanning naar een polymeer oplossing waardoor het zich af te weren en zich over een korte afstand te ontladen 24. Een uitgelijnde steiger kan worden gecreëerd door het verzamelen van de vezels op een geaard roterende doorn en nonaligned steigers worden verzameld op een stationaire plaat 25. Adhesie signalering kan worden bereikt door het bekleden van de vezelige scaffold with fibronectine of conjugeren een adhesie peptide, zoals RGD, de HA vóór elektrospinning 26.
Chemische signalen zoals groeifactoren, dit zijn de moeilijk te handhaven gedurende langere perioden aangezien zij een bron voor gecontroleerde vrijgave nodig. Veel systemen zijn geprobeerd om gecontroleerde afgifte toe te voegen aan elektrogesponnen vezelig netwerken met wisselend succes. Deze methoden omvatten mix elektrospinnen, emulsie elektrospinnen, core-shell elektrospinproces en eiwitconjugatie 27. Bovendien wordt electrospinning traditioneel gedaan in een vluchtig oplosmiddel, waarbij de levensvatbaarheid van het eiwit 28 kan beïnvloeden, handhaaft derhalve bioactiviteit van het eiwit worden onderzocht.
Deze aanpak specifiek over de combinatie van mechanische, topografische, chemische en lijm signalen naar een afstembare steiger voor perifere zenuw groei te creëren. Steiger monteurs wordt nauwkeurig gecontroleerd door het synthetiserengemethacryleerde Hyaluronzuur (HA). De methacrylation sites worden gebruikt om foto reactieve verknopers hechten. Het verknoopte materiaal niet meer water oplosbare en uitsluitend afgebroken door enzymen 29. De hoeveelheid verknoping verandert de afbraaksnelheid, mechanica en andere fysische eigenschappen van het materiaal. Met HA met 30% methacrylation, die een trekmodulus van -500 Pa heeft, is zacht substraat dat vlakbij de natieve mechanica van neuraal weefsel en kenmerkend voorkeur van neuronen 26,29. Elektrospinnen op een roterende doorn wordt gebruikt om uitgelijnde vezels te creëren voor een topografische cue. Met behulp elektrospinproces samen met microsferen biedt chemische signalen binnen het schavot gedurende langere perioden. Om neuriet groei microsferen bevattende NGF worden gebruikt om de chemische afgeven ondersteunen. Unlike meeste electrospun materialen HA oplosbaar in water zodat het NGF geen agressieve oplosmiddelen tegenkomt tijdens de productie. Om een lijm signaal toe te voegen, de scaffold bekleed met fibronectine. Het ingevulde systeem bevat alle vier de soorten signalen zoals hierboven beschreven: zacht (mechanische) uitgelijnd (topografische) glasvezels met een NGF vrijgeven microsferen (chemische) gecoat met fibronectine (lijm). Productie en het testen van dit systeem wordt beschreven in dit protocol.
Het proces begint met de productie van de microsferen met een water-in-olie-in-water dubbele emulsie. De emulsie wordt gestabiliseerd met een surfactant, polyvinylalcohol (PVA). De binnenste waterfase bevat het eiwit. Als het wordt toegevoegd aan de oliefase, die de PLGA schaalmateriaal opgelost in dichloormethaan (DCM), de surfactant creëert een barrière tussen de fasen beschermen het eiwit uit de DCM. Deze emulsie wordt dan gedispergeerd in een waterfase bevattende PVA aan het buitenoppervlak van de microsferen te creëren. De stabiele emulsie wordt geroerd om het DCM verdampen. Na het spoelen en vriesdrogen van u blijven zitten met de droge microbolletjes containing het eiwit.
Nadat de microsferen zijn voltooid zijn ze klaar om te worden electrospun in steigers. Eerst moet je de elektrospinnen oplossing te bereiden. De viscositeit van de oplossing tiekritische vezelvorming. Oplossingen van pure HA niet voldoen aan deze eis; PEO wordt toegevoegd als drager polymeer om voor electrospinning. De microsferen worden toegevoegd aan de oplossing en electrospun resulteert in een vezelachtige steiger met microsferen overal verspreid.
Zodra de productie voltooid is, moet het eiwit worden getest om de levensvatbaarheid verifiëren. Om dit te doen, kan een primaire cel die reageert op NGF worden gebruikt. Dit protocol maakt gebruik van de ganglia (DRG) 8-10 dagen oude kippenembryo's. De cel bundels worden gezaaid op steigers microsferen gevuld met NGF of als ze leeg zijn. Als NGF nog steeds levensvatbaar zou u verbeterde neuriet groei bij de NGF bevattende scaffolds bekijken. Als NGF niet langer levensvatbaar zal hetniet neurites te breiden bevorderen en moeten vergelijkbaar zijn met de controle verschijnen.
De hierin beschreven exacte procedure is gericht op neurale steun echter met eenvoudige wijzigingen van het materiaal, electrospinning methode en eiwitten het systeem kan worden geoptimaliseerd voor verschillende types cellen en weefsels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Water / Olie / Water Dubbele Emulsion Microsfeer Productie
- Maak eerst 2% en 0,5% w / v oplossing van polyvinylalcohol (PVA) in gedeïoniseerd water. Roer de oplossing bij 50 ° C totdat een heldere, kan enkele uren duren. Bereid een oplossing van 2% v / v isopropylalcohol in gedeïoniseerd water.
- Bereid een waterige oplossing van hydrofiele gewenste eiwit. De onderstaande tabel geeft bijvoorbeeld formuleringen.
Tabel 1:. Voorbeeld Eiwit Oplossingen De volgende eiwit oplossingen zijn succesvol ingekapseld en elektrogesponnen gebruik van dit protocol. Andere hydrofiele eiwitoplossingen kunnen naar behoefte worden gebruikt.
- Plaats 40 ml van de 0,5% PVA oplossing in een centrifugebuis van 50 ml en zet apart.
- In een 15 ml centrifugebuis los 300 mg 65:35poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) in 3 ml dichloormethaan. Een vortex mixer kan worden gebruikt PLGA oplossen versnellen.
- Combineer 200 pi eiwitoplossing en 4 ui van 2% PVA oplossing. Giet het eiwitmengsel in de PLGA-oplossing (stap 1.4). De oplossingen zullen veelal gescheiden blijven.
- Plaats de buis in een bekerglas van ijswater. Met een wand sonicator bij ~ 10 watt (RMS), schud de oplossing gedurende enkele seconden (5-10) totdat een uniform romig witte emulsie ontstaat.
- Giet de emulsie in de 50 ml buis met 0,5% PVA (stap 1.3). Meng de oplossing bij hoge snelheid op een vortex mixer ~ 20 sec. De oplossing zal een troebele schijn ontwikkelen.
- Breng de emulsie in een bekerglas en plaats 200 ml op een roer plaat bij 350 rpm gedurende 2 minuten. Voeg 50 ml van 2% isopropylalcohol aan de beker van de roerplaat. Laat het mengsel verder geroerd minimaal 1 uur om de DCM te verdampen en de PLGA uitharden.
- Transfer tHij microbolletje oplossing in centrifugebuizen.
- Centrifugeer bij 425 xg gedurende 3 minuten. De microsferen verzamelt op de bodem van de buis en wit worden weergegeven. Verwijder de supernatant van de buis boven de microsferen en bewaar in een fles van 500 ml.
- Spoel de microsferen met gedeïoniseerd water door het vullen van de buis driekwart vol en schudden om de microsferen opnieuw te verdelen in de vloeistof.
- Herhaal de stappen 1.10 & 1.11 vier keer.
- Na de laatste spoeling, verwijder het supernatans opnieuw en plaats in de fles van 500 ml met de andere monsters. Bevries de in de centrifugebuis verzameld microbolletjes vervolgens lyofiliseren ten minste 24 uur.
- Zichtbaar de microsferen onder een lichtmicroscoop of een Scanning Electron Microscope. Microsferen niet groter dan 60 micrometer zijn voor een effectieve elektrospinproces. Als microbolletjes te groot zijn, kan het langer sonicatie of vortexen keer in stap 1.6 of 1.7 vereist. <li> Bewaar de gedroogde microbolletjes in een -20 ° C vriezer.
- Optioneel: Gebruik een eiwit assay, instructies van de fabrikant, om de hoeveelheid eiwit te testen in de fles 500 ml van stap 1.10 30. Dit wordt gebruikt om het percentage te berekenen eiwit ingekapseld in de microsferen, door het aftrekken van de hoeveelheid in de oplossing van wat werd gebruikt in het productieproces.
Opmerking: visualiseren eiwit locatie in het microbolletje commentaar Rhodamine 2 ug / ml aan de PLGA oplossing 31 en kapselen een FITC geconjugeerd eiwit Figuur 1 toont een voorbeeld..
2 Electrospinning met microsferen
- Alvorens met electrospinning oplossing maakt een 0,5% w / v oplossing van initiator, in gedeïoniseerd water door het oplossen bij 37 ° C. Dit proces kan enkele uren duren.
- Een 2% w / v gemethacryleerd hyaluronzuur (meha) (zie Burdick et al. Synthese) 29, 3%w / v 900 kD poly (ethyleenoxide) (PEO) en 0,05% w / v photo initiator opgelost in gedeïoniseerd water.
- Bereken de juiste hoeveelheid meha en PEO voor het gewenste volume. Bijvoorbeeld, 10 ml electrospinning oplossing vereist 200 mg meha en 300 mg PEO.
- Los het PEO in gedeïoniseerd water bij 90% van de uiteindelijke gewenste volume (9 ml voor dit voorbeeld). Dit kan enkele uren duren, kan een verhitte roerplaat of waterbad bij 37 ° C worden gebruikt om het proces te versnellen.
- Voeg vervolgens de meha en gebruik een vortex mixer aan de oplossing totdat duidelijk roeren. Dit duurt slechts een paar minuten.
- Voeg tenslotte de 0,5% fotoinitiator oplossing voor de resterende 10% volume (1 ml voor dit voorbeeld) te vullen.
- Voeg microsferen in de gewenste concentratie tot 400 mg / ml. Meng de oplossing op een vortex mixer totdat de microsferen gelijkmatig verdeeld in de oplossing.
- Breng de oplossing aan een injectiespuit en bevestig een 6 inch 18 gauge blunt tip naald.
- Plaats de spuit in een injectiepomp en zet deze af te zien van 1,2 ml / uur.
- Tape een laagje aluminiumfolie op de collectie plaat of doorn. Dit zorgt voor een gemakkelijke schone up en opslag van de afgewerkte steiger. Een roterende doorn wordt gebruikt om uitgelijnd vezels geven. Een vlakke plaat of stationaire doorn resulteert in willekeurig gerangschikt vezels.
- Sluit de aardedraad van een hoge spanning stroombron om de collectie apparaat. Sluit de positieve draad aan de naald.
- Stel de spuitpomp en verzameling oppervlak zodat er 15 cm tussen de naaldpunt en verzameloppervlak.
- Start de polymeer pompen, wanneer de oplossing zichtbaar aan het einde van de injectiespuit, zet de spanningsbron en zet de spanning 24 kV Let. Wanneer de spanning is ingeschakeld kan een metalen deel van het systeem aanraken. Heffing kan ook springen korte afstanden van geëlektrificeerde onderdelen voor de huid.
- Voer de oplossing tot desired steiger dikte is bereikt. Als het klaar is uit te schakelen spanningsbron en injectiepomp.
- Verwijder folie met steiger bevestigd. Afgesloten steigers eiwithoudende opgeslagen in een -20 ° C vriezer.
3 Protein Bioactiviteit Testing
- Bereid celcultuurmedia. Voeg 10% v / v foetaal runderserum, 1% v / v L-glutamine en 1% v / v penicilline-streptomycine aan Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium.
- Selecteer dekglaasjes die volledig passen in een put plaat.
- Gebruik 3 (Trimethoxysilyl) propyl methacrylaat de dekglaasjes behandelen als beschreven door de fabrikant. Methacrylation verbetert steiger vasthouden aan de dekglaasjes.
- Bevestig gemethacryleerde dekglaasjes om het verzamelgebied van de electrospinner met verwijderbare dubbelzijdige tape voordat electospinning. Spinning op de dekglaasjes vergemakkelijkt bediening en weergave.
- Electrospin gewenste dikte als boven beschreven.
- Eenfter Electrospinning zorgvuldig dekglaasjes verwijderen uit doorn. Plaats de steiger gecoate dekglaasjes in een heldere stikstof kamer en ervoor zorgen dat alle zuurstof wordt gespoeld.
- Plaats de kamer en steiger onder een 10 mW / cm 2 365 nm licht gedurende 15 minuten. Na verknoping plaats in geschikt formaat putjesplaat. Zorg ervoor dat de steiger kant naar boven is gericht.
- Plaats scaffolds onder een kiemdodende lamp gedurende 30 min te steriliseren. Desgewenst fibronectine of andere eiwit wordt gebruikt als een bekleding op celhechting te verbeteren. Volg de instructies van de fabrikant om de vacht van steigers.
- Oogst van de ganglia (DRG) zoals eerder beschreven door Hollenbeck 32. Een DRG zal nodig zijn voor elke steiger overdekte dekglaasje getest.
- Plaats 100-200 ul van media op elke steiger in de wells plaat. Plaats een DRG voorzichtig op elke steiger in de media druppel. Voor dikke steiger meer media nodig zijn; DRG moeten volledig worden ondergedompeld en niet Floating.
- Incubeer de steiger en DRG bij 37 ° C gedurende 4 uur om de cel te houden aan de steiger.
- Vul de media op het juiste niveau voor het goed en plaats terug in de incubator. Verder incuberen gedurende 4-6 dagen.
- Na de incubatieperiode zorgvuldig de media uit elke te verwijderen goed en voorzichtig een keer wassen met PBS. Fix cellen gedurende 30 min onder toepassing van 4% w / v paraformaldehyde.
- Stain cellen met een antilichaam kleuring voor neurofilament. Hierdoor kunnen visualiseren van neurietuitgroei voor kwantificering. DAPI kan ook worden gebruikt om kernen van de cellen zien. Een voorbeeld kleuring protocol beschreven door Sundararaghavan en collega 14.
- Zichtbaar de cellen met een fluorescentiemicroscoop.
- Plaats wells plaat op het podium van de microscoop.
- Zoek de cel massa met behulp van de filter en de excitatie-instellingen voor DAPI.
- Zodra de cel schakelt het filter FITC de uitgebreide neurieten visualiseren. Uzing de steek functie op de microscoop verzamelen en combineren veel afbeeldingen als nodig om de gehele structuur te bekijken. Herhaal dit voor DAPI, FITC en heldere veld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microsferen 50 ± 14 micrometer in diameter met een meer dan 85% eiwit inkapseling zijn consistent geproduceerd en elektrogesponnen in steigers. Grootte werd bepaald door beeldvorming monsters van microsferen uit drie afzonderlijke productie batches. De beelden waarin vastgelegd op een optische microscoop en lengten wanneer gemeten met commerciële software lab. Figuur 1 toont een histogram van de grootteverdeling. Encapsulation percentage werd ook getest drie verschillende microsfeer opbrengsten, door het kwantificeren van het eiwit dat ontsnapt tijdens het productieproces.
Figuur 2 toont representatieve microsferen met Rhodamine (2 ug / ml) in de PLGA schaal en runderserumalbumine (BSA) FITC ingekapseld binnen. De beelden werden genomen met behulp van een fluorescentiemicroscoop. De schaal is duidelijk zichtbaar (rode) met het eiwit gericht op de binnenkant (groen).
Om inkapseling evalueren de microsfeers werden gevuld met BSA en getest op eiwit release met een Bradford Protein Assay. PLGA breekt door hydrolyse van de ester obligaties, het creëren van grotere gaten voor eiwit ontsnappen. De microsferen blijven vrijgeven dan 60 dagen (figuur 3). De release begint met een eerste uitbarsting gaat dan verder als microsferen breken.
Na electrospinning de microsferen kan worden gezien tijdens de 3D vezelstructuur. Figuur 4 toont een SEM beeld van de volledige steiger waar de bolletjes kan worden gezien in meerdere lagen (aangeduid door pijlen). Verdeling van microsferen in de steigers werd gemeten als 15,3 ± 3,6 bollen / mm 2. De scaffold heeft de microsferen in plaats verhinderen migratie weg van de doelplaats. Als de microsferen splitsen ze vrij NGF in de scaffold neurieten groei 33,34 bevorderen. Hierdoor ontstaat een continue afgifte van eiwit gedurende de scaffold de groei van steunen cellen en stimuleren cellen te infiltreren in de scaffold.
Tenslotte ganglia (DRG) werden gebruikt om de levensvatbaarheid van NGF testen in de microsferen, binnen de scaffold. Figuur 5 toont een DRG gezaaid op een steiger microsferen geladen met NGF naast een microsferen zonder eiwit erin. Er zijn meer neurietenverlengingen toegankelijk uitstrekt van de DRG de NGF schavot, wat aangeeft dat de NGF in stand bleef en stimuleert de groei.
Figuur 1 Microsphere grootteverdeling. Microsferen die door dit protocol zijn 50 ± 14 micrometer in doorsnede. De grafiek toont een histogram van de microsfeerdiameter in 5 urn bakken.
2highres.jpg "/>
Figuur 2 Fluorescent Image van microsferen. 2 ug / ml Rhodamine opgenomen in de PLGA oplossing van de microsfeer shell (rood) en BSA-FITC werd ingekapseld eiwit (green) visualiseren visualiseren. Eiwit is duidelijk te zien in het gebied. Schaal bar = 20 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3 Protein Uitgifte Curve. BSA afgifte van de microsferen in 60 dagen werd gemeten met een Bradford Protein Assay. De eerste burst wordt waarschijnlijk veroorzaakt BSA die was bevestigd aan het buitenoppervlak. Zoals de PLGA afbreekt, wordt eiwit vrijgegeven na verloop van tijd.
/ftp_upload/51517/51517fig4highres.jpg "/>
Figuur 4 Scaffold bevattende microsferen. Dit elektrospinproces maakt microsferen over de hoogte van de steiger worden opgenomen. (A) Pijlen dat de ligging van microsferen. Schaal bar = 500 micrometer. (B) Hoge vergroting beeld van een microbolletjes met de nanovezels uit het schavot erboven. Schaal bar = 20 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5 NGF Bioactiviteit Test. Ganglia primaire cellen werden geoogst van 8 dagen oud kuiken eieren en gezaaid op steigers met NGF gevulde microbolletjes (A) of een lege microsferen (B). DRG'swerden gekleurd met een neurofilament antilichaam FITC secundaire antilichaam en DAPI om de celkernen zichtbaar. Afbeeldingen vertonen verhoogde neuriet uitgroei in aanwezigheid van NGF geladen microsferen zoals door FITC bevlekte neurieten (groen). Dit toont vrijgegeven NGF levensvatbaar is en kan de groei bevorderen. Beelden zijn gemaakt met een confocale microscoop. Schaal bar = 200 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vele studies hebben aangetoond dat de zenuwcellen kunnen worden geregisseerd door topografische cues (fiber alignment) en chemische signalen (groeifactoren) 1,2,10,11,35. Electrospinning is een gemakkelijke methode om uitgelijnde vezels geven. Groeifactoren stimuleren zenuwgroei maar om ze op te nemen in zenuw leidingen (NC), is een werkwijze voor aanhoudende afgifte vereist. Om een meer robuust systeem met beide signalen maken, moeten deze twee signalen worden gecombineerd. Verscheidene werkwijzen zijn eerder bestudeerd om langdurige afgifte van proteïne in de electrospun vezelachtige matrix voor zenuwregeneratie maar niemand tot nu meer dan 60 dagen met een duurzame afgifte zijn. Daarnaast heeft patroonvorming van groeifactor release onmogelijk geweest. Hierin beschrijven we een systeem electrospinning combineren met PLGA microsfeer levering aan beide signalen.
Traditionele methoden om PLGA microsferen fabriceren, zoals het protocol door de Boer et al geschetst. </ Em>, produceerde veel grotere microsferen 33 (300 ± 100 micrometer) die niet konden weerstaan de elektrospinproces. Verschillende pogingen om ze op te nemen in de steigers waren niet succesvol. Dit leidde tot het gebruik van een sonicator, in plaats van de vortex mixer, een betere spreiding van de eerste emulsie en maken kleinere bollen. Nadat de microsferen waren klein genoeg, ze gemakkelijk gepasseerd door de naald en electrospun samen met de rest van de oplossing. De primaire electrospinning oplossing in dit protocol wordt opgelost in water, in plaats van zware oplosmiddelen, om schade aan de NGF voorkomen en een gastvrije substraat voor celgroei 28.
Vele werkwijzen zijn getest voor het verschaffen van topografische en chemische signalen zenuwbeschadiging sites. Enkele vroege pogingen verschaffen NGF verwondingen betrokken putting oplossingen van vrij NGF of NGF bevattende microbolletjes in het centrum van een vaste silicium zenuwleiding (NC) 36. Deze supported zenuwgroei; hoewel deze geen aanvullende aanwijzingen of dat het vermogen patroon de locatie van de groeifactoren in de NC. In een meer recent voorbeeld Yan et. . al gebruikte poly [(melkzuur)-co - [(glycolzuur) -alt- (L-lysine)]] (PLGL) gemodificeerd door enten Gly-Arg-Gly-Asp-Gly (RGD peptide) en NGF te fabriceren PLGL-RGD-NGF zenuw leidingen 37. Ook deze voorwaarde het chemisch signaal dat de zenuw groei bevorderd, maar voorzag niet in andere cues. Een andere studie gebruikt NGF ingekapseld in microsferen met elektrogesponnen steigers boven en onder hen 38. Dit systeem biedt wel zowel de topografische signalen van een vezelachtige steiger in combinatie met NGF als chemisch cue. De introductie duurde een week, die niet lang genoeg perifere zenuwreparatie ondersteunen, en de locatie van de microsferen niet goed beheerst.
Andere onderzoekers hebben zich gericht op de integratie van de chemische signalen in de vezels. Een ontmoetinghod maakt en emulsie van de hydrofiel eiwit met een hydrofoob polymeer. Deze methode kon topografische en chemische signalen verschaffen, maar 60% van het eiwit werd in de eerste 12 dagen 39. Een ander voorbeeld gebruikt coaxiale elektrospinproces om NGF kapselen binnen poly (melkzuur-caprolacton) (P (LLA-CL)) vezels 40,41. Deze methode die resultaten vergelijkbaar met de handtekening in een rat heupzenuw model. Echter, is er speciale apparatuur nodig voor coaxiale elektrospinproces en het is onduidelijk in welk tempo het eiwit werd uitgebracht, en indien dit kan worden volgehouden. De combinatie van topografische signalen in de vorm uitgelijnde electrospun vezels en chemische signalen via microsferen die vrij ruim 2 maanden zoals hier beschreven, biedt meerdere synergetische signalen en is zeer afstembare een aangepaste omgeving.
Er zijn verschillende problemen die moeten worden overwogen wanneer elektrospinning; omgevingsfactoren van invloed kan Electrosspelden van geen oplossing. Een onverwachte verandering in de luchtvochtigheid, bijvoorbeeld, kan een significant effect hebben op de elektrospinproces resultaten hebben en leiden tot inconsistente vezels. Het hebben van een aparte ruimte die milieuvriendelijk kunnen worden gecontroleerd is zeer behulpzaam. Een temperatuur van 70 ° C met 50% vocht werd gebruikt voor deze experimenten. Een ander potentieel probleem met electrospinning systeem kortsluiting; zij vaak maakt duidelijk vonken tussen de spuit en metaal stukken op de pomp. Om dit plaats plastic of een ander isolator tussen te voorkomen; voedsel opbergtas gewicht plastic werkt goed. Op dezelfde manier kan verdwaalde elektrische ladingen in het milieu veroorzaken materiaal te accumuleren in onverwachte locaties. Om dit te voorkomen kun je een behuizing met acryl platen of ander isolerend materiaal te maken. Meer informatie over het aanpassen van elektrospinproces voorwaarden zijn te vinden in de review van Sill 24.
De volgende stappen voor deze procedure zal inkapselen andere growth factoren om meer dynamische steigers met meerdere groeifactoren te creëren. Bijvoorbeeld is NGF aangetoond dat synergistisch werken met gliacellen afgeleide groeifactor sensorische en motorische neuronen 3 ondersteunen. Met PLGA microsferen, kunnen we de afgifte te regelen door het veranderen van de L: G-verhouding, waarmee wij diverse groeifactoren op verschillende snelheid leveren. Een gradiënt van de microsferen kunnen ook worden gegenereerd op een meer complexe ondersteuningssysteem dat celgedrag verbindt bouwen. Daarnaast zal adhesiefactoren rechtstreeks geconjugeerd aan het dragermateriaal via een Michael additiereactie 26. Tenslotte zal het systeem worden getest met een in vivo ratten heupzenuw model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Irgacure 2959 | BASF | 24650-42-8 | Protect from light |
| PEO 900 kDa | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Syringe Pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Power Source | Gamma High Voltage | ES30P-5W | |
| Motor | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | EXFO | S1000 | |
| Needles | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Polyvinyl Alcohol | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Isoporopyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-500mL | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
| BSA-FITC | Sigma-Aldrich | 080M7400 | |
| β-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 1156-NG | |
| 65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | 1001554270 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-2L | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Thermo Scientific | 1856209 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 1001558456 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| Glutamine | Fisher Scientific | G7513 | |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 |
References
- Wrobel, M. R., Sundararaghavan, H. G. Directed migration in neural tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. , (2013).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5, 293-347 (2003).
- Madduri, S., di Summa, P., Papaloizos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
- Madduri, S., Gander, B. Growth factor delivery systems and repair strategies for damaged peripheral nerves. J Control Release. 161, 274-282 (2012).
- Madigan, N. N., McMahon, S., O'Brien, T., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J. Current tissue engineering and novel therapeutic approaches to axonal regeneration following spinal cord injury using polymer scaffolds. Respir Physiol Neurobiol. 169, 183-199 (2009).
- Sundararaghavan, H. G., Monteiro, G. A., Firestein, B. L., Shreiber, D. I. Neurite growth in 3D collagen gels with gradients of mechanical properties. Biotechnol. Bioeng. 102, 632-643 (2009).
- Hudson, T. W., Evans, G. R., Schmidt, C. E. Engineering strategies for peripheral nerve repair. Clin Plast Surg. 26, 617-628 (1999).
- Kokai, L. E., Bourbeau, D., Weber, D., McAtee, J., Marra, K. G. Sustained growth factor delivery promotes axonal regeneration in long gap peripheral nerve repair. Tissue Eng Part A. 17, 1263-1275 (2011).
- Bronzino, J. D., Peterson, D. R. The Biomedical Engineering Handbook, Third Edition - 3 Volume Set: Tissue Engineering and Artificial Organs. , 3 edition edn, CRC Press. (2006).
- Bell, J. H. A., Haycock, J. W. Next generation nerve guides: materials, fabrication, growth factors, and cell delivery. Tissue Eng Part B Rev. 18, 116-128 (2012).
- Ruiter, G. C. W., Malessy, M. J. A., Yaszemski, M. J., Windebank, A. J., Spinner, R. J. Designing ideal conduits for peripheral nerve repair. Neurosurgical focus. 26, (2009).
- Olakowska, E., Woszczycka-Korczyńska, I., Jędrzejowska-Szypułka, H., Lewin-Kowalik, J. Application of nanotubes and nanofibres in nerve repair. A review. Folia Neuropathol. 48, 231-237 (2010).
- Gunn, J., Zhang, M. Polyblend nanofibers for biomedical applications: perspectives and challenges. Trends Biotechnol. 28, 189-197 (2010).
- Sundararaghavan, H. G., Masand, S. N., Shreiber, D. I. Microfluidic generation of haptotactic gradients through 3D collagen gels for enhanced neurite growth. Journal of Neurotrauma. 28, 2377-2387 (2011).
- Sundararaghavan, H. G., Metter, R. B., Burdick, J. A. Electrospun fibrous scaffolds with multiscale and photopatterned porosity. Macromol Biosci. 10, 265-270 (2010).
- Edalat, F., Sheu, I., Manoucheri, S., Khademhosseini, A. Material strategies for creating artificial cell-instructive niches. Current Opinion in Biotechnology. 23, 820-825 (2012).
- Annabi, N., et al. Synthesis of highly porous crosslinked elastin hydrogels and their interaction with fibroblasts in vitro. Biomaterials. 30, 4550-4557 (2009).
- Castaño, O., Eltohamy, M., Kim, H. -W.
- Chew, S. Y., Wen, J., Yim, E. K. F., Leong, K. W. Sustained release of proteins from electrospun biodegradable fibers. Biomacromolecules. 6, 2017-2024 (2005).
- Han, D., Gouma, P. -I. Electrospun bioscaffolds that mimic the topology of extracellular matrix. Nanomedicine. 2, 37-41 (2006).
- Prabhakaran, M. P., et al. Electrospun biocomposite nanofibrous scaffolds for neural tissue engineering. Tissue Eng Part A. 14, 1787-1797 (2008).
- Xie, J., MacEwan, M. R., Schwartz, A. G., Xia, Y. Electrospun nanofibers for neural tissue engineering. Nanoscale. 2, 35-44 (2010).
- Yao, L., O'Brien, N., Windebank, A., Pandit, A. Orienting neurite growth in electrospun fibrous neural conduits. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 90, 483-491 (2009).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
- Ifkovits, J. L., Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Electrospinning fibrous polymer scaffolds for tissue engineering and cell culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2009).
- Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. Gradients with depth in electrospun fibrous scaffolds for directed cell behavior. Biomacromolecules. 12, 2344-2350 (2011).
- Meinel, A. J., Germershaus, O., Luhmann, T., Merkle, H. P., Meinel, L. Electrospun matrices for localized drug delivery: current technologies and selected biomedical applications. Eur J Pharm Biopharm. 81, 1-13 (2012).
- Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
- Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. Controlled degradation and mechanical behavior of photopolymerized hyaluronic acid networks. Biomacromolecules. 6, 386-391 (2005).
- Péan, J. M., et al. Optimization of HSA and NGF encapsulation yields in PLGA microparticles. International Journal of Pharmaceutics. 166, 105-115 (1998).
- Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. The Uptake and Intracellular Fate of PLGA Nanoparticles in Epithelial Cells. Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).
- Hollenbeck, P. J., Bamburg, J. R. Neurons: Methods and Applications for the Cell Biologist. , Gulf Professional Publishing. (2003).
- Boer, R., et al. Rat sciatic nerve repair with a poly-lactic-co-glycolic acid scaffold and nerve growth factor releasing microspheres. Microsurgery. 31, 293-302 (2011).
- Pujic, Z., Goodhill, G. J. A dual compartment diffusion chamber for studying axonal chemotaxis in 3D collagen. Journal of Neuroscience Methods. 215, 53-59 (2013).
- Madduri, S., di Summa, P., Papaloïzos, M., Kalbermatten, D., Gander, B. Effect of controlled co-delivery of synergistic neurotrophic factors on early nerve regeneration in rats. Biomaterials. 31, 8402-8409 (2010).
- Xu, X., et al. Polyphosphoester microspheres for sustained release of biologically active nerve growth factor. Biomaterials. 23, 3765-3772 (2002).
- Yan, Q., Yin, Y., Li, B. Use new PLGL-RGD-NGF nerve conduits for promoting peripheral nerve regeneration. Biomed Eng Online. 11, (2012).
- Gungor-Ozkerim, P. S., Balkan, T., Kose, G. T., Sarac, A. S., Kok, F. N. Incorporation of growth factor loaded microspheres into polymeric electrospun nanofibers for tissue engineering applications. J Biomed Mater Res A. , (2013).
- Li, X., et al. Encapsulation of proteins in poly(L-lactide-co-caprolactone) fibers by emulsion electrospinning. Colloids Surf B Biointerfaces. 75, 418-424 (2010).
- Wang, C. -Y., et al. The effect of aligned core-shell nanofibres delivering NGF on the promotion of sciatic nerve regeneration. J Biomater Sci Polym Ed. 23, 167-184 (2012).
- Liu, J. -J., Wang, C. -Y., Wang, J. -G., Ruan, H. -J., Fan, C. -Y. Peripheral nerve regeneration using composite poly(lactic acid-caprolactone)/nerve growth factor conduits prepared by coaxial electrospinning. J Biomed Mater Res A. 96, 13-20 (2011).
