Introduction
Uno de los retos actuales en la ingeniería de tejido neural es la creación de un conducto nervioso (NC) que imita la matriz extracelular, donde los nervios crecen naturalmente. La investigación ha demostrado que las células responden a varios factores en su entorno, incluyendo las señales químicas 1-3 mecánica, topográficos, adhesivo y. Uno de los principales desafíos en este campo consiste en determinar la combinación adecuada de señales y la fabricación de un sistema que puede mantener las señales durante un período prolongado para apoyar el crecimiento celular 4. Neuronas periféricas se sabe que prefieren un sustrato blando, ser dirigidos por fibras alineadas, y responden al factor de crecimiento nervioso (NGF) 5-7. CN que puede proporcionar señales químicas durante semanas se ha demostrado para proporcionar una mejor recuperación funcional más cercana a la de los aloinjertos, el estándar de oro actual para la reparación del nervio 8,9.
Materiales y métodos de producción Varios se puede utilizar para producir mecánica y topográficoal cues 10-13. Señales mecánicas son inherentes al material elegido, haciendo la selección del material apropiado para la aplicación crítica 1,13. Los métodos de producción para el control de señales topográficas incluyen la separación de fases, auto-ensamblaje y electrospinning 1,13. Para aplicaciones a microescala, microfluídica, photopatterning, aguafuerte, sanguijuelas sal, o espumas de gas también se puede utilizar 14-17. Electrospinning se ha convertido en la manera más popular para diseñar sustratos fibrosos para el cultivo de tejidos, debido a su flexibilidad y facilidad de producción 13,18-23. Nanofibras electrohiladas se fabrican aplicando un alto voltaje a una solución de polímero haciendo que repeler a sí mismo y se extienden a través de una breve pausa para descargar 24. Un andamio alineados se puede crear mediante la recopilación de las fibras sobre un mandril giratorio a tierra y andamios no alineados se recogen en una placa estacionaria 25. Adhesión de señalización se puede lograr mediante el recubrimiento del ingenio andamio fibrosoh fibronectina o la conjugación de un péptido de adhesión, tales como RGD, al HA antes de electrospinning 26.
Las señales químicas, tales como factores de crecimiento, son los más difíciles de mantener durante períodos prolongados, ya que necesitan una fuente de liberación controlada. Muchos sistemas se han intentado añadir liberación controlada a las redes fibrosas electrohiladas con diferentes niveles de éxito. Estos métodos incluyen electrospinning mezcla, emulsión electrospinning, electrospinning núcleo de carcasa y conjugación de la proteína 27. Además, electrospinning se realiza tradicionalmente en un disolvente volátil, que puede afectar a la viabilidad de la proteína de 28, por lo tanto mantener la bioactividad de la proteína debe ser considerado.
Este enfoque aborda específicamente la combinación de señales mecánicas, topográficos, químicos y adhesivos para crear un andamio ajustable para el crecimiento de los nervios periféricos. La mecánica del andamio se controla con precisión mediante la síntesis deÁcido Hialurónico metacrilado (HA). Los sitios metacrilación se utilizan para unir fotos reticulantes reactivos. El material reticulado ya no es soluble en agua y se divide exclusivamente por las enzimas 29. La cantidad de reticulación cambia la velocidad de degradación, la mecánica y otras propiedades físicas del material. Uso de HA con 30% metacrilación, que tiene un módulo de tracción de ~ 500 Pa, crea un sustrato blando que está cerca de la mecánica nativos de tejido neural y típicamente se prefiere por las neuronas 26,29. Electrospinning en un mandril giratorio se utiliza para crear fibras alineadas para una señal topográfica. Usando electrospinning junto con microesferas proporciona señales químicas dentro del andamio durante períodos prolongados. Para apoyar microesferas de crecimiento de neuritas que contienen NGF se utilizan para crear la señal química. A diferencia de la mayoría de materiales electrospun HA es soluble en agua por lo que el NGF no se encuentra con solventes fuertes durante la producción. Para añadir una señal de adhesivo, la scaffold está revestida con fibronectina. El sistema completo contiene los cuatro tipos de señales descritos anteriormente: (mecánicas) alineados fibras suaves (topográficos) con la liberación de microesferas de NGF (química) recubiertas con fibronectina (adhesivo). Producción y pruebas de este sistema se describe en este protocolo.
El proceso comienza con la producción de las microesferas con un agua-en-aceite-en-agua de doble emulsión. La emulsión se estabiliza con un tensioactivo, alcohol polivinílico (PVA). La fase acuosa interna contiene la proteína. Como se añade a la fase oleosa, que contiene el material de la cáscara PLGA disuelto en diclorometano (DCM), el tensioactivo crea una barrera entre las fases que protegen la proteína de la DCM. Esta emulsión es de otra fase dispersa en agua que contiene PVA para crear la superficie exterior de las microesferas. La emulsión estable se agita para permitir que el DCM se evapore. Después de enjuagar y liofilización que se quedan con la microesferas cont secoaining la proteína.
Después de que las microesferas se completan están listos para ser electrospun en andamios. En primer lugar se prepara la solución electrospinning. La viscosidad de la solución es crítico para la formación de fibras adecuado. Las soluciones de HA pura no cumplen con este requisito; PEO se agrega como un polímero portador para permitir electrospinning. Las microesferas se añaden a la solución y electrospun resultando en un andamio fibroso con microesferas distribuidas a lo largo.
Una vez que la producción se ha completado, la proteína debe ser probado para verificar su viabilidad. Para ello, una célula primaria que responde a NGF puede ser utilizado. Este protocolo utiliza ganglios de raíz dorsal (DRG) 8-10 días embriones de pollo de edad. Los haces de células se siembran en los andamios que contienen microesferas llenas de NGF los que están vacías o. Si el NGF es todavía viable debería ver un mayor crecimiento de axones en los andamios que contienen NGF. Si el NGF ya no es viable que lo haráno promover neuritas para ampliar y debe ser similar a la de control.
El procedimiento exacto se describe en el presente documento se centra en el apoyo neural, sin embargo, con modificaciones sencillas en el material, el método de electrospinning, y proteínas que el sistema puede ser optimizado para diferentes tipos de células y tejidos.
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Protocol
1. agua / aceite / agua Doble Emulsión Microsphere Producción
- En primer lugar preparar 2% y 0,5% w / v de las soluciones de alcohol polivinílico (PVA) en agua desionizada. Revuelva las soluciones a 50 ° C hasta que se aclare, esto puede tardar varias horas. Preparar una solución de 2% v / v de alcohol isopropílico en agua desionizada.
- Preparar una solución acuosa de proteína hidrófila deseada. La siguiente tabla proporciona ejemplos de formulaciones.
Tabla 1:. Ejemplo Proteína soluciones Las siguientes soluciones de proteínas se han encapsulado con éxito y electrospun usando este protocolo. Otras soluciones de proteínas hidrófilas se pueden usar según sea necesario.
- Coloque 40 ml de la solución de PVA al 0,5% en un tubo de centrífuga de 50 ml y reservar.
- En un tubo de centrífuga de 15 ml disolver 300 mg de 65:35poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) en 3 ml de diclorometano. Un mezclador de vórtice puede ser utilizado para acelerar la disolución de PLGA.
- Combinar 200 l de solución de proteína y 4 l de solución de PVA al 2%. Verter la mezcla de proteína en la solución de PLGA (paso 1.4). Las soluciones se mantendrán básicamente individualista.
- Se coloca el tubo en un vaso de agua helada. Uso de un aparato de ultrasonidos varita a ~ 10 vatios (RMS), agitar la solución durante unos pocos segundos (5-10) hasta que se crea una emulsión blanca cremosa uniforme.
- Se vierte la emulsión en el tubo de 50 ml que contiene 0,5% de PVA (paso 1.3). Mezcle la solución a alta velocidad en un vórtex durante ~ 20 seg. La solución desarrollará un aspecto turbio.
- Se transfiere la emulsión a un vaso de 200 ml y colocar en una placa de agitación a 350 rpm durante 2 min. Añadir 50 ml de 2% de alcohol isopropílico al vaso de precipitados en la placa de agitación. Deje que la mezcla se continúa agitando durante un mínimo de 1 hora para permitir que el DCM se evapore y el PLGA a endurecerse.
- Transferencia tél microesfera solución en tubos de centrífuga.
- Se centrifuga a 425 g durante 3 min. Las microesferas se concentren en la parte inferior del tubo y aparecerá blanco. Retire con cuidado el sobrenadante del tubo, por encima de las microesferas, y almacenar en una botella de 500 ml.
- Enjuague las microesferas con agua desionizada, llenando el tubo de tres cuartos llena y agitarlo para redistribuir las microesferas en el líquido.
- Repita los pasos 1.10 y 1.11 cuatro veces.
- Tras el enjuague final, separar el sobrenadante de nuevo y colocar en la botella de 500 ml con las otras muestras. Congelar las microesferas recogidos en el tubo de centrífuga, a continuación, se liofiliza durante al menos 24 h.
- Visualizar las microesferas con un microscopio de luz o con un microscopio electrónico de barrido. Las microesferas no mayores de 60 micras son para electrospinning efectiva. Si las microesferas son demasiado grandes, sonicación o de vórtice tiempos más largos pueden ser requeridos en el paso 1.6 o 1.7. <li> Guarde las microesferas secas en un -20 ° C congelador.
- Opcional: Utilice un ensayo de proteínas, por las instrucciones del fabricante, para medir la cantidad de proteína en la botella de 500 ml desde el paso 30 1.10. Esto se utiliza para calcular el porcentaje de proteína encapsulada en las microesferas, restando la cantidad en la solución de lo que fue utilizado en el proceso de producción.
NOTA: Para visualizar la ubicación de proteína en la microesfera añadir Rodamina 2 mg / ml a la solución de PLGA 31 y encapsular una proteína conjugada con FITC Figura 1 muestra un ejemplo..
2. electrospinning con microesferas
- Antes de preparar la solución de electrospinning, crear un 0,5% w / v solución de fotoiniciador, en agua desionizada mediante la disolución a 37 ° C. Este proceso puede tardar varias horas.
- Crear un 2% w / v ácido hialurónico metacrilatado (MEHA) (ver Burdick et al. Para la síntesis) 29, 3%w / v 900 kD poli (óxido de etileno) (PEO) y 0,05% w / v solución de fotoiniciador en agua desionizada.
- Calcular la cantidad correcta de MEHA y PEO para el volumen deseado. Por ejemplo, 10 ml de electrospinning solución requiere 200 mg de MEHA y 300 mg de PEO.
- Disolver el PEO en agua desionizada a 90% del volumen final deseado (9 ml para este ejemplo). Esto puede tomar varias horas, una placa de agitación caliente o baño de agua a 37 ° C pueden ser utilizados para acelerar el proceso.
- A continuación añadimos la MEHA y utilizar un mezclador de vórtice para agitar la solución hasta que se aclare. Esto sólo tomará unos minutos.
- Finalmente añadir la solución de fotoiniciador 0,5% para llenar el volumen restante 10% (1 ml para este ejemplo).
- Añadir las microesferas a la concentración deseada de hasta 400 mg / ml. Mezclar la solución en un mezclador de vórtice hasta que las microesferas se distribuyeron uniformemente en la solución.
- Transferir la solución a una jeringa y fijar un 6 pulgadas bl calibre 18aguja punta unt.
- Coloque la jeringa en una bomba de jeringa y la puso para dispensar a 1,2 ml / hr.
- Pegue una capa de papel de aluminio en el plato de la colecta o mandril. Esto permite una fácil limpieza y almacenamiento del andamio terminado. Un mandril giratorio se utiliza para crear fibras alineadas. Una placa plana o mandril estacionario se traducirá en fibras dispuestas al azar.
- Conectar el cable de tierra de una fuente de alimentación de alto voltaje para el aparato de recogida. Conecte el cable positivo a la aguja.
- Ajuste la superficie de la bomba de jeringa y la recolección de modo que haya 15 cm entre la punta de la aguja y la superficie de recogida.
- Iniciar el bombeo de polímero, cuando la solución es visible en el extremo de la jeringa, encender la fuente de tensión y ajustar la tensión de 24 kV PRECAUCIÓN:. Una vez que la tensión se enciende no toque ninguna parte metálica del sistema. Carga también puede saltar distancias cortas a partir de piezas electrificadas a la piel.
- Ejecute la solución hasta que dse consigue espesor andamio esired. Cuando completa apagar la fuente de tensión y la bomba de jeringa.
- Retire el papel aluminio con el andamio colocado. Completadas andamios que contienen proteínas se almacenan en un congelador de -20 ° C.
3. Proteína Testing bioactividad
- Preparar medios de cultivo celular. Añadir 10% v / v de suero fetal bovino, 1% v / v L-glutamina, y 1% v / v penicilina-estreptomicina al medio de Eagle modificado de Dulbecco.
- Seleccione cubreobjetos de vidrio que cabe totalmente en un plato bien.
- Utilice 3 (trimetoxisilil) propil metacrilato para tratar los cubreobjetos tal como se describe por el fabricante. Metacrilación mejora la adherencia andamio para los cubreobjetos.
- Adjuntar cubreobjetos metacrilados a la zona de recogida de la electrospinner con cinta adhesiva de doble cara antes de electrospinning. Spinning sobre los cubreobjetos facilita la manipulación y visualización.
- Electrospin al espesor deseado como se describe anteriormente.
- Aespués de electrospinning retire con cuidado cubreobjetos de mandril. Coloque el andamio cubreobjetos recubiertos en una cámara de nitrógeno clara y asegúrese de que todo el oxígeno se purga.
- Coloque la cámara y bajo un andamio 10 mW / cm 2 365 nm de luz durante 15 min. Después de la reticulación lugar en placa de tamaño apropiado. Asegúrese de que el lado del andamio esté hacia arriba.
- Coloque los andamios bajo una lámpara germicida durante 30 min para esterilizar. Si la fibronectina u otra proteína deseada se utiliza como un recubrimiento para mejorar la adhesión celular. Siga las instrucciones del fabricante de andamios abrigo.
- Harvest ganglios de raíz dorsal (DRG), como se describe anteriormente por Hollenbeck 32. Se necesitará un DRG para cada andamio cubierto cubreobjetos probado.
- Coloque 100-200 l de los medios de comunicación en cada andamio en la placa también. Con cuidado, coloque uno en cada DRG andamio en la gota de los medios de comunicación. Para andamios de espesor pueden ser necesarios más medios de comunicación; DRG necesita estar totalmente sumergido y no Floating.
- Incubar el andamio y DRG a 37 ° C durante 4 horas para permitir que la célula se adhiera a la andamio.
- Rellene los medios de comunicación para el nivel apropiado para el bien y colocar de nuevo en la incubadora. Continuar la incubación durante 4-6 días.
- Tras el período de incubación retire con cuidado los medios de cada pocillo y lavar suavemente una vez con PBS. Fijar las células durante 30 min utilizando 4% w / v de paraformaldehído.
- Las células de la mancha utilizando una mancha de anticuerpos para neurofilamentos. Esto permitirá la visualización del crecimiento de neuritas para la cuantificación. DAPI también se puede utilizar para ver núcleos de las células. Un ejemplo de protocolo de tinción fue descrito por Sundararaghavan y sus colegas 14.
- Visualice las células utilizando un microscopio de fluorescencia.
- Colocar la placa de bien en la platina del microscopio.
- Busque la masa celular utilizando los filtros de excitación y ajustes para DAPI.
- Una vez que la célula es cambiar el filtro para FITC para visualizar las neuritas extendidas. Ucantar la función de puntada en el microscopio recoger y combinar tantas imágenes como sea necesario para ver toda la estructura. Repita el procedimiento para DAPI, FITC y campo claro.
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Representative Results
Las microesferas 50 ± 14 micras de diámetro con una proteína de encapsulación más del 85% se han producido y electrospun en andamios consistentemente. Tamaño se determinó mediante la formación de imágenes de muestras de microesferas de tres lotes de producción separadas. Las imágenes en las que capturaron en un microscopio óptico y longitudes donde mide utilizando software laboratorio comercial. Figura 1 muestra un histograma de la distribución de tamaños. Tasa de encapsulación también se ensayó a partir de tres lotes de microesferas separadas, mediante la cuantificación de la proteína que se escapó durante el proceso de producción.
La Figura 2 muestra microesferas representativas con rodamina (2 g / ml) en el -FITC PLGA albúmina de suero bovino y la cáscara (BSA) encapsulado dentro. Las imágenes fueron tomadas usando un microscopio fluorescente. La cáscara se puede ver claramente (rojo) con la proteína se concentró en el interior (verde).
Para evaluar la encapsulación, la microesferas se llenaron con BSA y se ensayaron para la liberación de proteínas con un ensayo de proteínas de Bradford. PLGA se descompone por hidrólisis de enlaces éster, creando espacios más grandes para el escape de proteínas. Las microesferas continúan liberando durante más de 60 días (Figura 3). La liberación comienza con un estallido inicial continúa entonces como microesferas se rompen.
Después de electrospinning las microesferas se pueden ver en toda la estructura fibrosa 3D. Figura 4 muestra una imagen SEM del andamio completo donde las esferas se pueden ver en múltiples capas (indicado por flechas). Distribución de microesferas en los andamios se midió para ser 15,3 ± 3,6 esferas / mm 2. El andamio tiene las microesferas en lugar prevención de la migración de distancia desde el sitio de destino. Como las microesferas se descomponen liberan NGF en el armazón para fomentar el crecimiento de neuritas 33,34. Esto crea una entrega continua de proteína de todo el andamio para apoyar el crecimiento de células y estimular las células se infiltren en el andamio.
Finalmente, ganglios de la raíz dorsal (DRG) se utilizaron para probar la viabilidad de NGF en las microesferas, en el andamio. Figura 5 muestra una DRG sembró en un andamio que contiene microesferas cargadas con NGF junto a uno con microesferas que contienen ninguna proteína en ellos. Hay extensiones más largas neuritas visibles que se extienden desde la DRG en el cadalso NGF, lo que indica que el NGF se mantuvo viable y estimula el crecimiento.
Figura 1. distribución de tamaños de microesferas. Microesferas producidas mediante este protocolo son 50 ± 14 micras de diámetro. El gráfico muestra un histograma del diámetro de las microesferas en 5 micras contenedores.
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Figura 2. imagen fluorescente de microesferas. 2 mg / ml de rodamina se incluyó en la solución de PLGA para visualizar la cubierta de la microesfera (rojo) y BSA-FITC se encapsuló para visualizar la proteína (verde). La proteína se puede ver claramente en la esfera. Barra de escala = 20 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Proteína estreno Curve. Comunicado de BSA de las microesferas más de 60 días se midió utilizando un ensayo de proteínas de Bradford. El estallido inicial es probablemente debido a BSA que se une a la superficie exterior. A medida que el PLGA se rompe, la proteína se libera con el tiempo.
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Figura 4. Andamios que contiene microesferas. El proceso de electrospinning permite microesferas a ser incorporados en toda la profundidad del andamio. (A) Las flechas indican la ubicación de microesferas. Barra de escala = 500 micras imagen. (B) de alta magnificación de una microesfera con las nanofibras de andamio por encima de ella. Barra de escala = 20 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. células primarias NGF bioactividad de prueba. Ganglios raquídeos se recogieron de los 8 días de edad huevos de pollo y se sembraron en andamios con microesferas de NGF lleno (A) o microesferas vacías (B). GRDse tiñeron con un anticuerpo de neurofilamentos, FITC anticuerpo secundario y DAPI para visualizar los núcleos celulares. Imágenes muestran un aumento del crecimiento de neuritas en presencia de microesferas de NGF cargados como indica neuritas manchadas FITC (verde). Esta muestra liberado NGF es viable y puede promover el crecimiento. Las imágenes fueron tomadas con un microscopio confocal. Barra de escala = 200 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Muchos estudios han demostrado que las células nerviosas pueden ser dirigidas por señales topográficas (alineación de la fibra) y señales químicas (factores de crecimiento) 1,2,10,11,35. Electrospinning es un método fácil para crear fibras alineadas. Los factores de crecimiento estimulan el crecimiento del nervio, pero con el fin de incluirlos en los conductos de los nervios (NC), se requiere un método para la liberación sostenida. Para crear un sistema más robusto con ambas señales, estas dos señales se deben combinar. Varios métodos han sido estudiados previamente para proporcionar liberación prolongada de la proteína en el andamio fibroso electrospun para la regeneración del nervio, pero ninguno hasta la fecha han sido capaces de liberación sostenida por más de 60 días. Además, el patrón de liberación del factor de crecimiento no ha sido posible. Aquí se describe un sistema para combinar electrospinning con la entrega de microesferas de PLGA para proporcionar ambas señales.
Los métodos tradicionales para fabricar microesferas de PLGA, tales como el protocolo descrito por de Boer et al. </ Em>, produjo microesferas mucho más grandes 33 (300 ± 100 micras) que no podía resistir el proceso de electrospinning. Varios intentos de incorporarlos en los andamios no tuvieron éxito. Esto condujo a la utilización de un aparato de ultrasonidos, en lugar del mezclador de vórtice, para dispersar mejor la primera emulsión y crear esferas más pequeñas. Una vez que las microesferas eran lo suficientemente pequeño, que pasan fácilmente a través de la aguja y electrospun junto con el resto de la solución. La solución electrospinning primaria en este protocolo se disuelve en agua, en lugar de un disolvente duro, para evitar daños en el NGF y proporcionar un sustrato para el crecimiento celular hospitalario 28.
Muchos métodos han sido probados para proporcionar señales topográficas y químicas a los sitios de lesiones nerviosas. Algunos de los primeros intentos de proporcionar NGF a las lesiones involucrados poner soluciones de NGF o microesferas que contienen NGF libre en el centro de un conducto del nervio silicio sólido (NC) 36. Estos sde crecimiento nervioso upported; sin embargo, no proporcionan señales adicionales o permiten la capacidad de patrón de la ubicación de los factores de crecimiento en el NC. En un ejemplo más reciente Yan et. . al poli utilizado [(ácido láctico) -co - [(ácido glicólico) -alt- (L-lisina)]] (PLGL) modificado por injerto Gly-Arg-Gly-Asp-Gly (péptido RGD) y NGF para fabricar conductos nerviosas PLGL-RGD-NGF 37. Del mismo modo, éstos proporcionaron la señal química que promueve el crecimiento del nervio, pero no proporcionaron otras señales. Otro estudio utilizó NGF encapsulado en microesferas con andamios electrohiladas encima y por debajo de ellos 38. Este sistema proporciona tanto las señales topográficas de un andamio fibroso en combinación con NGF como una señal química. Sin embargo, la liberación sólo duró una semana, que no es lo suficientemente largo para apoyar la reparación del nervio periférico, y la ubicación de las microesferas no está bien controlada.
Otros investigadores se han centrado en la incorporación de las señales químicas en las fibras. Se reunióhod crea y emulsión de la proteína hidrófilo con un polímero hidrófobo. Este método fue capaz de proporcionar señales topográficas y químicas, sin embargo el 60% de la proteína fue lanzado en los primeros 12 días 39. Otro ejemplo utilizado electrospinning coaxial para encapsular NGF dentro de poli (ácido láctico-caprolactona) (P (LLA-CL)) fibras 40,41. Este método proporcionó resultados similares a los del autógrafo en un modelo de nervio ciático de rata. Sin embargo, se necesita un equipo especial para electrospinning coaxial y no está claro que nivel de proteína fue puesto en libertad, y si esto podría ser sostenida. La combinación de señales topográficas en forma de fibras electrohiladas alineados y señales químicas a través de microesferas que liberan por más de 2 meses, como se describe aquí, proporciona múltiples pistas sinérgicos y es altamente ajustable para proporcionar un ambiente personalizado.
Hay varias cuestiones que deben tenerse en cuenta al electrospinning; factores ambientales pueden afectar electrosla fijación de cualesquiera solución. Un cambio inesperado en la humedad, por ejemplo, puede tener un efecto significativo en los resultados electrospinning y causar fibras inconsistentes. Tener una habitación separada que puede ser controlado con el medio ambiente es muy útil. Una temperatura de 70 ° C con 50% de humedad se utilizó para estos experimentos. Otro problema potencial con un sistema de electrospinning es cortocircuitos; que a menudo generan chispas obvias entre las piezas de jeringas y de metal de la bomba. Para evitar esto, el lugar de plástico u otro aislante entre ellos; almacenamiento de alimentos de plástico de peso bolsa funciona bien. Del mismo modo, las cargas eléctricas parásitas en el ambiente pueden hacer que el material se acumule en lugares inesperados. Para evitar esto se puede crear un recinto con hojas de acrílico u otro material aislante. Más información sobre el ajuste de las condiciones de electrospinning se puede encontrar en la revisión por Sill 24.
Los próximos pasos de este procedimiento incluyen la encapsulación de otra growth factores para crear andamios más dinámicos que contienen múltiples factores de crecimiento. Por ejemplo, el NGF se ha demostrado que funciona sinérgicamente con Glial Cell Factor de Crecimiento Derivado de apoyar las neuronas sensoriales y motoras 3. El uso de microesferas de PLGA, podemos controlar la velocidad de liberación mediante la alteración de la relación L: G, lo que nos permitirá ofrecer diversos factores de crecimiento a una tasa diferente. Un gradiente de las microesferas también puede ser generado para construir un sistema de apoyo más complejo que dirige el comportamiento celular. Además, factores de adhesión se pueden conjugar directamente al material de andamio a través de reacción de adición de Michael de un 26. Finalmente, el sistema se probó con un modelo de nervio ciático de rata in vivo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Irgacure 2959 | BASF | 24650-42-8 | Protect from light |
| PEO 900 kDa | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences, Inc. | 23591-100 | Prepare stock solution in DMSO |
| Syringe Pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Power Source | Gamma High Voltage | ES30P-5W | |
| Motor | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | Must attach to a custom built mandrel |
| Tachometer | Network Tool Warehouse | ESI-330 | Use to monitor mandrel speed |
| Omnicure UV Spot Cure System with collimating adapter | EXFO | S1000 | |
| Needles | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| Polyvinyl Alcohol | Sigma-Aldrich | P8136-250G | |
| Isoporopyl Alcohol | Sigma-Aldrich | I9030-500mL | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
| BSA-FITC | Sigma-Aldrich | 080M7400 | |
| β-Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 1156-NG | |
| 65:35 Poly-Lactic-Glycolic-Acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | 1001554270 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-2L | |
| Coomassie (Bradford) Protein Assay | Thermo Scientific | 1856209 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 1001558456 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| Glutamine | Fisher Scientific | G7513 | |
| Pen-Strep | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 |
References
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