Abstract
Изучение центральной нервной системы (ЦНС) созревания зависит от генетической адресности нейронных популяций. Тем не менее, задача ограничивая экспрессию генов, представляющих интерес для конкретных нейрональных подтипов, оказалось на удивление сложным вследствие относительного дефицита конкретных элементов промотора. ГАМКергические интернейронов составляют нейронов население обширных генетических и морфологическое разнообразие. В самом деле, более 11 различных подтипов ГАМК интернейронов были охарактеризованы в коре мыши 1. Здесь мы представляем адаптированный протокол избирательный подход популяций ГАМКергические. Мы достигли подтипа избирательного выбора ГАМКергические интернейронов с помощью энхансерной элемент гомеобоксного транскрипционных факторов Dlx5 и Dlx6, гомологов дрозофилы дистальной-менее (DLL) гена 2,3, для управления экспрессией специфических генов через внутриутробное электропорации.
Introduction
Основная часть коры интернейронов ГАМКергические происходят из двух переходных эмбриональных структур, названных медиальной и хвостового ганглиозные возвышения (MGE и общего равновесия соответственно) 4. Парвальбумина и соматостатина выражая интернейронов происходят в MGE, тогда Calretinin (Cr), Vasointestinal пептид (VIP) и Reelin (Re) выражая интернейронов происходят из КГЭ. Эти интернейрон подтипов можно отличить по их датах рождения. MGE, полученные подтипы рождаются между эмбриональной день 9.5 (E9.5) и E16.5 5,6. В отличие от этого, КГЭ, полученные интернейронов рождаются из E12.5 через E18.5 с их производство достигнув E15.5 6. Генетический таргетинг этого поздно родился населения, однако, пока не удается.
Мышиные дистального-менее (DLX) гены экспрессируется исключительно в развивающихся вентральной части переднего мозга 3. ГАМКергические интернейронов и полосатого тела нейронов разбрасывания, но не корковых пирамидальные клетки выразить Dlx1, 2,5, и 6 генов на ранних стадиях развития 3. В самом деле, гены Dlx выражаются в MGE и КГЭ субвентрикулярной зоне (SVZ) во всех предшественников ГАМКергические. Экспрессия этих генов становится ограниченным, чтобы выбрать подтипы в постмитотических этапах 7-9. Предыдущий экспериментальные доказательства показали, что усилитель элемент Dlx5 / 6 позволяет избирательный подход ГАМКергических линий в трансгенных мышах 2. Мы протестировали использование одного из этих усиливающих элементов в контексте выражение эписомального в развивающемся мозге мыши. Мы суб клонировали энхансер элемент Dlx5 / 6 вместе с минимальным промотором и расширенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP) в Bluescript (BS) магистральной плазмиды (рисунок 1). Мы ввели плазмиды с помощью внутриутробно электропорации в E15.5 для селективного воздействия CR-, VIP и повторно подтипов 3,8,10. Наша методика позволяет редкой электропорации, что облегчаетреконструкция морфологических особенностей ожога клеток. Кроме того, исключительно высокие уровни экспрессии генов в нейронах коры ГАМКергические позволяет функциональных исследований. Мы провели потери и усиление функциональных исследований с использованием нескольких дикого типа и доминантных негативных генов 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные были обработаны в соответствии с правилами и руководящими принципами уходу и использованию комитета Институциональная животных из Нью-Йоркского университета Медицинской школы.
Mouse Штаммы
Швейцарские Webster мышей-самок, предоставляемые Taconic были использованы для этих экспериментов. Для того, чтобы особый акцент поверхностные интернейронов слоя, были использованы эмбрионы E15.5.
Примечание: плазмиды, используемый в этой работе (Dlx5 / 6.eGFP плазмиды 3 мкг / мкл), создан с помощью стандартных методов клонирования. EGFP кДНК клонировали в Dlx5 / 6-Pmin-поли плазмиды. Эта плазмида предоставляется по запросу (demarn02@nyumc.org).
1 Подготовка микроинъекции пипетки
- Установите съемник Heat # 2 по 860.
- Поместите и закрепите стеклянный капилляр около нити. Убедитесь, что наружный диаметр (OD) пипетки примерно 30 мкм.
- Нажмите кнопку "тянуть".
- Осторожно снимите капилляр. В нижней части находится игла. Откажитесь верхнюю часть.
2 Порядок Анестезия
- Подготовка ИФ содержащий камеру. Примечание: Isoflurane является предпочтительным анестетик в связи с его быстрым действием и низкой частотой побочных эффектов. Пентобарбитал другой вариант; Однако, терпимость этого препарата является переменной и может привести к более высокому смертности, чем изофлураном.
- Набор поток изофлуран до 4-5%, в 0,5-1 л / мин O 2.
- Убедитесь, что клапан для камеры открыт в то время как клапан для головного адаптера закрыт.
- Поместите беременную мышь в камере.
- Разрешить мышь идти под действием анестезии. Это займет около 2-3 мин. Проверьте частоту дыхания. Если мышь начинает гипервентиляция, снизить дозу изофлураном.
- После мышь анестезии, сразу же снимите его из камеры. Поместите его вентральной стороной вверх на грелку, и яnsert голову в маске, которая будет продолжать поставлять изофлурана всей операции. Убедитесь, чтобы переключить поток изофлураном из камеры с трубкой, соединяющей головы адаптера кусок. Поместите каплю глаз смазки в каждый глаз и закрыть глаза.
- Установите грелку до 36 ° C градусов, чтобы минимизировать переохлаждение.
- Проверьте отсутствие стопы и хвостовых рефлексов, зажимая задние лапы и хвост.
3 хирургии
- Очистить кожу, покрывающую живота с 70% этанола.
- Используйте пинцет, чтобы вытащить кожу вверх. После каждого хирургии, мыть все инструменты водой с моющим средством, и стерилизовали при 72 ° CO / N.
- Сделать небольшой вертикальный разрез (около 2 см) вдоль средней линии, начиная посередине между третьей и четвертой пар молочных желез. Используйте тонких ножниц хирургии. Позаботьтесь, чтобы не повредить брюшную стенку.
- Аккуратно отделить кожу от брюшины.
- Визуализация артерийи вены на брюшную стенку. Сделайте еще 2 см вертикальный разрез через брюшину (избегая сосуды), чтобы выставить в брюшную полость.
- Зажмите кожу и брюшной стенки с каждой стороны, избегая зажима артерии. Примечание: Если артерии случайно проколот, пожертвовать животное сразу, выполняя шейки дислокации или ИФ передозировки.
- Предварительно нагрейте стерильной PBS до 37 ° С. Обложка зажимы с PBS влажные Ким салфетки.
- Увлажнение подвергается брюшной полости с PBS. Повторите этот шаг несколько раз при выполнении операции.
- Использование круглых щипцов, осторожно потяните эмбрионального цепь (E15.5) от от полости. Пусть цепной отдохнуть на влажных салфеток. Сначала подвергая одну половину матки в первую очередь. После того, как эмбрионы в ней электропорации, вернуть его внутрь, а затем работать на второй половине.
4 Электропорация
- Продолжайте использовать круглые щипцы для манипулирования эмбрионов.
- Visualize боковые желудочки. Боковые желудочки проходят по средней линии (рисунок 1b).
- Добавить Fast Green (В наличии: 10% вес / объем) в растворе ДНК, 1:20 смеси, чтобы визуализировать его во время инъекции. Готовят раствор ДНК путем растворения осадка, полученного из стандартного протокола очистки препаративной макси-в дистиллированной воде.
- Используйте предварительно вытащил микропипетки с поршнем для введения 1 мл раствора ДНК (Dlx5 / 6-EGFP, 3 мкг / мкл) с Fast Green. Обрежьте кончик микропипетки с тонкой Forcep # 5 (Dumont), чтобы оставить 6 мм длина от начала плеча до конца наконечника иглы перед загрузкой пипетки. Держите голову эмбриона с круглыми пинцетом. Введите мозг с пипетки под углом 45 ° с целью для бокового желудочка расположился в средней линии. Если игла проникает через желудочка, медленно отведите пипетку, как вы используете поршень для введения ДНК. Желудочек станет зеленым, когдарешение начинает заполнять его. В этот момент прекращают движение пипетку и вводят 1 мл ДНК. Аккуратно извлеките пипетки.
- Установите CUY21 электропоратора пяти 45V импульсов 50 мс, разнесенных на 950 мс.
- Используйте 5 мм весла электроды для эмбрионов E15.5. Опустите электроды в PBS для обеспечения эффективного текущую передачу.
- Поместите электрод весла вокруг головы эмбриона с положительным веслом на желудочка, содержащую раствор ДНК. Слегка опустите положительный весло в отношении отрицательного один, чтобы создать вентральной тока через ганглиозных возвышениях. Эта манипуляция позволит свести к минимуму внематочной выражение в пирамидальных клеток.
- После размещения электродов, доставить импульс, нажав на педаль один раз.
- Удалите электроды и протрите их чистой. Повторите шаги 4,6-4,9 с каждого эмбриона.
- После электропорации все эмбрионы, залить 3 мл PBS в брюшную полость и вернуть их в брюшной полости.
- Первый шов брюшной стенки с изогнутым иглы и 5-0 шелковой нити, а затем кожу. Применить Лидокаин (4%) на рану. Администрирование 120 мг / кг аспирина внутри брюшины для обезболивания.
Примечание: Вся процедура должна быть выполнена в течение 20 мин или менее. Желательно, чтобы новички только электропорации несколько эмбрионов, чтобы держать короткие время работы. Длительные операции снизится выживаемость эмбрионов. - Снимите животное из трубки анестезии и позволяют восстановления на грелку на бумаге протрите.
- Возвращение животное в клетку, держать его на грелку при 37 ° С и следить за состоянием здоровья. Животные обычно терпеть операцию хорошо и начинают медленно двигаться только после того как они удаляются из трубки анестезии. Если наблюдается чрезмерное кровотечение или вялость, пожертвовать животное сразу, выполняя IACUC утверждены процедуры эвтаназии, такие как смещения шейных позвонков или анестезии передозировки.
- Вернуться клетку к виватновесие. Женщины будут рожать естественным путем.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы адаптировали технику электропорации внутриутробно для достижения типа клеток специальными программами со сроком погашения нейронов. Для управления экспрессией EGFP в КГЭ-полученных интернейронов, мы использовали Dlx5 / 6 энхансерный элемент и ограничена наши инъекции E15.5, этап, когда большинство КГЭ-полученных интернейронов генерируются. Мы провели анализ на P8 и P15 11 (рисунки 1 и 2). Мы подтвердили брюшной происхождение электропорации нейронов путем совместного электропорации в CAG-mCherry и Dlx5 / 6-EGFP плазмиды в эквимолярных концентрациях в E15.5. В этом эксперименте, мы обнаружили, что только брюшные предшественники, расположенные в субвентрикулярной зона (СВЗ) со выразил оба белка 11. Это пространственно временная экспрессия флуоресцентных белков совпадает с нормальным выражением развития в Dlx5 и 6 генов, которые не выраженной в желудочковой но subventricular зона 4. Кроме того, мы оценивали личность GABAergic из Dlx5 / 6-mCherry электропорации интернейронов в GAD67-EGFP Достучаться мыши линии. Мы обнаружили, что подавляющее большинство электропорации нейронов выразил GAD67, фермент, выраженную всех клеток ГАМКергических 11. Кроме того, мы определили подтипа личность электропорации интернейронов, выполняя иммуногистохимии и электрофизиологические анализ на P15. Паттерн экспрессии подтипа специфических маркеров было выявлено с помощью иммунофлуоресценции в разделах криостатных 11 (рисунок 2). Мы обнаружили, что интернейронов электропорированные на E15.5 почти исключительно выразить NPY, Рилин, VIP и Cr, описанные ранее КГЭ-полученные маркеры интернейронов 6. Кроме того, внутренние электрофизиологические свойства этих нейронов находятся в согласии с одной ранее описанной в картографических судьба исследований 6,11. Все вместе, эти результаты показывают, что electropoРацион с усиливающего элемента в E15.5 Dlx5 / 6 селективного воздействия КГЭ-производные интернейронов подтипы.
Рисунок 1. Схематическое изображение экспериментах электропорации. а) Субклонирование стратегию для Dlx5 / 6-EGFP плазмиды. б) Схема, поясняющая экспериментальную стратегию.
Фигура 2 электропорации интернейронов очерчены по выражению КГЭ-производного подтипа маркеров. А) КГЭ, полученных интернейронов электропорации с Dlx5 / 6-EGFP плазмиды. Обратите внимание на редкую электропорации разнообразных подтипов КГЭ. Б) VIP-выражения интернейронов в P8. выражение EGFP очерчиваетВся dentritic дерево и аксонов беседка из отдельных нейронов. C) NPY-выражения интернейрон в P8. NPY выражение очерчивает neurogliaform клеток. Г) NPY-выражения интернейронов в P15. Шкала бар, 100 мм; BD, 50 мм
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ограничения техники
В то время как этот метод позволяет мобильному автономного анализа клеточных процессов, он не подходит для анализа населения. В electroporations очень редкие с менее тысячи клеток электропорации за мозга. Как следствие, этот метод не может быть использован для оценки поведенческих последствий, связанных с генетической манипуляции КГЭ-производных интернейронов.
В то время как electroporations проводят при E13.5-E14.5 целевой MGE-производных подтипов, эффективность низка 10. Мы полагаем, что Dlx5 / 6 энхансер менее активен в постмитотических MGE подтипов по крайней мере, в контексте эписомального экспрессии.
Значение в отношении существующих методов
Методика представляет продвижение от ранее методов электропорации 12,13 для изучения интернейронов. Благодаря своей относительной редкости и брюшной эмбрионаNIC происхождения, эта популяция нейронов оказалось трудно цели. Наша методика предоставляет средства для выполнения клеток-автономная анализ КГЭ-полученных интернейронов. Высокие уровни экспрессии EGFP позволяют для визуализации и анализа одиночных интернейронов.
Будущие приложения
Комбинируя использование конкретных плазмид и генетически модифицированных мышей линий можно достичь временного и пространственного управления в экспрессии генов, представляющих интерес. Например, мы использовали Dlx5 / 6-TTA плазмиды, чтобы включить выражения Teto индуцибельных трансгенов. В этих экспериментах, мы смогли заглушить экспрессию трансгена путем введения доксициклина 8. Мы в настоящее время разрабатывают протокол использовать технику в сочетании с системой Creer.
Критические шаги в рамках Протокола
Для достижения эффективного электропорации и выживания, стараются избегать excesSive манипуляции эмбрионов и / или органов. Кроме того, во избежание защемления артерии и вены. Мышь быстро станет гиповолемического если кровотечение происходит. После электропорации завершения, поместите эмбрионы и органы в тех же местах, где вы нашли их избегать составления перегибов, которые могут привести гипоксию. Стремитесь к 20 мин или меньше времени хирургии. Увлажнение брюшной полости с PBS много раз во время операции. Во время электропорации, попробуйте проколоть желудочек только один раз с капиллярной иглы. Повторяющиеся прокалывание снизится выживаемость. После периода подготовки, выживаемость должна быть 80% и выше.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарны Lihong Инь для оказания технической помощи. NVD является получателем NARSAD молодых исследователей премии и также при поддержке грантов NIH (5 K99 MH095825-02). Исследования в лаборатории Fishell поддерживается Национальным институтом здравоохранения, Национального института психического здоровья (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), Национального института неврологических расстройств и инсульта (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972 -01A1) и Фонд Саймонса.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5 mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
References
- Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).
- Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis. J Neurosci. 23, 167-174 (2003).
- Eisenstat, D. D., et al. DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation. J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).
- Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors. J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).
- Bulfone, A., et al. The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos. Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).
- Bulfone, A., et al. Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries. J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).
- Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain. The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).
- Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472, 351-355 (2011).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239 (2007).
