Abstract
El estudio del sistema nervioso (CNS) central de la maduración depende de la orientación genética de poblaciones neuronales. Sin embargo, la tarea de restringir la expresión de genes de interés para los subtipos neuronales específicas ha demostrado ser notablemente difícil debido a la escasez relativa de los elementos específicos del promotor. Interneuronas GABAérgicas constituyen una población neuronal con amplia diversidad genética y morfológica. De hecho, más de 11 subtipos diferentes de interneuronas GABAérgicas se han caracterizado en la corteza del ratón 1. Aquí presentamos un protocolo adaptado para la orientación selectiva de poblaciones GABAérgicas. Hemos logrado subtipo dirección selectiva de las interneuronas GABAérgicas utilizando el elemento potenciador de la transcripción homeobox factores Dlx5 y Dlx6, homólogos de la (DLL)-gen distal Drosophila menos 2,3, para conducir la expresión de genes específicos a través de la electroporación en el útero.
Introduction
La mayor parte de las interneuronas GABAérgicas corticales se originan a partir de dos estructuras embrionarias transitorias nombradas las eminencias ganglionares medial y caudal (MGE y CGE, respectivamente) 4. Parvalbúmina y somatostatina expresar interneuronas se originan en el MGE mientras Calretinina (Cr), vasointestinal péptido (VIP) y Reelin (Re) que expresa interneuronas son originarios de la CGE. Estos subtipos de interneuronas pueden ser distinguidos por sus fechas de nacimiento. MGE subtipos derivados nacen entre el día embrionario 9.5 (E9.5) y E16.5 5,6. En contraste, las interneuronas CGE derivadas nacen de E12.5 E18.5 a través con su producción alcanzando un máximo de 6 E15.5. La selección genética de esta población nació tarde, sin embargo, sigue siendo difícil de alcanzar.
Los distal-less genes murinos (Dlx) se expresan exclusivamente en el prosencéfalo ventral desarrollo 3. Interneuronas GABAérgicas y las neuronas de proyección estriatales pero las células piramidales corticales no expresan Dlx1, 2,5, y 6 genes en las etapas tempranas del desarrollo 3. De hecho, los genes Dlx se expresan en la zona MGE y CGE subventricular (SVZ) en todos los progenitores GABAérgicas. La expresión de estos genes se restringe para seleccionar subtipos en las etapas postnatales 7-9. Evidencia experimental anterior mostró que el elemento potenciador Dlx5 / 6 permite el señalamiento selectivo de linajes GABAérgicas en modelos de ratones transgénicos 2. Hemos probado el uso de uno de estos elementos potenciadores en el contexto de expresión episomal en el cerebro de ratón en desarrollo. Se subclonó el elemento potenciador Dlx5 / 6 junto con un promotor mínimo y la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) en un Bluescript (BS) plásmido columna vertebral (Figura 1). Hemos introducido el plásmido mediante electroporación en el útero en E15.5 para atacar selectivamente Cr-, VIP e Investigación subtipos 3,8,10. Nuestra técnica permite la electroporación escasa, lo que facilitala reconstrucción de las características morfológicas de las células chamusquina. Además, los niveles excepcionalmente altos de expresión génica en neuronas GABAérgicas corticales permite para los estudios funcionales. Hemos llevado a cabo la pérdida y ganancia de estudios de la función utilizando varios tipo silvestre y genes dominantes negativos 11.
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Protocol
Todos los animales fueron tratados de acuerdo con las normas y directrices del Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de la Escuela de Medicina de NYU.
Las cepas de ratón
Ratones hembra Swiss Webster proporcionadas por TACONIC se utilizaron para estos experimentos. Con el fin de centrarse específicamente en las interneuronas de la capa superficial, se utilizaron embriones E15.5.
Nota: El plásmido usado en este trabajo (Dlx5 / plásmido 6.eGFP 3 g / l) se generó usando técnicas de clonación estándar. El ADNc de EGFP se clonó en un / 6-Pmin-poliA plásmido Dlx5. Este plásmido está disponible bajo petición (demarn02@nyumc.org).
1 Preparación de microinyección Pipetas
- Ajuste el extractor de calor # 2-860.
- Coloque y fije el capilar de vidrio cerca del filamento. Compruebe que el diámetro exterior (OD) de la pipeta es más o menos 30 micras.
- Pulse el botón "tirar".
- Retire con cuidado el capilar. La parte inferior es la aguja. Deseche la parte superior.
2. Procedimiento Anestesia
- Preparar una cámara que contiene isoflurano. Nota: El isoflurano es el anestésico preferido debido a su rápida acción y una baja incidencia de efectos secundarios. El pentobarbital es otra opción; Sin embargo, la tolerancia de este fármaco es variable y puede conducir a una tasa de mortalidad más alta que isoflurano.
- Ajuste el flujo de isoflurano al 4-5% en 0,5-1 L / min de O 2.
- Asegúrese de que la válvula de la cámara está abierta, mientras que la válvula para el adaptador de la cabeza está cerrado.
- Coloca el ratón embarazada en la cámara.
- Deje que el ratón para ir bajo el efecto de la anestesia. Esto tomará alrededor de 2-3 minutos. Compruebe la velocidad de la respiración. Si el ratón comienza a hiperventilar, disminuir la dosis de isoflurano.
- Una vez anestesiado el ratón, con prontitud y eliminar de la cámara. Colóquelo del lado ventral hacia arriba sobre el cojín eléctrico y insert la cabeza en la máscara que continuará para suministrar isoflurano durante toda la cirugía. Asegúrese de cambiar el flujo de isoflurano desde la cámara a la tubería de conexión de la pieza de adaptador de la cabeza. Ponga una gota de lubricante ocular en cada ojo y cerrar los ojos.
- Ajuste la almohadilla térmica a 36 ° C grados para minimizar la hipotermia.
- Compruebe la ausencia de reflejos del pie y de la cola pellizcando las patas traseras y la cola.
3. Cirugía
- Limpiar la piel que cubre el abdomen con etanol al 70%.
- Use unas pinzas para tirar de la piel hacia arriba. Después de cada cirugía, lavar todos los instrumentos con agua y detergente, y se esterilizó a 72 ° CO / N.
- Hacer una pequeña incisión vertical (alrededor de 2 cm) a lo largo de la línea media de partida a medio camino entre el tercer y cuarto pares de glándulas mamarias. Con unas tijeras quirúrgicas finas. Tenga cuidado de no dañar la pared abdominal.
- Separar suavemente la piel del peritoneo.
- Visualice las arteriasy las venas en la pared abdominal. Hacer otro 2 cm incisión vertical a través del peritoneo (evitando los vasos) para exponer la cavidad abdominal.
- Abrazadera de la piel y la pared abdominal en cada lado de sujeción evitando las arterias. Nota: Si se perfora accidentalmente las arterias, sacrificar al animal de inmediato mediante la realización de dislocación cervical o sobredosis de isoflurano.
- Pre calentar el PBS estéril a 37 ° C. Cubra las abrazaderas con PBS húmedos Kim toallitas.
- La hidratación de la cavidad abdominal expuesta con PBS. Repita este paso varias veces mientras se realiza la cirugía.
- Con unas pinzas redondas, tire suavemente de la cadena de embriones (E15.5) de distancia de la cavidad. Que el resto de la cadena en las toallitas húmedas. Iniciar mediante la exposición de una mitad de la primera útero. Una vez que los embriones en que se electroporación, traerlo de vuelta en el interior, a continuación, trabajar en la segunda mitad.
4. electroporación
- Siga usando pinzas redondas para manipular los embriones.
- Visualize los ventrículos laterales. Los ventrículos laterales corren a lo largo de la línea media (Figura 1b).
- Añadir Fast Green (Stock: 10% w / v) a la solución de ADN para una mezcla 01:20 de visualizar durante la inyección. Preparar la solución de ADN disolviendo el sedimento obtenido a partir de un protocolo de purificación maxi-prep estándar en agua destilada.
- Utilice micropipetas pre desmenuzado con un émbolo para inyectar 1 ml de solución de ADN (Dlx5 / 6-eGFP, 3 g / l) con Fast Green. Cortar la punta de la micropipeta con un fórceps fino # 5 (Dumont) para salir de 6 mm de longitud desde el comienzo del hombro hasta el extremo de la punta de la aguja antes de cargar la pipeta. Sostenga la cabeza del embrión con pinzas redondas. Introduzca el cerebro con la pipeta en un ángulo de 45 ° con el objetivo para el ventrículo lateral situado cerca de la línea media. Si la aguja penetra a través del ventrículo, retraiga lentamente la pipeta y cuando utilice el émbolo para inyectar ADN. El ventrículo se volverá color verde cuando elsolución comienza a llenarlo. En este punto, dejar de moverse la pipeta y se inyecta 1 ml de ADN. Con cuidado, retire la pipeta.
- Ajuste el electroporador CUY21 a cinco 45V pulsos de 50 ms espaciadas por 950 ms.
- Utilice 5 mm electrodos de pádel para los embriones E15.5. Sumergir los electrodos en PBS para asegurar la transmisión de corriente eficiente.
- Coloque las paletas de electrodos alrededor de la cabeza del embrión con la paleta positivo en el ventrículo que contiene la solución de ADN. Ligeramente inferior de la paleta positiva con respecto a la negativa para crear una corriente ventral a través de las eminencias ganglionares. Esta manipulación se minimizará la expresión ectópica en las células piramidales.
- Después de la colocación de los electrodos, aplicar un pulso al presionar el pedal una vez.
- Retire los electrodos y límpielos. Repita los pasos 4.6 a 4.9 con cada embrión.
- Después de la electroporación todos los embriones, vierta 3 ml de PBS en la cavidad abdominal y devolverlos a la cavidad abdominal.
- Primera sutura de la pared abdominal con una aguja curva y sutura de seda 5-0 y luego la piel. Aplicar lidocaína (4%) sobre la herida. Administrar 120 mg / kg de aspirina peritoneo intra de la analgesia.
Nota: Todo el procedimiento se debe realizar en 20 min o menos. Es aconsejable que los principiantes electroporar sólo unos pocos embriones para mantener el tiempo de funcionamiento corto. Cirugías prolongadas disminuirán la tasa de supervivencia de los embriones. - Retire el animal de la tubería de la anestesia y permitir la recuperación sobre el cojín eléctrico en una toallita de papel.
- Animales Regresar a la jaula, manténgalo sobre el cojín eléctrico a 37 ° C y monitorear el estado de salud. Los animales toleran generalmente bien de la cirugía y comienzan a moverse lentamente poco después de que se retiran de la tubería de la anestesia. Si se observa sangrado excesivo o letargo, sacrificar al animal inmediatamente realizando IACUC aprobó proceder a la eutanasia como la dislocación cervical o sobredosis de anestesia.
- Jaula Volver a la vivarium. Las hembras dan a luz de forma natural.
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Representative Results
Se adaptó la técnica de electroporación en el útero para lograr el tipo de célula orientación específica de las neuronas maduras. Para conducir la expresión de EGFP en interneuronas derivados de CGE, se utilizó el elemento potenciador Dlx5 / 6 y restringido nuestro inyecciones a E15.5, la etapa en que la mayoría de las interneuronas derivados de CGE se generan. Hemos llevado a cabo el análisis en P8 y P15 11 (Figuras 1 y 2). Se confirmó el origen ventral de neuronas electroporadas por co electroporating un CAG-mCherry y un DLX5 plásmidos / 6-eGFP en concentraciones equimolares en E15.5. En este experimento, se observó que sólo los progenitores ventrales situados en la zona subventricular (SVZ) co expresan ambas proteínas 11. Esta expresión temporal espacio de proteínas fluorescentes coincide con la expresión del desarrollo normal de la Dlx5 y 6 genes, que no se expresan en el ventrículo, pero subventricular zona 4. Además, se evaluó la identidad de las interneuronas GABAérgicas Dlx5 / 6 mCherry electroporadas en una línea knockin ratón GAD67-eGFP. Se encontró que la gran mayoría de las neuronas a electroporación expresó GAD67, una enzima expresada por todas las células GABAérgicas 11. Además, se determinó la identidad de subtipo de interneuronas electroporación mediante la realización de inmunohistoquímica y análisis electrofisiológico en P15. El patrón de expresión de marcadores específicos de subtipo fue revelado por inmunofluorescencia en secciones de criostato 11 (Figura 2). Encontramos que las interneuronas electroporadas en E15.5 expresan casi exclusivamente NPY, Reelin, VIP y Cr, marcadores interneuron derivados-CGE 6 descrito anteriormente. Además, las propiedades electrofisiológicas intrínsecas de estas neuronas están de acuerdo con la descrita previamente en estudios de mapeo de destino 6,11. En conjunto, estos resultados indican que electroporación con el elemento Dlx5 / 6 potenciador en E15.5 apuntar selectivamente subtipos de interneuronas derivados de CGE.
Figura 1: Representación esquemática de los experimentos de electroporación. a) Subclonación estrategia para la Dlx5 / 6-eGFP plásmido. b) Diagrama que ilustra la estrategia experimental.
Figura 2. electroporados interneuronas están delineadas por la expresión de marcadores de subtipos derivados de CGE. A) interneuronas CGE derivados electroporación con un / 6-eGFP plásmido Dlx5. Tenga en cuenta la escasa electroporación de diversos subtipos de EGC. B) Un interneuron VIP expresan en P8. eGFP expresión delimita eltodo el árbol dendrítico y axonal cenador de neuronas individuales. C) Un interneuron NPY expresan en P8. Expresión de NPY delinea células neurogliaformes. D) Un interneuron NPY expresan en P15. La barra de escala A, 100 mm; BD, 50 mm
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Discussion
Limitaciones de la Técnica
Si bien esta técnica permite la célula de análisis autónoma de procesos celulares, no es adecuado para el análisis de la población. Los electroporaciones son muy escasos con menos de mil células por electroporación cerebro. Como consecuencia, la técnica no se puede utilizar para evaluar las consecuencias de comportamiento derivados de la manipulación genética de las interneuronas derivados de CGE.
Mientras electroporaciones llevaron a cabo a subtipos derivados de MGE objetivo E13.5-E14.5, la eficiencia es baja 10. Especulamos que el Dlx5 / 6 potenciador es menos activo en subtipos MGE postmitotic al menos en el contexto de la expresión episomal.
Significativas en relación con los métodos existentes
La técnica representa el avance de los métodos de electroporación anteriormente 12,13 para el estudio de las interneuronas. Debido a su relativa escasez y el embrión ventralorigen nic, esta población de neuronas ha demostrado ser difícil de dirigir. Nuestra técnica proporciona los medios para llevar a cabo el análisis de células autónomas de las interneuronas derivados de CGE. Los altos niveles de expresión eGFP permiten la visualización y el análisis de las interneuronas individuales.
Aplicaciones futuras
Al combinar el uso de plásmidos específicos y líneas de ratones modificados genéticamente, es posible lograr un control espacial y temporal en la expresión de genes de interés. Por ejemplo, se utilizó una / 6-TTA plásmido Dlx5 para activar la expresión de transgenes teto inducibles. En estos experimentos, hemos sido capaces de silenciar la expresión del transgén mediante la administración de doxiciclina 8. Actualmente estamos desarrollando un protocolo para utilizar la técnica en combinación con el sistema de CREER.
Pasos críticos en el Protocolo
Para lograr la electroporación y la supervivencia eficiente, trate de evitar excesive la manipulación de los embriones y / u órganos. Además, evitar pellizcar las arterias y las venas. El ratón se convertirá rápidamente hipovolémico si se presenta sangrado. Una vez finalizada la electroporación, colocar los embriones y órganos en las mismas posiciones donde los encontró para evitar torceduras que crean que podrían causar hipoxia. Trate de 20 min o menos tiempo de cirugía. La hidratación de la cavidad abdominal con PBS numerosas veces durante la cirugía. Durante la electroporación, trate de perforar el ventrículo solamente una vez con la aguja capilar. Perforación repetitiva disminuirá la tasa de supervivencia. Tras el periodo de formación, la tasa de supervivencia debe ser del 80% o superior.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Estamos muy agradecidos a Lihong Yin para la asistencia técnica. NVD es un destinatario de un Premio al Investigador Joven NARSAD y también es apoyado por subvenciones del NIH (5 K99 MH095825-02). La investigación en el laboratorio Fishell es apoyado por el Instituto Nacional de Salud, Instituto Nacional de Salud Mental (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972 -01A1) y la Fundación Simons.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5 mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
References
- Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).
- Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis. J Neurosci. 23, 167-174 (2003).
- Eisenstat, D. D., et al. DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation. J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).
- Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors. J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).
- Bulfone, A., et al. The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos. Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).
- Bulfone, A., et al. Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries. J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).
- Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain. The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).
- Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472, 351-355 (2011).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239 (2007).
