Abstract
L'étude de système nerveux central (SNC) maturation repose sur le ciblage génétique des populations neuronales. Cependant, la tâche de restreindre l'expression de gènes d'intérêt à sous-types neuronaux spécifiques s'est avérée remarquablement difficile en raison de la rareté relative des éléments spécifiques de promoteurs. Interneurones GABAergiques constituent une population neuronale avec une grande diversité morphologique et génétique. En effet, plus de 11 sous-types différents d'interneurones GABAergiques ont été caractérisées dans le cortex de souris 1. Nous présentons ici un protocole adapté pour le ciblage sélectif des populations GABAergiques. Nous avons obtenu un ciblage sélectif de sous-type des interneurones GABAergiques en utilisant l'élément activateur de la transcription à homéoboîte facteurs Dlx5 et Dlx6, des homologues de la moins distale (Dll) gène Drosophila 2,3, pour entraîner l'expression de gènes spécifiques par le biais électroporation in utero.
Introduction
La majeure partie des interneurones GABAergiques corticaux proviennent de deux structures embryonnaires transitoires nommés les éminences ganglionnaires médianes et caudales (MGE et CGE respectivement) 4. Parvalbumine et la somatostatine exprimer interneurones proviennent de la MGE alors Calretinin (Cr), Vasointestinal peptide (VIP) et Reelin (Re) exprimant interneurones proviennent de la CGE. Ces sous-types interneurones peuvent être distingués par leur date de naissance. MGE sous-types dérivés sont nés entre le jour embryonnaire 9.5 (de E9.5) et E16,5 5,6. En revanche, les interneurones CGE dérivés sont nés de E12.5 par a 18,5 avec leur production culminant à E15.5 6. Le ciblage génétique de cette population née fin, cependant, reste insaisissable.
Les distale moins (Dlx) gènes murins sont exclusivement exprimés dans le cerveau antérieur ventral développement 3. Interneurones GABAergiques et les neurones de projection du striatum mais cellules pyramidales corticales pas exprimer Dlx1, 2,5, et 6 gènes à des stades de développement précoces 3. En effet, les gènes Dlx sont exprimés dans la zone sous-ventriculaire MGE et CGE (SVZ) dans tous les progéniteurs GABAergiques. L'expression de ces gènes se limite à sélectionner les sous-types de stades post-mitotiques 9.7. Preuves expérimentales antérieures ont montré que l'élément Dlx5 / 6 activateur permet le ciblage sélectif de lignées GABAergiques dans des modèles de souris transgéniques 2. Nous avons testé l'utilisation de l'un de ces éléments amplificateurs dans le contexte de l'expression épisomique dans le cerveau de souris en développement. Nous avons cloné sous l'élément Dlx5 / 6 amplificatrice avec un promoteur minimal et la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) dans un bluescript (BS) squelette plasmidique (Figure 1). Nous avons introduit le plasmide au moyen d'électroporation in utero à E15.5 pour cibler sélectivement Cr, VIP et sous-types République 3,8,10. Notre technique permet clairsemée électroporation, ce qui facilitela reconstruction des caractéristiques morphologiques des cellules de singe. En outre, les niveaux exceptionnellement élevés d'expression de gènes dans les neurones corticaux GABAergiques permet pour des études fonctionnelles. Nous avons effectué la perte et le gain d'études de fonction à l'aide de plusieurs gènes de type sauvage et négatifs dominants 11.
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Protocol
Tous les animaux ont été traités en conformité avec les règlements et les directives du soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de la NYU School of Medicine.
Les souches de souris
Webster souris femelles suisses fournies par TACONIC ont été utilisés pour ces expériences. Afin de cibler spécifiquement les interneurones de la couche superficielle, embryons E15.5 ont été utilisés.
Remarque: Le plasmide utilisé dans ce travail (Dlx5 / 6.eGFP plasmide 3 ug / ul) ont été générés en utilisant des techniques de clonage standard. L'ADNc de eGFP a été clone dans un Dlx5 / Pmin-6-polyA plasmide. Ce plasmide est disponible sur demande (demarn02@nyumc.org).
1 Préparation de microinjection Pipettes
- Définir l'extracteur de chaleur # 2-860.
- Placer et fixer le capillaire de verre près du filament. Vérifiez que le diamètre extérieur (OD) de la pipette est d'environ 30 um.
- Appuyez sur le bouton "tirer".
- Retirez délicatement le capillaire. La partie inférieure est l'aiguille. Jeter la partie supérieure.
2. Procédure anesthésie
- Préparer une chambre d'isoflurane contenant. Remarque: L'isoflurane est l'anesthésique privilégié en raison de son action rapide et une faible incidence d'effets secondaires. Pentobarbital est une autre option; cependant, la tolérance de ce médicament est variable et peut conduire à un taux de mortalité supérieur à l'isoflurane.
- Régler le débit de l'isoflurane à 4-5% dans 0,5-1 L / min O 2.
- Assurez-vous que la valve de la chambre est ouverte alors que la vanne de l'adaptateur de tête est fermé.
- Placez la souris enceinte dans la chambre.
- Laissez la souris pour aller sous l'effet de l'anesthésie. Cela prendra environ 2-3 min. Vérifiez le taux de respiration. Si la souris commence hyperventilation, réduire la dose d'isoflurane.
- Après la souris est anesthésiée, retirez rapidement à partir de la chambre. Placez-le face ventrale sur le coussin chauffant et insert la tête dans le masque qui va continuer à fournir de l'isoflurane dans toute la chirurgie. Assurez-vous de passer le flux d'isoflurane de la chambre à la tubulure reliant le morceau d'adaptateur de tête. Mettre une goutte de lubrifiant oculaire dans chaque œil et fermez les yeux.
- Régler le coussin chauffant à 36 ° degrés C pour réduire au minimum l'hypothermie.
- Vérifier l'absence de réflexes du pied et de la queue en pinçant les pattes arrière et la queue.
3. chirurgie
- Nettoyer la peau qui recouvre l'abdomen avec 70% d'éthanol.
- Utilisez une pince pour tirer la peau vers le haut. Après chaque intervention, laver tous les instruments avec du détergent et de l'eau, et stérilisé à 72 ° CO / N.
- Faire une petite incision verticale (environ 2 cm) le long de la ligne médiane de départ à mi-chemin entre les troisième et quatrième paires de glandes mammaires. Utilisez des ciseaux fins de chirurgie. Prenez soin de ne pas endommager la paroi abdominale.
- Séparer la peau de la douceur péritoine.
- Visualiser les artèreset les veines sur la paroi abdominale. Faire une autre incision verticale de 2 cm à travers le péritoine (en évitant les vaisseaux) pour exposer la cavité abdominale.
- Serrer la peau et la paroi abdominale de chaque côté en évitant le serrage des artères. Remarque: Si les artères sont accidentellement percés, sacrifier immédiatement l'animal en effectuant dislocation cervicale ou surdosage d'isoflurane.
- Pré chauffer la PBS stérile à 37 ° C. Couvrir les colliers avec du PBS humides Kim lingettes.
- Hydrater la cavité abdominale exposée avec du PBS. Répétez cette étape plusieurs fois pendant la chirurgie.
- En utilisant des pinces rondes, tirez doucement sur la chaîne embryonnaire (E15.5) de la cavité. Laissez la chaîne reste sur les lingettes humides. Commencer par exposition de la moitié de la première utérus. Une fois que les embryons qui s'y trouvent sont électroporation, le ramener à l'intérieur, puis de travailler sur le second semestre.
4. électroporation
- Continuer à utiliser des forceps rondes de manipuler les embryons.
- Visualize les ventricules latéraux. Les ventricules latéraux courent le long de la ligne médiane (figure 1b).
- Ajouter vert Fast (stock: 10% p / v) de la solution d'ADN pour un mélange 01:20 de visualiser pendant l'injection. Préparer la solution d'ADN par dissolution du culot obtenu à partir d'un protocole de purification maxi-prep standard dans de l'eau distillée.
- Utilisation micropipettes pré tirés avec un piston pour injecter 1 ml de solution d'ADN (Dlx5 / 6-eGFP, 3 ug / ul) avec Fast Green. Couper l'extrémité de la micropipette avec une pince amende # 5 (Dumont) de laisser 6 mm de longueur à partir du début de l'épaule à l'extrémité de la pointe de l'aiguille avant de charger la pipette. Maintenir la tête de l'embryon avec des pincettes rondes. Entrez le cerveau avec la pipette à un angle de 45 ° en visant le ventricule latéral situé à proximité de la ligne médiane. Si l'aiguille pénètre dans le ventricule, se rétracter lentement la pipette que vous utilisez le piston pour injecter l'ADN. Le ventricule doit devenir vert lorsque lesolution commence à le remplir. À ce stade, arrêter de bouger la pipette et injecter 1 ml d'ADN. Doucement, retirer la pipette.
- Réglez le électroporateur de CUY21 cinq 45V impulsions de 50 ms espacées de 950 ms.
- Utilisez 5 mm électrodes des palettes pour les embryons de E15.5. Plonger les électrodes dans du PBS pour assurer une transmission efficace du courant.
- Placer les palettes d'électrodes autour de la tête de l'embryon de la palette sur le ventricule positif contenant la solution d'ADN. Baisser légèrement la palette positif en ce qui concerne la négative à créer un courant ventral par les éminences ganglionnaires. Cette manipulation permet de minimiser l'expression ectopique dans les cellules pyramidales.
- Après avoir placé les électrodes, délivrer une impulsion en appuyant sur la pédale de fois.
- Retirez les électrodes et essuyez-les. Répéter les étapes 4.6 à 4.9 de chaque embryon.
- Après électroporation tous les embryons, verser 3 ml de PBS dans la cavité abdominale et les retourner à la cavité abdominale.
- Première suture la paroi abdominale avec une aiguille courbe et 5-0 suture de soie et la peau. Appliquer la lidocaïne (4%) sur la plaie. Administrer 120 mg / kg de l'aspirine péritoine intra pour l'analgésie.
Remarque: L'ensemble de la procédure doit être effectuée en 20 minutes ou moins. Il est recommandé que les débutants ne électroporer quelques embryons de garder le temps de fonctionnement court. Chirurgies prolongé diminue le taux de survie des embryons. - Retirer l'animal de la tubulure d'anesthésie et permet la récupération sur le coussin chauffant sur un papier chiffon.
- Animaux Retour à la cage, le garder sur le coussin chauffant à 37 ° C et de surveiller l'état de santé. Les animaux tolèrent généralement la chirurgie bien et commencent à se déplacer lentement peu de temps après leur retrait de la tubulure de l'anesthésie. Si le saignement excessif ou de la léthargie est observé, sacrifier l'animal immédiatement en effectuant IACUC approuvé les procédures d'euthanasie tels que la dislocation cervicale ou surdosage d'anesthésie.
- Cage Retour à la soutenancerium. Les femelles donnent naissance naturellement.
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Representative Results
Nous avons adapté la technique d'électroporation in utero pour atteindre type de cellule ciblage spécifique des neurones échéance. Pour conduire l'expression de eGFP dans les interneurones CGE dérivés, nous avons utilisé l'élément amplificateur de Dlx5 / 6 et limité nos injections à E15.5, la scène où la majorité des interneurones CGE dérivés sont générés. Nous avons effectué l'analyse à P8 et P15 11 (figures 1 et 2). Nous avons confirmé l'origine ventrale de neurones électroporation par co électroporation une CAG-mCherry et un DLX5 plasmides / 6 eGFP à des concentrations équimolaires à E15.5. Dans cette expérience, nous avons observé que seuls les progéniteurs ventraux situés dans la zone sous-ventriculaire co (SVZ) ont exprimé deux protéines 11. Cette expression spatio-temporelle des protéines fluorescentes coïncide avec l'expression normale du développement de la Dlx5 et 6 gènes, qui ne sont pas exprimés dans le ventricule mais subventriculier zone 4. En outre, nous avons évalué l'identité des interneurones GABAergiques Dlx5 / 6 mCherry électroporation en ligne Knockin souris GAÜ67-eGFP. Nous avons constaté que la très grande majorité des neurones électroporation exprimé GAD67, une enzyme exprimée par les cellules 11 GABAergiques. En outre, nous avons déterminé l'identité du sous-type d'interneurones électroporation en effectuant immunohistochimie et analyse électrophysiologique au P15. Le motif de l'expression de marqueurs spécifiques des sous-types a été révélé par immunofluorescence dans des coupes au cryostat 11 (figure 2). Nous avons constaté que les interneurones électroporation à E15.5 expriment presque exclusivement NPY, Reelin, VIP et Cr, décrit précédemment marqueurs des interneurones CGE dérivés 6. En outre, les propriétés électrophysiologiques intrinsèques de ces neurones sont en accord avec celui décrit précédemment dans les études de cartographie de 6,11 sort. Tous ensemble, ces résultats indiquent que electroporation avec l'élément Dlx5 / 6 amplificateur à E15.5 cibler sélectivement les sous-types des interneurones CGE dérivés.
Figure 1 Représentation schématique des expériences d'électroporation. a) Sous-clonage stratégie pour la Dlx5 / 6-eGFP plasmide. b) Schéma illustrant la stratégie expérimentale.
Figure 2 électroporation interneurones sont délimitées par l'expression de marqueurs de sous-type CGE dérivés. A) interneurones EGC dérivés électroporation avec un Dlx5 / 6-eGFP plasmide. Notez l'électroporation clairsemée de sous-types CGE diverses. B) Un des interneurones VIP exprimant à P8. expression eGFP définit letotalité de l'arbre dendritique et axonale tonnelle de neurones individuels. C) Une des interneurones NPY exprimant à P8. Expression de NPY délimite cellules neurogliaform. D) Un interneurones NPY exprimant à P15. La barre d'échelle A, 100 mm; BD, 50 mm
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Discussion
Limites de la technique
Bien que cette technique permet l'analyse de cellule autonome de processus cellulaires, il n'est pas adapté à l'analyse de la population. Les électroporations sont très rares avec moins d'un millier de cellules par électroporation par le cerveau. En conséquence, la technique ne peut pas être utilisé pour évaluer les conséquences sur le comportement résultant de la manipulation génétique des interneurones CGE dérivés.
Bien électroporations effectuées à des sous-types de cible E13.5 E14.5-MGE dérivés, le rendement est faible 10. Nous supposons que la Dlx5 / 6 activateur est moins actif dans des sous-types de post-mitotiques MGE au moins dans le contexte de l'expression épisomique.
Significatives par rapport aux méthodes existantes
La technique représente promotion de méthodes d'électroporation auparavant 12,13 pour l'étude des interneurones. En raison de leur rareté relative et de l'embryon ventraleorigine nic, cette population de neurones s'est avérée difficile à cibler. Notre technique fournit les moyens pour mener à bien l'analyse cellulaire autonome des interneurones CGE dérivés. Les niveaux élevés d'expression de eGFP permettent la visualisation et l'analyse des interneurones simples.
Applications futures
En combinant l'utilisation de plasmides spécifiques et des lignées de souris génétiquement modifiées, il est possible d'obtenir un contrôle spatial et temporel de l'expression de gènes d'intérêt. Par exemple, nous avons utilisé un Dlx5 / 6 Tta plasmide d'activer l'expression de transgènes tetO inductibles. Dans ces expériences, nous avons pu réduire au silence l'expression du transgène par l'administration de doxycycline 8. Nous développons actuellement un protocole à utiliser la technique en combinaison avec le système CREER.
Étapes critiques dans le protocole
Pour atteindre l'électroporation et la survie efficace, essayez d'éviter les excesSive manipulation des embryons et / ou des organes. En outre, éviter de pincer les artères et les veines. La souris deviendra rapidement hypovolémique si le saignement se produit. Après l'électroporation est terminé, placer les embryons et les organes dans les mêmes positions où vous les avez trouvés à éviter de créer des plis qui pourraient entraîner une hypoxie. Visez 20 minutes ou moins de temps de chirurgie. Hydrater la cavité abdominale avec du PBS à de nombreuses reprises au cours de la chirurgie. Au cours de l'électroporation, essayer de percer le ventricule seule fois avec l'aiguille capillaire. Poinçonnage répétitif va diminuer le taux de survie. Après la période d'entraînement, le taux de survie devrait être de 80% ou plus.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à Lihong Yin pour l'assistance technique. NVD est récipiendaire d'un Prix du jeune chercheur NARSAD et est également soutenu par des subventions du NIH (5 K99 MH095825-02). La recherche dans le laboratoire Fishell est soutenu par l'Institut national de la santé, Institut national de santé mentale (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), l'Institut national des troubles neurologiques et des maladies (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972 -01A1) et la Fondation Simons.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5 mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
References
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