Abstract
Studiet av det centrala nervsystemet (CNS) mognad bygger på genetisk målinriktning av neuronala populationer. Dock har till uppgift att begränsa uttrycket av gener av intresse för specifika neuronala subtyper visat anmärkningsvärt utmanande på grund av den relativa bristen på specifika promotorelement. GABAerga intern utgör en neuronal population med omfattande genetiska och morfologiska mångfalden. I själva verket har mer än 11 olika subtyper av GABAergic interneuronen karakteriserats i musen cortex 1. Här presenterar vi ett anpassat protokoll för selektiv målinriktning av GABAergiska populationer. Vi uppnådde subtyp selektiv målinriktning av GABAerga intern med hjälp av förstärkarelementet av homeobox transkriptionsfaktorer Dlx5 och Dlx6, homologer av Drosophila distala lösa (Dll) gen 2,3, för att driva uttrycket av specifika gener genom i livmodern elektroporering.
Introduction
Merparten av kortikala GABAerga intern kommer från två gående embryonala strukturer heter de mediala och stjärt ganglieblockerande höjder (MGE och CGE respektive) 4. Parvalbumin och somatostatin uttrycka interneuronen sitt ursprung i MGE medan Calretinin (Cr), Vasointestinal peptid (VIP) och Reelin (Re) som uttrycker intern kommer från CGE. Dessa Intern subtyper kan särskiljas genom deras födelsedatum. MGE härledda subtyper föds mellan embryonala dag 9,5 (E9.5) och E16.5 5,6. Däremot är CGE härledda intern födda från E12.5 genom e18.5 med sin produktion topp på E15.5 6. Den genetiska rikta denna sena födda befolkningen är dock fortfarande svårfångade.
De murina distal-minus (Dlx) generna uteslutande uttrycks i utvecklingsventrala framhjärnan 3. GABAerga intern och striatala projektions neuroner men inte kortikala pyramidala celler uttrycker Dlx1, 2,5 och 6 gener i tidiga utvecklingsstadier 3. I själva verket är de Dlx gener uttrycks i MGE och CGE subventrikulära zonen (SVZ) i alla GABAergic gångare. Uttryck av dessa gener blir begränsad till att välja subtyper vid postmitotiska stegen 7-9. Tidigare experimentella bevis visade att Dlx5 / 6 förstärkarelement möjliggör selektiv målinriktning av GABAerga härstamningar i transgena musmodeller 2. Vi testade att använda en av dessa enhancerelementen inom ramen för episomala uttryck i utvecklings mushjärna. Vi underklonades den Dlx5 / 6 förstärkarelement tillsammans med en minimal promotor och den förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) i en Bluescript (BS) ryggrad plasmiden (Figur 1). Vi introducerade plasmiden med hjälp av i livmodern elektroporering vid E15.5 att selektivt rikta Cr, VIP och Re- subtyper 3,8,10. Vår teknik möjliggör glesa elektroporering, vilket underlättaråteruppbyggnaden av morfologiska egenskaper hos singe celler. Dessutom de exceptionellt höga nivåer av genuttryck i hjärnbarken GABAerga neuroner möjliggör funktionella studier. Vi genomförde förlust och vinst på funktionsstudier med flera vildtyp och dominanta negativa gener 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djuren behandlas i enlighet med de regler och riktlinjer för Institutional Animal Care och användning kommittén för NYU School of Medicine.
Musstammar
Schweiziska Webster-honmöss från Taconic användes för dessa experiment. För att särskilt inrikta ytliga skikt interneuroner var E15.5 embryon används.
Obs: Den plasmid som används i detta arbete (Dlx5 / 6.eGFP plasmid 3 mikrogram / l) genererades med hjälp av standardkloningstekniker. Den EGFP cDNA klonades i en Dlx5 / 6-Pmin-polyA plasmid. Denna plasmid är tillgänglig på begäran (demarn02@nyumc.org).
1 Beredning av mikroinjektion pipetter
- Ställ avdragare Heat # 2-860.
- Placera och säkra glaskapillär nära glödtråden. Kontrollera att den yttre diametern (OD) av pipetten är ungefär 30 | im.
- Tryck på "pull"-knappen.
- Ta försiktigt bort kapillär. Den nedre delen är nålen. Kassera den övre delen.
2. Anesthesia Procedur
- Förbered en isofluran innehållande kammare. OBS: Isofluran är den föredragna bedövningsmedel på grund av dess snabba åtgärder och låg förekomst av biverkningar. Pentobarbital är ett annat alternativ; emellertid är tolerans av denna drog variabel och kan leda till en högre dödlighet än isofluran.
- Ställ in flödet av isofluran till 4-5% under 0,5-1 l / min O2.
- Se till att ventilen för kammaren är öppen medan ventilen för huvudadaptern är stängd.
- Placera gravid mus i kammaren.
- Låt musen för att gå under effekten av anestesi. Detta kommer att ta ca 2-3 min. Kontrollera andning. Om musen börjar hyperventilera, sänka dosen av isofluran.
- När musen är nedsövd, genast ta bort den från kammaren. Placera den ventrala sidan upp på värmedyna och jagnsert huvudet i masken som kommer att fortsätta att leverera isofluran under hela operationen. Se till att stänga av flödet av isofluran från kammaren till slangen som förbinder huvudsadapterstycket. Lägg en droppe ögon smörjmedel i varje öga och stäng ögonen.
- Ställ in värmedynan till 36 ° C grader för att minimera hypotermi.
- Kontrollera med avseende på frånvaro av mul-och stjärt reflexer genom att nypa de bakre tassarna och svansen.
3. Kirurgi
- Rengör huden som täcker buken med 70% etanol.
- Använd pincett för att dra huden uppåt. Efter varje operation, tvätta alla instrument med diskmedel och vatten, och steriliseras vid 72 ° CO / N.
- Gör ett litet vertikalt snitt (ca 2 cm) längs mittlinjen börjar halvvägs mellan den tredje och fjärde par av bröstkörtlar. Använd fina kirurgi sax. Var noga med att inte skada bukväggen.
- Försiktigt separera huden från bukhinnan.
- Visualisera artärernaoch vener på bukväggen. Gör ytterligare 2 cm vertikalt snitt genom bukhinnan (undvika de fartyg) att exponera bukhålan.
- Kläm huden och bukväggen på varje sida att undvika kläm artärerna. OBS: Om artärerna är oavsiktligt punkteras, offra djuret omedelbart genom att utföra halsdislokation eller isofluran överdos.
- Pre värma steril PBS till 37 ° C. Täck klämmorna med PBS fuktiga Kim våtservetter.
- Återfukta den exponerade bukhålan med PBS. Upprepa detta steg flera gånger när de utför operationen.
- Med hjälp av runda pincett, dra försiktigt embryonala kedjan (E15.5) från hålrummet. Låt kedjan vila på våtservetter. Starta genom att exponera en halv av livmodern först. När embryona i det är electroporated, föra den tillbaka in, sedan arbeta på den andra halvan.
4. Elektroporation
- Fortsätt att använda runda pincett för att manipulera embryon.
- Vi-sualize de laterala ventriklarna. De laterala ventriklarna löper längs mittlinjen (figur 1b).
- Lägg Snabb Grönt (lager: 10% vikt / volym) till DNA-lösningen till en 01:20 blandning för att visualisera det under injektionen. Förbered DNA-lösning genom att lösa upp pelleten erhållen från ett standard maxi-prep reningsprotokoll i destillerat vatten.
- Använd pre drog mikropipetter med kolven för att injicera 1 ml DNA-lösning (Dlx5 / 6-eGFP, 3 mikrogram / l) med snabb Green. Skär spetsen på mikropipett med en fin forcep # 5 (Dumont) att lämna 6 mm längd från början av axeln till slutet av nålspetsen innan du lägger pipetten. Håll huvudet av embryot med runda pincett. Ange hjärnan med pipett i 45 ° vinkel siktar på den laterala ventrikeln ligger nära mittlinjen. Om nålen tränger igenom ventrikeln, långsamt dra tillbaka pipetten när du använder kolven för att injicera DNA. Den ventrikeln ska bli grön närLösningen börjar fylla den. Vid denna punkt, sluta flytta pipetten och injicera 1 ml av DNA. Försiktigt, återkalla pipetten.
- Ställ CUY21 elektroporator till fem 45V pulser om 50 msek åtskilda med 950 msek.
- Använd 5 mm paddla elektroder för E15.5 embryon. Doppa elektroderna i PBS för att säkerställa en effektiv strömöverföring.
- Placera elektrod paddlar runt embryot huvud med den positiva paddeln på kammaren som innehåller DNA-lösningen. Något sänka positiva paddeln med avseende på negativ för att skapa en ventrala ström genom ganglieblockerande höjder. Denna manipulation kommer att minimera ektopiskt uttryck i pyramidala celler.
- Efter placering av elektroderna, leverera en puls genom att trycka ned fotpedalen en gång.
- Ta bort elektroderna och torka dem rena. Upprepa steg 4,6-4,9 med varje embryo.
- Efter electroporating alla embryon, häll 3 ml PBS i bukhålan och returnera dem till bukhålan.
- Första sutur bukväggen med en böjd nål och 5-0 silke sutur och sedan huden. Applicera Lidokain (4%) på såret. Administrera 120 mg / kg av Aspirin intra bukhinnan för smärtlindring.
Anmärkning: Hela förfarandet bör utföras i 20 min eller mindre. Det är tillrådligt att nybörjare bara electroporate några embryon för att hålla drifttiden kort. Långvarig operationer kommer att minska överlevnaden av embryona. - Ta djuret ur narkosen slangen och möjlighet till återhämtning på värmedyna på ett papper torka.
- Återgå djur till buren, hålla den på värmedyna vid 37 ° C och övervaka hälsotillståndet. Djuren tål generellt operationen väl och börjar röra sig långsamt snart efter att de tas bort från anestesi slangen. Om kraftig blödning eller letargi observeras, offra djuret omedelbart genom att utföra IACUC godkänd dödshjälp procedurer såsom halsdislokation eller anestesi överdos.
- Återgå bur till vivarium. Honorna ska föda naturligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi anpassade i livmodern elektroporering teknik för att uppnå celltyp särskild inriktning på förfall nervceller. För att driva uttrycket av eGFP i CGE-härledda intern använde vi Dlx5 / 6 förstärkarelement och begränsade våra injektioner till E15.5, det stadium när majoriteten av CGE-härledda intern genereras. Vi genomförde analysen på P8 och P15 11 (figur 1 och 2). Vi bekräftade den ventrala ursprung elektroporerade nervceller genom sam electroporating en CAG-mCherry och ett Dlx5 / 6-EGFP plasmider vid ekvimolära koncentrationer vid E15.5. I detta experiment observerade vi att endast ventrala gångare ligger i subventrikulära zonen (SVZ) co uttryckte båda proteinerna 11. Denna spatio tids uttryck av fluorescerande proteiner sammanfaller med den normala utvecklingsuttryck av Dlx5 och 6 gener, som inte uttrycks i den ventrikulära men subventricular zon 4. Dessutom bedömde vi att GABAergic identitet Dlx5 / 6-mCherry elektroporerade interneuronen i en GAD67-eGFP knockin mus linje. Vi fann att de allra flesta elektroporerade nervceller uttryckte GAD67, ett enzym som uttrycks av alla GABAergic celler 11. Dessutom bestämde vi subtyp identitet elektroporerade intern genom att utföra immunohistokemi och elektrofysiologiska analyser på P15. Mönstret för uttrycket av subtyp specifika markörer avslöjades av immunofluorescens i kryostatsnitt 11 (Figur 2). Vi fann att intern elektroporerade vid E15.5 nästan uteslutande uttrycka NPY, Reelin, VIP och Cr, tidigare beskrivna CGE-härledda Intern 6 markörer. Dessutom inneboende elektrofysiologiska egenskaperna hos dessa neuroner är i överensstämmelse med den som tidigare beskrivits i öde kartläggningsstudier 6,11. Sammantaget indikerar dessa resultat att electroporation med Dlx5 / 6 förstärkarelementet vid E15.5 selektivt rikta CGE-härledda Intern subtyper.
Figur 1 Schematisk representation av de elektroporeringsexperiment. a) Subkloning strategi för Dlx5 / 6-EGFP plasmid. b) Diagram som illustrerar den experimentella strategin.
Figur 2 elektroporerade intern avgränsas av uttrycket av CGE-härledda subtyp markörer. A) CGE härledda intemeuroner electroporated med en Dlx5 / 6-EGFP-plasmiden. Notera den glesa elektroporering av olika CGE subtyper. B) En VIP-uttryckIntern på P8. EGFP expression delineatesHela dentritic träd och axonal berså av enstaka nervceller. C) En NPY-uttryckIntern på P8. NPY uttryck skisserar neurogliaform celler. D) En NPY-uttryckIntern på P15. Skala bar A, 100 mm; BD, 50 mm
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TEKNISKA BEGRÄNSNINGAR
Även denna teknik möjliggör cell självständig analys av cellprocesser, är det inte lämpligt för befolkningsanalys. De electroporations är mycket gles med mindre än tusen celler elektroporerade per hjärnan. Som en följd kan tekniken inte användas för att bedöma beteendemässiga konsekvenserna av genmanipulation av CGE-härledda intern.
Medan elektroporeringar utförs vid E13.5-E14.5 mål MGE-härledda subtyper är effektiviteten låg 10. Vi spekulerar att Dlx5 / 6 förstärkare är mindre aktiv i postmitotiska MGE subtyper åtminstone inom ramen för episomal uttryck.
Betydelse i förhållande till befintliga metoder
Tekniken innebär avancemang från tidigare elektroporation metoder 12,13 för att studera intern. På grund av deras relativa knapphet och ventrala embryonic ursprung, har denna population av neuroner visat sig svårt att nå. Vår teknik ger möjlighet att utföra cellautonoma analys av CGE-härledda intern. De höga nivåerna av EGFP expression möjliggöra visualisering och analys av enstaka intemeuroner.
Framtida Applications
Genom att kombinera användningen av specifika plasmider och genetiskt modifierade mus linjer är det möjligt att uppnå temporal och spatial kontroll av expressionen av gener av intresse. Till exempel använde vi en Dlx5 / 6-Tta plasmid för att slå på uttrycket av Teto inducerbara transgener. I dessa experiment kunde vi tysta transgenexpression genom att administrera doxycyklin 8. Vi håller på att utveckla ett protokoll för att använda tekniken i kombination med CreER systemet.
Kritiska steg i protokollet
För att uppnå en effektiv elektroporering och överlevnad, försök att undvika excestande manipulation av embryon och / eller organ. Dessutom inte klämmer artärer och vener. Musen kommer snabbt bli hypovolemiska om blödning uppstår. Efter elektroporering är klar, placera embryon och organ i samma positioner där du hittade dem att undvika att skapa veck som kan orsaka syrebrist. Sikta i 20 minuter eller mindre operation tid. Fukta bukhålan med PBS flera gånger under operationen. Under elektroporering, försök att punktera ventrikeln endast en gång med kapillär nålen. Repetitiva punktering minskar överlevnaden. Efter utbildningsperioden, bör överlevnaden vara 80% eller högre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för Lihong Yin för tekniskt stöd. NVD är mottagare av ett NARSAD Young Investigator Award och stöds också av anslag från NIH (5 K99 MH095825-02). Forskning i Fishell labbet stöds av National Institute of Health, National Institute of Mental Health (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), National Institute of neurologiska sjukdomar och stroke (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972 -01A1) och Simons Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5 mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
References
- Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).
- Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis. J Neurosci. 23, 167-174 (2003).
- Eisenstat, D. D., et al. DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation. J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).
- Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors. J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).
- Bulfone, A., et al. The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos. Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).
- Bulfone, A., et al. Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries. J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).
- Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain. The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).
- Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472, 351-355 (2011).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239 (2007).
