Abstract
Merkezi sinir sistemi (CNS) olgunlaşma çalışma sinirsel genetik hedefleme dayanır. Bununla birlikte, özel nöron alt tiplerine ilgi genlerinin ekspresyonunu kısıtlama görev nedeniyle spesifik promoter elementlerinin nispeten kıt olması oldukça zor olduğu kanıtlanmıştır. GABA'erjik internöron geniş genetik ve morfolojik çeşitliliği olan bir nöronal nüfus oluşturmaktadır. Gerçekten de, GABAerjik internöron fazla 11 farklı alt tipi fare korteksi 1 ile karakterize edilmiştir. Burada GABAerjik nüfus seçici hedefleme için uyarlanmış bir protokol mevcut. Bu homeobox transkripsiyon enhanser elemanını kullanarak, GABAerjik internöron alt tip seçici olarak hedeflenmesini elde utero elektroporasyon spesifik genlerin ekspresyonunu ile sürücü ve Dlx5 Dlx6, Drosophila uzak-az (DLL) geni 2,3 homologlarını, faktörüdür.
Introduction
Kortikal GABAerjik internöronlar toplu medial ve kaudal ganglion eminences (sırasıyla MGE ve JMO) adında iki geçici embriyonik yapılarından kaynaklanan 4. Parvalbumin ve somatostatin ifade internöron internöron JMO'ya kaynaklanan ifade Kalretinin ise MGE (Cr), Vasointestinal peptid (VIP) ve Reelin (Re) köken. Bu interneuron alt tipler kendi doğum günlerinin ile ayırt edilebilir. MGE türetilmiş alt tipler embriyonik gün 9.5 (E9.5) ve e16.5 5,6 arasında doğarlar. Buna karşılık, JMO türetilmiş internöron üretim E15.5 6 seviyesinde zirve ile E18.5 yoluyla E12.5 doğar. Bu geç doğdu nüfusun genetik hedefleme, ancak, zor kalır.
Kemirgen distal-az (Dlx) genler sadece gelişmekte olan ventral önbeyin 3 olarak ifade edilmiştir. GABAerjik internöron ve striatum projeksiyon nöronları değil, kortikal piramidal hücreleri Dlx1 ifade, Erken gelişim evrelerinde 3 de 2,5, ve 6 genler. Gerçekten de, dlx genlerinin hepsi GABA'erjik atalarda MGE ve CGE subventricular (SVZ'una) olarak ifade edilmiştir. Bu genlerin sentezlenmesi postmitotik aşamalarında 7-9 de alt tiplerini belirlemek için kısıtlanır. Önceki deneysel kanıtlar Dlx5 / 6 arttırıcı bir eleman transgenik fare modellerinde 2 GABAerjik soy seçici hedefleme için izin verdiğini gösterdi. Bu, gelişmekte olan fare beyin epizomal ifade bağlamında bu zenginleştirici elemanların birinin kullanılmasını test edilmiştir. Bir minimal promotör ve Bluescript (BS) omurga plasmid olarak gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) (Şekil 1) ile birlikte Dlx5 / 6 güçlendirici elemanın alt klonlandı. Burada özellikle Cr, VIP hedef E15.5 rahimde elektroporasyon suretiyle plazmid tanıtıldı ve Yeniden 3,8,10 alt tip. Bizim teknik kolaylaştırır seyrek elektroporasyon, sağlarateşten hücrelerin morfolojik özellikleri yeniden. Buna ek olarak, kortikal nöronlarda GABAerjik gen ekspresyonu son derece yüksek seviyelerde fonksiyonel çalışmalarda da sağlar. Biz kaybı ve çeşitli yabani tip ve dominant negatif genler 11 ile fonksiyon testleri kazancını gerçekleştirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvanlar Tıp NYU Okulu Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu yönetmelik ve yönergelere uygun olarak tedavi edildi.
Fare Suşlar
Taconic tarafından sağlanan İsviçre Webster dişi farelerine, bu deneylerde kullanıldı. Özellikle yüzeysel katman hedef nöronları için, embriyolar E15.5 kullanılmıştır.
Not: standart klonlama teknikleri kullanılarak elde edilen bu çalışma (Dlx5 / 6.eGFP plazmid 3 ug / ml) kullanılan plazmid. EGFP cDNA Dlx5 / 6-Pmin-Poli A plazmidi içine klonlandı. Bu plazmid istek (demarn02@nyumc.org) üzerine mevcuttur.
Mikroenjeksiyon Pipetler hazırlanması 1.
- 860 çektirmesi Isı 2. ayarlayın.
- Yerleştirin ve filamanın yakın cam kılcal sabitleyin. Pipet dış çapı (OD) kabaca 30 mikron olup olmadığını kontrol edin.
- "Çekme" düğmesine basın.
- Dikkatlice kılcal çıkarın. Taban kısmı, bir iğne. Üst kısmını atın.
2. Anestezi Prosedürü
- Izofluran içeren odayı hazırlayın. Not: İsofluranın nedeniyle hızlı hareket ve yan etki azlığı için tercih edilen anestezi olduğunu. Pentobarbital başka bir seçenektir; Bununla birlikte, bu ilaç tolerans değişkendir ve izofluran daha yüksek bir ölüm oranına neden olabilir.
- 0.5-1 L / dk O 2% 4-5 kadar izofluran akışını ayarlayın.
- Kafa adaptörü için vana kapalı iken odası için vanasının açık olduğundan emin olun.
- Odacık içinde hamile fare yerleştirin.
- Fare anestezi etkisi altında gitmek için izin verin. Bu yaklaşık 2-3 dakika sürer. Solunum hızını kontrol edin. Fare ım başlarsa, izofluran dozunu.
- Fare anestezi sonra derhal, bölmeden çıkarın. Isıtma yastığı ventral tarafta yerleştirin ve iameliyat boyunca izofluran tedarik etmeye devam edecek maskesi kafasını nsert. Kafa adaptörü bağlantı parçasını boru odacıktan izofluran akışını değiştirmek için emin olun. Her gözün göz yağlayıcı bir damla koyun ve gözlerinizi kapatın.
- Hipotermi en aza indirmek için 36 ° C dereceye ısıtma yastığı ayarlayın.
- Arka pençeleri ve kuyruk kısma ayak ve kuyruk reflekslerin yokluğu kontrol edin.
3. Cerrahi
- % 70 etanol ile karın kapsayan cildi temizlemek.
- Yukarı cilt çekmek için forseps kullanabilir. Her ameliyat sonrası, deterjan ve su ile tüm enstrümanları yıkayın ve 72 ° CO / N sterilize.
- Meme bezlerinin üçüncü ve dördüncü çiftleri arasındaki yarıda başlayan orta hat boyunca küçük bir düşey kesi (yaklaşık 2 cm) olun. Ince cerrahi makas kullanın. Karın duvarına zarar değil dikkat edin.
- Yavaşça periton cilt ayırmak.
- Arterleri görselleştirmekve karın duvarı üzerinde damarlar. Karın boşluğuna maruz (damarları kaçınarak) karın zarı aracılığıyla başka bir 2 cm kesi yapın.
- Arterleri sıkma kaçınarak her tarafta deri ve karın duvarı Kelepçe. Not: arterler yanlışlıkla delinirse, servikal çıkık veya izofluran doz aşımı yaparak hayvanı hemen kurban.
- 37 ° C'ye kadar ısınmaya öncesi steril PBS. Kim mendil nemli PBS ile kelepçeleri örtün.
- PBS ile maruz karın boşluğuna nemlendirir. Ameliyat yaparken bu adımı birkaç kez tekrarlayın.
- Yuvarlak forseps kullanarak, yavaşça uzak boşluğundan embriyonik zinciri (E15.5) çekin. Islak mendillerin üzerindeki zincir ömür. Birinci rahim yarısını ortaya başlayın. Içinde embriyolar elektroporasyona sonra,, içine geri getirmek ardından ikinci yarıda çalışır.
4. Elektroporasyon
- Embriyolar işlemek için yuvarlak forseps kullanmaya devam edin.
- Viyanal ventriküller sualize. Orta hat (Şekil 1b) boyunca çalıştırın lateral ventriküller.
- Hızlı Yeşil (Stok:% 10 ağ / hac) eklemek için, bir 01:20 karışım için DNA solüsyonuna enjeksiyon sırasında görselleştirmek için. Damıtılmış su içinde standart bir maksi-hazırlık saflaştırma protokolü elde edilen pelet eritilerek DNA solüsyonu hazırlayın.
- Hızlı Yeşil DNA çözeltisi (Dlx5 / 6-eGFP, 3 ug / ml) 1 ml enjekte etmek için bir piston ile önceden çekilmiş mikropipetler kullanın. Pipet yüklemeden önce bir iğne ucunun sonuna omuz başlangıcından 6 mm uzunluk bırakmak için iyi bir forsepsle # 5 (Dumont) ile mikropipet ucu kesilir. Yuvarlak cımbız ile embriyo baş tutun. Orta hat yakınında bulunan lateral ventrikül amaçlayan bir 45 ° açıyla pipet ile beyin girin. İğne ventrikül ile nüfuz Eğer DNA enjekte pistonu kullanabilirsiniz gibi, yavaş yavaş pipet çekin. Ventrikül yeşile ne zamançözüm doldurmak başlar. Bu noktada, pipet hareket durdurmak ve DNA 1 ml enjekte edilir. Yavaşça, pipet çekilme.
- 950 msn ile aralıklı 50 milisaniye beş 45V bakliyat CUY21 elektrogözenekleme ayarlayın.
- E15.5 embriyolar 5 mm raket elektrotları kullanın. Etkili akım iletimi sağlamak için PBS içinde elektrotlar batırın.
- DNA çözümü içeren ventrikül olumlu kürek ile embriyonun başının etrafında elektrot kürekler. Biraz ganglionik tubera ile ventral akım yaratmak için negatif bir saygı ile pozitif raket indirin. Bu manipülasyon piramidal hücrelerinde ektopik ifadesini minimize edecektir.
- Elektrotlar yerleştirerek sonra, bir kez ayak pedalına basarak bir darbe teslim.
- Elektrotları çıkarın ve temiz silin. Tekrar her bir embriyo ile 4,6-4,9 adımları.
- Tüm embriyolar electroporating sonra, karın boşluğuna PBS 3 ml dökün ve karın boşluğunda onları geri.
- Üretim dikiş iğnesi ve kavisli bir 5-0 ipek dikiş ipliği daha sonra deri ile karın duvarı. Yaranın üzerine Lidokain (% 4) uygulayın. Analjezi için Aspirin içi periton 120 mg / kg yönetmek.
Not: Bütün işlem 20 dakika veya daha kısa yapılmalıdır. Bu yeni başlayanlar sadece kısa çalışma süresini tutmak için bir kaç embriyolar electroporate önerilir. Uzun süreli ameliyatlar embriyoların hayatta kalma oranını azaltacaktır. - Anestezi borudan hayvan çıkarın ve bir kağıt üzerinde ısıtma yastığı kurtarma silin sağlar.
- , Kafes hayvan dönün 37 ° C'de ısıtma yastığı üzerinde tutmak ve sağlık durumunu izlemek. Hayvanlar genellikle ameliyat iyi tolere ve anestezi tüp çıkarılır kısa bir süre sonra yavaş yavaş hareket etmeye başlar. Aşırı kanama ya da uyuşukluk görülürse, IACUC gibi servikal dislokasyon veya anestezi doz aşımı gibi ötenazi prosedürleri onaylanmış gerçekleştirerek hemen hayvan kurban.
- Viva kafesi dönrium. Dişiler daha doğum doğal verecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz olgunlaşan nöronların hücre tipi özel hedefleme ulaşmak için utero elektroporasyon tekniği adapte. CGE türevi internöronlarda eGFP ekspresyonunu tahrik etmek için, Dlx5 / 6 güçlendirici eleman ikinci ve E15.5 için enjeksiyon sınırlı aşama CGE türetilmiş internöronlar çoğunluğu oluştuğunda. Biz de P8 analizi gerçekleştirilir ve P15 11 (Şekiller 1 ve 2). Biz E15.5 eşit molar konsantrasyonlarda CAG-mCherry ve Dlx5 / 6-EGFP plazmidler elektropore işbirliği ile elektropore nöronların ventral kaynağını teyit etmiştir. Bu deneyde, subventricular bölgesi (SVZ'una) co bulunan sadece ventral atalarıdır proteinleri de 11 dile görülmektedir. Floresan proteinleri bu uzay temporal ekspresyonunun ancak ventriküler subventr ifade edilmeyen Dlx5 6 genlerin normal gelişim sentezlenmesi ile çakışmaktadıricular bölge 4. Ayrıca, bir GAD67-eGFP knockin fare doğrultusunda Dlx5 / 6-MCherry Electroporated internöronlar GABA'erjik kimliğini değerlendirildi. Bu Electroporated nöronların büyük çoğunluğu GAD67, bütün hücreler GABAerjik 11 ile temsil edilen bir enzimi ortaya bulundu. Ayrıca, P15 de immünohistokimyasını ve elektrofizyolojik analiz yaparak Electroporated internöronlar alt tipi kimliğini belirledi. Alt türüne özgü belirteç ekspresyon paterni kriyostat kesitleri 11 (Şekil 2), bağışıklık fluorışıması ile ortaya çıkarılmıştır. Biz E15.5 elektroporasyona internöron neredeyse sadece NPY Reelin, VIP ve Cr ifade bulundu, daha önce CGE türetilmiş interneuron işaretlerini 6 tanımlamıştır. Ayrıca bu nöronların içsel elektrofizyolojik özellikleri daha önce kaderi haritalama çalışmaları 6,11 tarif edilenler ile uyum içindedir. Hep birlikte, bu sonuçlar electropo göstermektedirE15.5 Dlx5 / 6 güçlendirici eleman ile katyon seçici CGE türetilmiş interneuron alt tiplerini hedef.
Elektroporasyon deneylerin 1. şematik Şekil. a) Diyagram deneysel stratejisini gösteren) Dlx5 / 6-eGFP plazmid. b stratejisini alt klonlanması.
Şekil 2. Electroporated internöron CGE türetilmiş alt tip markerlerin ekspresyonu ile tarif edilmektedir. A), CGE türetilmiş internöron bir Dlx5 / 6-EGFP plasmid ile elektropore edildi. Çeşitli CGE alt tiplerinin seyrek Elektroporasvon. B) P8 A VIP ifade interneuron unutmayın. eGFP ifade delineatesTüm dendritik ağaç ve tek nöronların aksonal çardak. C) P8 de bir NPY-ifade interneuron. NPY ifade neurogliaform hücreleri. D) P15 de bir NPY-ifade interneuron çizer. Ölçek çubuğu A, 100 mm; BD, 50 mm
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tekniğin Sınırlamalar
Bu teknik, hücre süreçlerinin hücre özerk analizi için sağlar, bu popülasyon analizi için uygun değildir. Electroporations beyin başına elektropore az bin hücreleri ile çok seyrek. Bunun bir sonucu olarak, bu teknik CGE türetilmiş internöron genetik manipülasyon kaynaklanan davranış sonuçlarını değerlendirmek için kullanılamaz.
Elektroporasyon E13.5-E14.5 hedef MGE türetilmiş alt tiplerinde üzerinden taşınan, verimliliği düşük 10'dur. Biz Dlx5 / 6 güçlendirici en az epizomal ifade bağlamında postmitotik MGE alt tipleri daha az etkin olduğunu iddia etmektedir.
Mevcut Yöntemleri Açısından Önemi
Tekniği internöronlar çalışma için önceden elektroporasyon yöntemleri 12,13 dan gelişmeyi temsil etmektedir. Nedeniyle göreceli kıtlığı ve ventral embriyoyanic kökenli, nöronların bu nüfus hedef zor olduğu kanıtlanmıştır. Bizim teknik CGE türetilmiş internöronlar hücre özerk analizi yürütmek için araçlar sağlar. EGFP İfade yüksek düzeyde tek internöronlar görselleştirme ve analiz için izin verir.
Gelecek Uygulamaları
Özel plasmidler ve genetik olarak tadil edilmiş hücre soylarının kullanılmasını birleştirerek bu ilgi genlerinin ekspresyonunda geçici ve aralıklı kontrolünün elde edilmesi mümkündür. Örneğin, teto uyarılabilir transgenlerin ifadesi açmak için bir Dlx5 / 6-TTA plazmid kullanılır. Bu deneylerde, Doxycycline 8 uygulanması suretiyle, transgen ifadesi susturulur başardık. Şu anda CreER sistemi ile kombinasyon halinde tekniğini kullanmak için bir protokol geliştirmektedir.
Protokol çerçevesinde Kritik Adımlar
Verimli Elektroporasvon ve sağkalım elde etmek için, excès kaçınıyorumembriyo ve / veya organların manipülasyon sive. Ayrıca, arterler ve venler sıkışmaması. Kanama oluşursa fare çabucak hipovolemik olacak. Elektroporasyon tamamlandıktan sonra, hipoksi neden olabilir oluşturmak karışıklığı önlemek için onları bulundu aynı pozisyonda embriyolar ve organları. 20 dakika veya daha az cerrahi süre hedefliyoruz. Ameliyat sırasında PBS ile defalarca karın boşluğuna nemlendirir. Elektroporasyon sırasında, kılcal iğne ile sadece bir kez ventrikül delinme deneyin. Tekrarlayan delme hayatta kalma oranını azaltacaktır. Eğitim döneminden sonra, hayatta kalma oranı% 80 veya daha yüksek olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz teknik yardım için Lihong Yin minnettarız. NVD bir NARSAD Genç Araştırmacı Ödülü bir alıcı ve aynı zamanda NIH (5 K99 MH095825-02) hibe tarafından desteklenmektedir. Fishell laboratuarında Araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, Ruh Sağlığı (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09) Ulusal Enstitüsü, Nörolojik Bozukluklar ve İnme (5 R01 NS081297-02 Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenen 1 P01 NS074972 -01A1) ve Simons Vakfı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5 mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
References
- Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).
- Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis. J Neurosci. 23, 167-174 (2003).
- Eisenstat, D. D., et al. DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation. J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).
- Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors. J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).
- Bulfone, A., et al. The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos. Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).
- Bulfone, A., et al. Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries. J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).
- Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain. The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).
- Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472, 351-355 (2011).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239 (2007).
