Abstract
Studiet af det centrale nervesystem (CNS) modning afhængig genetisk målretning af neuronale populationer. Imidlertid har til opgave at begrænse ekspressionen af gener af interesse til specifikke neuronale undertyper påfaldende udfordrende på grund af den relative knaphed af specifikke promotorelementer. GABAerge interneuroner udgør en neuronal befolkning med omfattende genetiske og morfologiske diversitet. Faktisk har mere end 11 forskellige undertyper af GABAerge interneuroner blevet karakteriseret i musen cortex 1. Her præsenterer vi en tilpasset protokol til selektiv målretning af GABAerge befolkninger. Vi opnåede subtype selektiv målretning af GABAerge interneuroner ved hjælp enhancer element homeobox transskriptionsfaktorerne Dlx5 og Dlx6, homologer af Drosophila distale mindre (dll) gen 2,3, til at drive ekspressionen af specifikke gener ved in utero elektroporation.
Introduction
Hovedparten af kortikale GABAerge interneuroner stammer fra to forbigående embryonale strukturer Opkaldt mediale og caudale ganglioniske eminences (MGE og CGE henholdsvis) 4. Parvalbumin og somatostatin udtrykke interneuroner oprindelse i MGE hvorimod Calretinin (CR), Vasointestinal peptid (VIP) og Reelin (Re), der udtrykker interneuroner stammer fra CGE. Disse Interneuron undertyper kan skelnes ved deres fødselsdatoer. MGE afledte undertyper er født mellem fosterdag 9,5 (E9.5) og E16.5 5,6. I modsætning hertil er CGE afledt interneuroner født fra E12.5 gennem e18.5 med deres produktion toppede ved E15.5 6. Den genetiske målretning af dette sene født befolkning, forbliver dog undvigende.
De murine distale mindre (Dlx) gener udelukkende udtrykkes i det udviklende ventrale forhjerne 3. GABAerge interneuroner og striatale projektion neuroner, men ikke kortikale pyramideformede celler udtrykker Dlx1, 2,5 og 6 gener på tidlige udviklingsstadier 3. Faktisk er de Dlx generne udtrykkes i MGE og CGE subventrikulære zone (SVZ) i alle GABAerge stamceller. Ekspression af disse gener bliver begrænset til at vælge undertyper på postmitotiske trin 7-9. Forrige eksperimentelle beviser viste, at Dlx5 / 6 enhancerelement giver mulighed for selektiv målretning af GABAerge slægter i transgene musemodeller 2. Vi testede anvendelsen af en af disse enhancerelementer i forbindelse med episomale ekspression i den udviklende musehjerne. Vi sub klonet Dlx5 / 6 enhancerelement sammen med en minimal promotor og den forbedrede grønt fluorescerende protein (eGFP) i en Bluescript (BS) backbone plasmid (figur 1). Vi introducerede plasmidet ved hjælp af in utero elektroporation ved E15.5 til selektivt at målrette Cr-VIP og Re- undertyper 3,8,10. Vor teknik tillader sparsomme elektroporation, hvilket lettergenopbygningen af morfologiske træk singe celler. Desuden de usædvanligt høje niveauer af genekspression i corticale GABAerge neuroner giver mulighed for funktionelle studier. Vi udførte tab og gevinst på funktions undersøgelser med anvendelse af flere vildtype og dominerende negative gener 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr blev behandlet i overensstemmelse med reglerne og retningslinjerne for Institutional Animal Care og brug Udvalg for NYU School of Medicine.
Musestammer
Swiss Webster hunmus leveret af Taconic blev anvendt til disse eksperimenter. For specifikt at målrette overfladiske lag interneuroner blev E15.5 embryoer anvendes.
Bemærk: Den anvendte plasmid i dette arbejde (Dlx5 / 6.eGFP plasmid 3 ug / ul) blev genereret ved anvendelse af standard kloningsteknikker. EGFP cDNA blev klonet ind i en Dlx5 / 6-Pmin-polyA-plasmid. Dette plasmid er til rådighed efter anmodning (demarn02@nyumc.org).
1. Fremstilling af Mikroinjektion pipetter
- Indstil aftrækker Heat # 2-860.
- Placer og fastgør glaskapillar nær glødetråden. Kontroller, at den ydre diameter (OD) af pipetten er omtrent 30 um.
- Tryk på knappen "pull".
- Fjern forsigtigt kapillarrøret. Den nederste del er nålen. Kassér den øverste del.
2. Anæstesi Procedure
- Forbered en isofluran indeholdende kammer. Bemærk: Isofluran er det foretrukne bedøvelsesmiddel på grund af sin hurtige indsats og lav forekomst af bivirkninger. Pentobarbital er en anden mulighed; dog er variabel tolerance over for dette lægemiddel, og kan føre til en højere dødelighed end isofluran.
- Sæt strømmen af isofluran til 4-5% i 0,5-1 l / min O 2.
- Sørg for, at ventilen for kammeret er åbent mens ventilen til hovedet adapter er lukket.
- Placer den gravide mus i kammeret.
- Lad musen til at gå under påvirkning af anæstesi. Det vil tage omkring 2-3 minutter. Kontroller vejrtrækning. Hvis musen begynder at hyperventilere, sænke dosis af isofluran.
- Når musen er bedøvet, straks fjerne det fra kammeret. Placer den ventrale side op på varmepuden, og jegnsert hovedet i masken, som vil fortsætte med at levere isofluran hele operationen. Sørg for at skifte strømmen af isofluran fra kammeret til slangen, der forbinder hoved adapter stykke. Sæt en dråbe øjet smøremiddel i hvert øje og luk øjnene.
- Indstil varmepude til 36 ° C grader for at minimere hypotermi.
- Tjek for fraværet af mund og hale reflekser ved at klemme de bageste poter og hale.
3. Kirurgi
- Rens huden, der dækker maven med 70% ethanol.
- Brug pincet til at trække huden opad. Efter hver operation, vaske alle instrumenter med rengøringsmiddel og vand, og steriliseres ved 72 ° CO / N.
- Lav en lille lodret snit (ca. 2 cm) langs midterlinjen starter midt mellem tredje og fjerde par af mælkekirtler. Brug fine kirurgi saks. Pas på ikke at beskadige bugvæggen.
- Forsigtigt adskille huden fra bughinden.
- Visualiser arterierneog vener på bugvæggen. Foretag en anden 2 cm lodret snit gennem bughinden (undgå skibe) for at eksponere den abdominale kavitet.
- Spænd huden og bugvæggen på hver side undgår fastspænding arterierne. Bemærk: Hvis arterierne uheld punkteres, ofrer dyret straks ved at udføre cervikal dislokation eller isofluran overdosis.
- Pre opvarme sterilt PBS til 37 ° C. Dæk klemmerne med PBS fugtige Kim klude.
- Fugter udsat bughulen med PBS. Gentag dette trin flere gange, mens de udfører operationen.
- Ved hjælp af runde pincet, træk forsigtigt embryonale kæde (E15.5) væk fra hulrummet. Lad kæden hvile på vådservietter. Start ved at udsætte den ene halvdel af livmoderen først. Når embryoner det er elektroporeres, bringe den tilbage indeni, derefter arbejde på den anden halvdel.
4. Elektroporering
- Fortsæt med at bruge runde pincet til at manipulere embryoner.
- Visualize de laterale ventrikler. De laterale ventrikler løber langs midterlinjen (figur 1b).
- Tilføj Fast Green (Lager: 10% w / v) til DNA-opløsningen til en 1:20 blanding visualisere det under injektionen. Forbered DNA-opløsningen ved at opløse pellet opnået fra en standard maxi-prep oprensningsprotokol i destilleret vand.
- Brug forhånd trukket mikropipetter med et stempel til at injicere 1 ml DNA-opløsning (Dlx5 / 6-eGFP, 3 ug / ul) med Fast Green. Skær spidsen af mikropipette med en fin Forcep # 5 (Dumont) for at forlade 6 mm længde fra begyndelsen af skulderen til den ende af spidsen af nålen før indlæsning af pipetten. Hold hovedet af embryoet med runde pincet. Indtast hjernen med pipetten ved en vinkel på 45 ° med henblik på den laterale ventrikel beliggende i nærheden af midterlinjen. Hvis nålen trænger gennem ventriklen, langsomt trækkes pipetten, som du bruger stemplet at injicere DNA. Ventriklen skal vende grøn, nårløsning begynder at fylde det. På dette tidspunkt stopper med at bevæge pipetten og injicere 1 ml af DNA. Forsigtigt, trække pipetten.
- Indstil CUY21 elektroporator til fem 45V pulser af 50 ms afstand af 950 ms.
- Brug 5 mm paddleelektroderne til E15.5 embryoer. Dyp elektroderne i PBS for at sikre en effektiv løbende transmission.
- Placer elektrode padler rundt om fosterets hoved med den positive paddle ventriklen indeholdende DNA-opløsning. Lidt lavere det positive pagaj med respekt af den negative en til at skabe en ventrale strøm gennem ganglioniske eminences. Denne manipulation vil minimere ektopisk ekspression i pyramideformede celler.
- Efter placering af elektroderne, afgiver en impuls ved at trykke på fodpedalen én gang.
- Fjern elektroderne og tør dem rene. Gentag trin 4,6-4,9 med hvert foster.
- Efter elektroporere alle de embryoner, hæld 3 ml PBS i bughulen og returnere dem til bughulen.
- Første sutur bugvæggen med en buet nål og 5-0 silkesutur og huden. Anvend Lidocain (4%) på såret. Administrer 120 mg / kg af aspirin inden bughinden for analgesi.
Bemærk: Hele proceduren skal udføres i 20 min eller mindre. Det er tilrådeligt, at begyndere kun elektroporere nogle få fostre til at holde driften tid kort. Langvarige operationer vil mindske overlevelsesraten for embryoner. - Fjern dyret fra anæstesi slanger og tillade genvinding på varmepude på et papir serviet.
- Retur dyr til buret, holde det på varmepuden ved 37 ° C og overvåge sundhedstilstanden. Dyrene generelt tåle operationen godt og begynder at bevæge sig langsomt snart efter at de er fjernet fra anæstesi slangen. Hvis der observeres overdreven blødning eller sløvhed, ofre dyret straks ved at udføre IACUC godkendt eutanasi procedurer såsom cervikal dislokation eller anæstesi overdosis.
- Retur bur til vivarium. Hunnerne vil føde naturligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi tilpasset i livmoderen elektroporation teknik til at opnå celletype specifik målretning af udløb neuroner. Til at drive ekspressionen af eGFP i CGE-afledte interneuroner, vi brugte Dlx5 / 6 enhancerelement og begrænsede vores injektioner E15.5, den fase, hvor de fleste af CGE-afledte interneuroner er genereret. Vi har foretaget analysen på P8 og P15 11 (figur 1 og 2). Vi bekræftede den ventrale oprindelse elektroporerede neuroner ved co elektroporering en CAG-mCherry og en Dlx5 / 6-eGFP plasmider ved ækvimolære koncentrationer ved E15.5. I dette forsøg observerede vi, at kun ventrale progenitorceller placeret i subventrikulære zone (SVZ) co udtrykte begge proteiner 11. Denne rumlige tidsmæssig ekspression af fluorescerende proteiner falder sammen med den normale udviklingsmæssige ekspression Dlx5 og 6 gener, som ikke udtrykkes i den ventrikulære men subventricular zone 4. Endvidere har vi vurderet GABAergic identitet Dlx5 / 6-mCherry elektroporerede interneuroner i et GAD67-eGFP Knockin mus linje. Vi fandt, at langt størstedelen af elektroporerede neuroner udtrykte GAD67, et enzym udtrykkes af alle GABAerge celler 11. Derudover har vi bestemt subtype identitet elektroporerede interneuroner ved at udføre immunhistokemi og elektrofysiologiske analyse på P15. Mønstret for ekspression af subtype specifikke markører blev afsløret ved immunofluorescens i kryostatsnit 11 (figur 2). Vi fandt, at interneuroner elektroporeret ved E15.5 næsten udelukkende udtryk for NPY, Reelin, VIP og Cr, tidligere beskrevne CGE-afledte Interneuron 6 markører. Desuden iboende elektrofysiologiske egenskaber af disse neuroner er i overensstemmelse med den tidligere beskrevne i skæbne kortlægningsundersøgelser 6,11 én. Tilsammen indikerer disse resultater, at electroporation med Dlx5 / 6 enhancerelement ved E15.5 målrette selektivt CGE-afledte Interneuron undertyper.
Figur 1. Skematisk repræsentation af elektroporation eksperimenter. a) Subkloning strategi for Dlx5 / 6-eGFP plasmidet. b) Diagram, som viser den eksperimentelle strategi.
Figur 2. Elektroporerede interneuroner er afgrænset af ekspressionen af CGE-afledte undertype markører. A) CGE afledt interneuroner elektroporeret med en Dlx5 / 6-eGFP plasmid. Bemærk den sparsomme elektroporation af forskellige CGE undertyper. B) En VIP-udtrykkende interneuron på P8. eGFP udtryk beskriver denHele dendritiske træ og axonal lysthus af enkelte neuroner. C) En NPY-udtrykkende interneuron på P8. NPY udtryk skildrer neurogliaform celler. D) en NPY-udtrykkende interneuron på P15. Scale bar A, 100 mm; BD, 50 mm
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Begrænsninger af teknikken
Selvom denne teknik giver mulighed for celleautonom analyse af celleprocesser, er det ikke egnet til befolkningen analyse. De elektroporeringer er meget sparsomme med mindre end et tusinde celler elektroporeret pr hjernen. Som følge heraf kan teknikken ikke anvendes til at vurdere adfærdsmæssige konsekvenser af genmanipulation af CGE-afledte interneuroner.
Mens elektroporeringer udført ved E13.5-E14.5 mål MGE-afledte undertyper, effektiviteten er lav 10. Vi spekulere i, at Dlx5 / 6 forstærker er mindre aktive på postmitotiske MGE undertyper i det mindste i forbindelse med episomale udtryk.
Betydning i forhold til eksisterende metoder
Teknikken repræsenterer avancement fra tidligere elektroporation metoder 12,13 til studiet af interneuroner. På grund af deres relative knaphed og ventrale fosternic oprindelse, har denne population af neuroner vist sig vanskeligt at målrette. Vores teknik giver mulighed for at udføre celle-autonom analyse af CGE-afledte interneuroner. De høje niveauer af eGFP udtryk giver mulighed for visualisering og analyse af enkelte interneuroner.
Fremtidige applikationer
Ved at kombinere anvendelsen af specifikke plasmider og genetisk modificerede mus linjer er det muligt at opnå en tidsmæssig og rumlig kontrol i ekspressionen af gener af interesse. For eksempel brugte vi en Dlx5 / 6-TTA-plasmid for at tænde ekspressionen af TETO inducerbare transgener. I disse eksperimenter var vi i stand til at lukke munden på transgenekspression ved administration Doxycyclin 8. Vi er ved at udvikle en protokol til at bruge teknikken i kombination med créer systemet.
Kritiske skridt i protokollen
For at opnå en effektiv elektroporation og overlevelse, så prøv at undgå for stramSive manipulation af embryonerne og / eller organer. Hertil kommer, undgå at klemme arterier og vener. Musen vil hurtigt blive hypovolæmiske, hvis der opstår blødning. Efter elektroporation er fuldført, skal du placere embryoner og organer i de samme positioner, hvor du har fundet dem at undgå at skabe knæk, som kan forårsage iltsvind. Sigt efter 20 min eller mindre kirurgi tid. Moisturize bughulen med PBS adskillige gange under operationen. Under elektroporation forsøge at punktere ventrikel kun én gang med den kapillære nål. Gentagne punktering vil mindske overlevelsesraten. Efter uddannelsen periode bør overlevelsen 80% eller højere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Lihong Yin til teknisk bistand. NVD er en modtager af en NARSAD Young Investigator Award og er også støttet af tilskud fra NIH (5 K99 MH095825-02). Forskning i Fishell laboratoriet er støttet af National Institute of Health, National Institute of Mental Health (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09), National Institute of Neurologiske og Stroke (5 R01 NS081297-02, 1 P01 NS074972 -01A1) og Simons Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electroporator with pedal | Protech International | CUY21 | |
| 5 mm paddle electrodes | Protech International | CUY650P5 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 Puller | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac Anesthesia Systems | Harvard Apparatus | 726425 | |
| Delicate Operating Scissors 4.75" Straight Sharp/Sharp | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 Silk Black Braid 18" C-1 Box 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 Clamp scissors | Roboz | RC-4894 | |
| Holding forceps | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| Glass capillary tubing | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 20012-027 |
References
- Fishell, G., Rudy, B. Mechanisms of inhibition within the telencephalon: "where the wild things are". Annual review of neuroscience. 34, 535-567 (2011).
- Stenman, J., Toresson, H., Campbell, K. Identification of two distinct progenitor populations in the lateral ganglionic eminence: implications for striatal and olfactory bulb neurogenesis. J Neurosci. 23, 167-174 (2003).
- Eisenstat, D. D., et al. DLX-1, DLX-2, and DLX-5 expression define distinct stages of basal forebrain differentiation. J Comp Neurol. 414, 217-237 (1999).
- Batista-Brito, R., Fishell, G. The developmental integration of cortical interneurons into a functional network. Curr Top Dev Biol. 87, 81-118 (2009).
- Miyoshi, G., Butt, S. J., Takebayashi, H., Fishell, G. Physiologically distinct temporal cohorts of cortical interneurons arise from telencephalic Olig2-expressing precursors. J Neurosci. 27, 7786-7798 (2007).
- Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30, 1582-1594 (2010).
- Bulfone, A., et al. The mouse Dlx-2 (Tes-1) gene is expressed in spatially restricted domains of the forebrain, face and limbs in midgestation mouse embryos. Mechanisms of development. 40, 129-140 (1993).
- Bulfone, A., et al. Spatially restricted expression of Dlx-1, Dlx-2 (Tes-1), Gbx-2, and Wnt-3 in the embryonic day 12.5 mouse forebrain defines potential transverse and longitudinal segmental boundaries. J Neurosci. 13, 3155-3172 (1993).
- Robinson, G. W., Wray, S., Mahon, K. A. Spatially restricted expression of a member of a new family of murine Distal-less homeobox genes in the developing forebrain. The New biologist. 3, 1183-1194 (1991).
- Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32, 17690-17705 (2012).
- De Marco Garcia, N. V., Karayannis, T., Fishell, G. Neuronal activity is required for the development of specific cortical interneuron subtypes. Nature. 472, 351-355 (2011).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. Journal of visualized experiments : JoVE. (31), (2009).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. Journal of visualized experiments : JoVE. (6), e239 (2007).
