यह लेख craniofacial विकास के लिए तंत्रिका शिखा और / या अन्य ऊतकों की प्रजाति विशेष के योगदान का परीक्षण करने के लिए तैयार कर रहे हैं कि chimeric भ्रूण उत्पन्न करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है.
chimeric भ्रूण की पीढ़ी सेल भाग्य, ऊतक बातचीत, और ऊतकीय और हड्डीवाला भ्रूण की रूपात्मक विकास के लिए प्रजाति विशेष के योगदान का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक और शक्तिशाली तरीका है. विशेष रूप से, chimeric भ्रूण का उपयोग craniofacial परिसर की प्रजाति विशेष आकृति विज्ञान के निर्देशन में तंत्रिका शिखा के महत्व को स्थापित किया है. इस के साथ साथ वर्णित विधि उल्लेखनीय अलग craniofacial आकारिकी के साथ, दो एवियन प्रजातियों, बतख और बटेर का इस्तेमाल करता. यह विधि बहुत craniofacial परिसर में प्रजातियों विशिष्ट पैटर्न की आणविक और सेलुलर विनियमन की जांच की सुविधा. बटेर और बतख chimeric भ्रूण में प्रयोगों से पहले ही तंत्रिका शिखा की मध्यस्थता ऊतक बातचीत और craniofacial कंकाल, मांसलता, और झिल्ली में प्रजातियों विशिष्ट पैटर्न को विनियमित कि सेल स्वायत्त व्यवहार से पता चला है. तंत्रिका शिखा डेरिवेटिव की महान विविधता महत्वपूर्ण क्षमता का पता चलताहड्डीवाला विकास, रोग, और विकास को समझने के लिए बटेर बतख कैमेरिक प्रणाली के भविष्य के लिए आवेदन पत्र.
चेहरे का कंकाल बहिर्जनस्तरीय और endodermal उपकला परतों 1-11 से घिरे तंत्रिका शिखा और mesodermal mesenchyme से बना रहे हैं कि कई चेहरे प्रक्रियाओं के विकास और संलयन से विकसित करता है. प्रत्येक प्रक्रिया के भीतर Morphogenetic घटनाओं mesenchyme और आसपास के epithelia 12-16 के बीच स्पष्ट संकेत दे बातचीत से संचालित होते हैं. इन संकेत बातचीत और / या उनके नीचे की ओर effectors के लिए परिवर्तन रोग phenotypes के लिए योगदान और भी craniofacial कंकाल 17, 18 के विकास के लिए प्रासंगिक हो सकता है. इसलिए, ऊतक बातचीत का समय और प्रकृति elucidating चेहरे का कंकाल की विकासात्मक और विकासवादी जीव विज्ञान के बारे में हमारी समझ को बढ़ाने के लिए काफी संभावना है.
ऊतक बातचीत की जांच के लिए chimeric भ्रूण का उपयोग विकासात्मक जीव विज्ञान में एक लंबा इतिहास रहा है. यह दृष्टिकोण हंस Spemann और अपनी प्रयोगशाला ने बीड़ा उठायाविभिन्न उभयचर प्रजातियों के भ्रूण के बीच ऊतकों रोपाई द्वारा भ्रूण "आयोजकों" की खोज की है जो. Spemann जिसका हाथ कौशल विशेष उपकरणों, विशेष रूप से Spemann पिपेट के अपने विकास से पूरित किया गया माइक्रो सर्जरी तकनीक का एक मास्टर था. विक्टर हैम्बर्गर Spemann के नोबेल पुरस्कार के लिए नेतृत्व कि मूल प्रत्यारोपण प्रयोगों का प्रदर्शन किया गया जब है, जो 1920 के दशक के दौरान फ्रीबर्ग में हंस Spemann की प्रयोगशाला में एक स्नातक छात्र था. हैम्बर्गर 1935 में सेंट लुइस में वाशिंगटन विश्वविद्यालय के लिए चले गए, वह प्रायोगिक भ्रूणविज्ञान 19 के अपने मैनुअल में एक Spemann micropipette बनाने की प्रक्रिया विस्तृत जानकारी दी. आकर्षित किया Noden मैसाचुसेट्स, एमहर्स्ट विश्वविद्यालय के लिए और फिर कॉर्नेल विश्वविद्यालय में जाने के बाद, Noden fabricating और बटेर चिकी काइमेरा को शामिल उसकी शल्य चिकित्सा प्रत्यारोपण के लिए Spemann micropipettes का उपयोग जारी रखा. 1972 तक वाशिंगटन विश्वविद्यालय में हैम्बर्गर प्रयोगशाला में एक स्नातक छात्र था. और# 160;. एक स्नातक छात्र, 1995-1998 पर कॉर्नेल आकर्षित Noden साथ प्रशिक्षित लेखकों (रिच श्नाइडर) में से एक एक Spemann micropipette बनाने के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल हैम्बर्गर और Noden द्वारा लिखित विवरण के आधार पर, और है बनाया बाद में संशोधन शामिल है जबकि श्नाइडर ने.
craniofacial विकास के अध्ययन के लिए और विशेष रूप से तंत्रिका शिखा कोशिकाओं के योगदान को समझने के लिए बटेर चिकी काइमेरा का उपयोग Le Douarin एट अल 20 में समीक्षा, 1970 के दशक में Noden द्वारा और Le Douarin ने बीड़ा उठाया है. यह दृष्टिकोण मोटे तौर पर कई अध्ययनों में और कई अन्य जांचकर्ताओं 1, 4, 5, 21-38 द्वारा अपनाया गया है. विकास और बटेर और लड़की की आकृति विज्ञान के बराबर दरों सेल भाग्य और वंश अनुरेखण के अध्ययन के लिए उन्हें भीतर प्रत्यारोपण आदर्श बनाते हैं. हालांकि, क्योंकि बटेर और लड़की के बीच समानता की, morphological परिवर्तन इंडस्ट्रीज़दाता कोशिकाओं द्वारा uced समझने के लिए मुश्किल हो जाता है. इसके विपरीत, अन्य एवियन कैमेरिक सिस्टम 39-50 भ्रूण anatomically अलग कर उस तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक रास्ते के रूप में घरेलू बतख को शामिल किया है. अधिक विशेष रूप से, बटेर बतख कैमेरिक प्रणाली मेजबान, और इसके विपरीत पर दाता के प्रभाव समझदार के लिए कई लाभ प्रदान करता है. सबसे पहले, बटेर और बतख भ्रूण जीन अभिव्यक्ति (आंकड़े 1 ए और बी) के अंतर डोमेन के लिए परख करने की क्रिया द्वारा पैटर्न गठन का दाता या मेजबान विशिष्ट तंत्र का पता लगाने के लिए एक सीधा रास्ता प्रदान करता है, जो शरीर के आकार और आकार में अलग कर रहे हैं. दूसरा, बटेर और बतख भ्रूण बटेर 17 दिनों में अंडे सेने और बतख 28 दिनों में अंडे सेने के साथ, परिपक्वता की काफी अलग दरें हैं. प्रतिरोपित तंत्रिका शिखा मेजबान वातावरण के भीतर अपने आंतरिक परिपक्वता की दर को बनाए रखता है, और इस प्रकार, अस्थायी जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन, ऊतक बातचीत, ऊतकजनन, और morphogenesis की पहचान संभव है51-57. अंत में, विरोधी बटेर परमाणु एंटीबॉडी (पी.एन. ¢ क्यू) दाता और मेजबान सेलुलर योगदान सर्वत्र बटेर कोशिकाओं में व्यक्त लेकिन बतख कोशिकाओं से अनुपस्थित है कि एक प्रोटीन पहचानने से एक दूसरे से स्थायी रूप से प्रतिष्ठित हो सकते हैं.
तंत्रिका शिखा भ्रूण भर में बड़े पैमाने पर प्रवास करती है और craniofacial कंकाल है कि योगदान करने chondrocytes और अस्थिकोरक सहित विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं,, में अंतर किया कि एक क्षणिक भ्रूण सेल की आबादी है. बटेर बतख कैमेरिक प्रणाली में तंत्रिका शिखा रोपाई craniofacial कंकाल के विकास को विनियमित कि ऊतक बातचीत और संकेत दे रास्ते के बारे में हमारी समझ के लिए बहुत योगदान दिया. हालांकि, यह भी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, adipocytes, melanocytes, श्वान कोशिकाओं, और न्यूरॉन्स उत्पन्न करने के लिए तंत्रिका शिखा की विशाल क्षमता को देखते हुए, बटेर बतख कल्पना प्रणाली विशेष रूप से स्टेम कोशिका जीव विज्ञान के तेजी से प्रगति के साथ संयोजन के रूप में भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए जबरदस्त क्षमता है और पुनर्योजी दवा. बटेर और बतख दोनों वाणिज्यिक नस्ल प्रजातियां हैं, अपेक्षाकृत सस्ती निषेचित अंडे की एक तैयार की आपूर्ति खेतों की एक किस्म से उपलब्ध है. इस प्रकार, इस तकनीक researc के लिए सुलभ होना चाहिएउसका बजट और सुविधा अंतरिक्ष की एक विस्तृत श्रृंखला के भीतर ऑपरेटिंग.
इस तकनीक बहुत शक्तिशाली है हालांकि, कई सीमाएं रहते हैं. अन्य शल्य चिकित्सा तकनीक की तरह, बटेर बतख काइमेरा की गुणवत्ता और व्यवहार्यता शोधकर्ता की शल्य चिकित्सा कौशल पर भरोसा करते हैं, और इसलिए, इस तरह उन का उपयोग माउस के रूप में अन्य मॉडलों की तुलना में प्रयोगों के बीच अधिक अंतर और इंट्रा व्यक्तिगत परिवर्तन नहीं होगा आनुवंशिकी. इसके अलावा, reproducibility और प्रत्येक प्रत्यारोपण की सफलता के लिए योगदान देता है कि विकास और व्यक्तिगत भ्रूण के चरणों की दरों में भिन्नता भी है. एवियन भ्रूण भी निर्जलीकरण के लिए बहुत जल्दी हो जाता है और शल्य चिकित्सा के दौरान इसलिए महत्वपूर्ण कदम एक न्यूनतम करने के लिए खुर्दबीन के नीचे, कम समय प्रकाश के स्तर रखने में शामिल हैं, जितना संभव हो उतना टेप के साथ बंद अंडे, और पोस्ट ऑपरेटिव इनक्यूबेटर में उच्च आर्द्रता शुष्क्ीकरण से बचें.
काइमेरा की व्यवहार्यता, यू के संदर्भ मेंइन प्रतिशत पुराने संग्रह चरण में कमी कर सकते हैं, हालांकि sually के बीच 50-75%, जीवित रहते हैं. सर्जरी के एक ठेठ 4-6 घंटा सत्र में, एक अनुभवी सर्जन 10-15 काइमेरा उत्पन्न कर सकते हैं. प्रत्यारोपण की सफलता भी उपकरण की गुणवत्ता पर बहुत निर्भर करता है. अच्छे उपकरण अधिक संगत, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों को जन्म दे. टंगस्टन सुई बनाने के लिए एक प्रोपेन मशाल का उपयोग करना अत्यंत तेज सुइयों किए जाने के लिए अनुमति देता है. यह लौ के आकार को नियंत्रित करता है क्योंकि इस्तेमाल किया मशाल का प्रकार एक बड़ा फर्क पड़ता है. Electrolytic sharpening भी इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इस दृष्टिकोण के रूप में भी तेज सुइयों के उत्पादन को बंद नहीं आती. सुई सीधे बनाया जा सकता है तो बजाय spooled तार की टंगस्टन छड़ का प्रयोग करें.
Spemann micropipette, समय लेने वाली और बनाने के लिए मुश्किल है, ऊतक स्थानांतरण के लिए एक आदर्श उपकरण है. पिपेट अलग आकार के खुलने के साथ अनुकूलित किया जा सकता है, और बार बार इस्तेमाल किया जा सकता है. Usin लिए एक महत्वपूर्ण कारकगा Spemann micropipette भ्रूण की सतह को टिप को छूने से पहले पिपेट में कुछ तरल पदार्थ है. संपर्क भ्रूण से अधिक meniscus के साथ किया जाता है जब तरल पदार्थ के कुछ हमेशा बाहर प्रवाह होगा. थोड़ा डायाफ्राम पर दे धीरे पिपेट में दाता भ्रष्टाचार ऊतक बेकार है जबकि डायाफ्राम पर दबाव, द्रव और भ्रष्टाचार ऊतक बहुत ठीक अलग हो सकता है की अनुमति देता है. डायाफ्राम पर सकारात्मक दबाव का एक सा बनाए रखने के स्थानांतरण के दौरान पिपेट की नोक पर दाता भ्रष्टाचार ऊतक रहता है, और डायाफ्राम पर एक छोटे से अतिरिक्त दबाव दाता भ्रष्टाचार ऊतक जानबूझ मेजबान में रखा जा सकता है.
भंडारण और नसबंदी के दौरान Spemann पिपेट की सुरक्षा के लिए, व्यापक अंत से बल्ब हटा ध्यान बल्ब में पतला टिप डालें. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ शीर्ष कवर, और सर्जरी से पहले आटोक्लेव, एक गिलास टेस्ट ट्यूब में Spemann पिपेट रखें. कई pipettes फिर रहे हैं के बादसर्जरी के लिए फिर से निष्फल होने के लिए ady, pipettes पलटना आसुत जल और कांच के बने पदार्थ द्रव्य का एक ही समाधान में एक फोड़ा करने के लिए लगभग उन्हें गर्मी, और फिर आसुत जल के साथ बार बार कुल्ला. उनके व्यक्तिगत ट्यूबों में आटोक्लेव pipettes. वे अन्धेरा और कठोर हो जाते हैं जब डायाफ्राम और रबर बल्ब रूपों कि रबर टयूबिंग कई sterilizations के बाद बदला गया या किया जाना चाहिए.
इस प्रोटोकॉल के घटकों में से कई खतरनाक उपकरण शामिल है. उदाहरण के लिए, एक Spemann Micropipette बनाने के लिए प्रक्रिया तीन लपटों के प्रकार के साथ ही ताप, खींच उड़ाने, झुकने, काटने, और कांच चमकाने शामिल है. इसलिए, उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहन ऐसे चश्मे के रूप में सुरक्षा बढ़ जाती है और एक प्रयोगशाला कोट महत्वपूर्ण है कि. साथ ही, कई लोगों से ग्रस्त हैं, या,, अंडा एलर्जी विकसित अंडे से निपटने जब हमेशा दस्ताने का उपयोग करने की क्षमता है क्योंकि. मन में इन सावधानियों, बटेर बतख कैमेरिक प्रणाली के साथ मैंकई भविष्य आवेदन किया है कि एसए, सुरक्षित, कुशल, और अपेक्षाकृत सुलभ विधि.
The authors have nothing to disclose.
यह काम एक डेंटल के राष्ट्रीय संस्थान और craniofacial रिसर्च (NIDCR) F32 अनुदान (DE021929) JLF करने और रास के लिए एक NIDCR R01 अनुदान DE016402 द्वारा वित्त पोषित किया गया
1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
Hank’s BSS w/o Phenol Red | Invitrogen | 14025-092 | |
Neutral Red | Sigma Aldrich | N4638-5G | .22µm filter-sterilized |
18G Needles | BD | 305195 | |
5 ml syringe | BD | 309646 | |
No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Straight Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
Curved Scissors | Fine Science Tools | 14029-10 | |
Spemann Pipet | Hand-made in lab | ||
Egg holder | Glass ashtray and modeling clay | ||
Alcohol burner | Fisher | 04-245-1 | |
Transparent tape | 3M Scotch | 600 | |
Glass Stirring Rod | Fisher | 11-380C | Tip is narrowed and rounded using a flame |
Tungston wire (.004 x 3 inches) | A-M Systems | 7190 | Tip is flame-sharpened in a propane torch |
Bunsun burner | Fisher Scientific | S49117 | |
Pasteur pipette | Fisherbrand | 22-183-632 | 9-inch (229 mm) |
rubber tubing | Fisher Scientific | 14-178C | amber, thin wall natural rubber; wall thickness: 0.0625 inches/1.6 mm; O.D.: 0.375 inches/9.5 mm; I.D.: 0.25 inches/6.4mm |
Propane fuel cylinder | BernzOmatic | UL2317 | TX-9 with torch style "A" with a screw-on brass "pencil flame" torch |
Diamond point pencil | Fisher Scientific | 22-268912 | |
Rubber bulbs | Fisherbrand | S32325 |