Denne artikel beskriver en metode til at generere kimære embryoner, der er designet til at teste de artsspecifikke bidrag neurale våbenskjold og / eller andre væv til kraniofaciale udvikling.
Den generation af kimære embryoner er en udbredt og kraftfuld tilgang til at studere celle skæbner, vævs-interaktioner og artsspecifikke bidrag til histologiske og morfologiske udvikling af hvirveldyr embryoner. Navnlig er anvendelsen af kimære embryoner etableret vigtigheden af neuralkam i at lede artsspecifik morfologi kraniofaciale kompleks. Den heri beskrevne fremgangsmåde anvender to fuglearter, ænder og vagtler med bemærkelsesværdigt anderledes kraniofaciale morfologi. Denne metode i høj grad letter undersøgelse af molekylære og cellulære regulering af artsspecifikke mønster i kraniofacial kompleks. Forsøg i vagtler og ænder kimære embryoner har allerede afsløret neural crest-medieret vævsinteraktioner og celle-autonome adfærd, der regulerer artsspecifikke mønster i craniofacial skelet, muskulatur, og integument. Den store mangfoldighed af neurale crest derivater antyder et betydeligt potentialefor fremtidige anvendelser af vagtel-ænder kimære-system til at forstå hvirveldyr udvikling, sygdom og evolution.
Ansigtets skelet udvikler sig fra vækst og fusion af flere ansigts processer, der er sammensat af neurale våbenskjold og mesodermal mesenchym omgivet af ektodermal og endodermale epitel lag 1-11. Morfogenetiske begivenheder inden for hver proces er styret af forskellige signalsystemer interaktioner mellem mesenkymet og de omkringliggende epiteler 12-16. Ændringer i disse signalanlæg interaktioner og / eller deres downstream effektorer bidrager til sygdomsfænotyper og kan også være relevant for udviklingen af craniofacial skelet 17, 18. Derfor belyse timingen og arten af væv interaktioner har et stort potentiale for at øge vores forståelse for de udviklingsmæssige og evolutionær biologi af ansigtets skelet.
Brugen af kimære embryoner til at undersøge væv interaktioner har en lang historie i udviklingsmæssige biologi. Denne tilgang blev udviklet af Hans Spemann og hans laboratoriumder opdagede embryonale "arrangørerne" ved at transplantere væv mellem embryoner af forskellige paddearter. Spemann var en mester i mikro-kirurgiske teknikker, hvis hånd-færdigheder blev suppleret med hans udvikling af specialiserede værktøjer, navnlig Spemann pipette. Viktor Hamburger var en ph.d.-studerende i laboratoriet af Hans Spemann i Freiburg i løbet af 1920'erne, der er, når de oprindelige transplantation eksperimenter, der førte til Spemann Nobelpris blev udført. Da Hamburger flyttede til Washington University i St. Louis i 1935, han detaljeret processen med at gøre en Spemann mikropipette i sin Manual of Experimental embryologi 19.. Drew Noden var en ph.d.-studerende i Hamburger laboratorium ved Washington University frem til 1972. Efter at have flyttet til University of Massachusetts, Amherst og derefter til Cornell University, Noden fortsatte opdigte og bruge Spemann mikropipetter for sine kirurgiske transplantationer involverer vagtel-chick kimærer. &# 160;. Mens en ph.d.-studerende, en af forfatterne (Rich Schneider) trænede med Drew Noden ved Cornell 1995-1998 følgende protokol for at gøre en Spemann mikropipette er baseret på beskrivelser skrevet af Hamburger og Noden, og inkluderer efterfølgende modifikationer af Schneider.
Brugen af vagtel-chick kimærer for studiet af kraniofacial udvikling og især for at forstå de bidrag neurale crest celler blev udviklet af Noden og Le Douarin i begyndelsen af 1970'erne, revideret i Le Douarin et al 20. Denne tilgang er blevet bredt vedtaget i mange undersøgelser, og af mange andre forskere 1, 4, 5, 21-38. De tilsvarende vækstrater og morfologi af vagtler og chick gøre transplantationer i dem ideelle til studiet af celle skæbne og afstamning sporing. Men på grund af lighederne mellem vagtler og chick, IND morfologiske ændringer,uced af donor celler er vanskelige at tyde. I modsætning hertil har andre fugle kimære systemer indgår indenlandske duck som en måde at studere mekanismer, der gør embryoner anatomisk distinkt 39-50. Mere specifikt vagtel-duck kimære systemet tilbyder flere fordele for kræsne virkningerne af donor på værten, og vice versa. Først, vagtler og ænder embryoner er forskellige i krop størrelse og form, som giver en direkte måde at udforske donor-eller værtsspecifikke mekanismer mønster dannelse ved at analysere for differentierede domæner af genekspression (figur 1 A og B). For det andet, vagtler og ænder embryoner har betydeligt forskellige satser for modning, med vagtler klækningen i 17 dage, og ænder klækning i 28 dage. Transplanteret neuralkam fastholder sin iboende modning sats inden værten miljø, og dermed er mulig identifikation af tidsmæssige ændringer i genekspression, væv interaktioner, histogenese og morfogenese51-57. Endelig anti-vagtler nuklear antistof (Q ¢ PN) giver mulighed for donor og vært cellulære bidrag til at være permanent skelnes fra hinanden ved at anerkende et protein, der udtrykkes ubikvitært i vagtler celler, men fraværende fra Duck celler.
De neurale crest er en forbigående embryonale celle befolkning, der migrerer udstrakt grad i hele embryoet og differentierer i forskellige celletyper, herunder chondrocytter og osteoblaster, der bidrager til den kraniofaciale skelet. Transplantere neuralkam i vagtel-duck kimære system er i høj grad bidraget til vores forståelse af væv interaktioner og signalveje, der regulerer udviklingen af kraniofaciale skelet. Men i betragtning af det enorme potentiale i neuralkam til også generere glatte muskelceller, adipocytter, melanocytter, Schwann celler og neuroner, vagtler-duck kimære system har et enormt potentiale for fremtidige applikationer, især i forbindelse med den hurtige udvikling stamcellebiologiske og regenerativ medicin. Da vagtler og ænder er både kommercielt avlet arter, en klar til levering af relativt billige befrugtede æg er tilgængelige fra en række bedrifter. Således bør denne teknik være tilgængelige for researchfirmaernehendes opererer inden for en bred vifte af budgetter og anlæg plads.
Selv om denne teknik er meget kraftfuld, er der fortsat en række begrænsninger. Ligesom andre kirurgiske teknikker, kvalitet og bæredygtighed af vagtel-ænder kimærer stole på de kirurgiske færdigheder af forskeren, og derfor vil der være mere inter-og intra-individuel variation mellem eksperimenter i forhold til andre modeller, såsom dem at udnytte mus genetik. Desuden er der også variation i hyppigheden af udvikling og stadier af individuelle embryoner, der bidrager til reproducerbarhed og succes transplantation. Avian embryoner er også meget modtagelige for dehydrering og derfor kritiske trin i løbet af kirurgi omfatter holde lysniveauer lave, tiden under mikroskop til et minimum, æg forseglet med tape så meget som muligt, og høj luftfugtighed i den postoperative inkubator til undgå udtørring.
Med hensyn til levedygtighed kimærer, usually mellem 50-75% overleve, selv om disse procentsatser kan mindske ældre indsamling scenen. I en typisk 4-6 timers session kirurgi, kan en erfaren kirurg generere 10-15 kimærer. Succesen for transplantationer afhænger også i høj grad af kvaliteten af værktøjerne. Gode værktøjer føre til mere ensartede, reproducerbare resultater. Ved hjælp af en propan fakkel at gøre wolfram nåle giver ekstremt skarpe nåle, der skal foretages. Den type fakkel brugt gør en stor forskel, fordi det styrer størrelsen af flammen. Elektrolytisk skarphed kan også bruges, men denne fremgangsmåde er ikke engang komme tæt på at producere nåle så skarpe. Brug wolfram stænger i stedet for tråd på spoler så nålene kan gøres lige.
Den Spemann mikropipette mens tidskrævende og vanskeligt at gøre, er et ideelt instrument for vævs overførsel. Pipetten kan tilpasses med forskellige størrelse åbninger, og kan anvendes gentagne gange. En kritisk faktor for usinga Spemann mikropipette er at have en vis mængde fluid i pipetten før røre spidsen til overfladen af embryoet. Noget af væsken vil altid flyde ud, når der er kontakt med menisken i embryoet. Hvis du trykker på mellemgulvet tillader væske og graft væv, der skal skubbes meget præcist, hvorimod lidt at lade op på membranen suger blidt donor graft vævet ind i pipetten. Fastholdelse af en lidt positivt tryk på membranen holder donor graft væv på spidsen af pipetten under overførslen, og lidt yderligere pres på membranen tillader donor graft væv, der skal placeres forsætligt i værten.
Til beskyttelse af Spemann pipetten under opbevaring og sterilisering, fjerne pæren fra den brede ende og forsigtigt indsætte den tilspidsede spids i pæren. Placer Spemann pipetten i et reagensglas, dække toppen med aluminiumsfolie, og autoklaveres forud for operationen. Efter flere pipetter er ready at blive steriliseret igen for kirurgi, vendes pipetter, varme dem næsten i kog i den samme opløsning af destilleret vand og glasvarer rengøringsmiddel, og derefter skylles gentagne gange med destilleret vand. Autoklave pipetter i deres individuelle rør. Den gummislanger, der danner mellemgulvet og gummi pære skal udskiftes efter flere sterilisationer, eller når de bliver formørket og stiv.
Mange af komponenterne i denne protokol involverer farligt udstyr. For eksempel proceduren for at gøre en Spemann Mikropipette omfatter tre typer af flammer samt varme, træk, blæser, bøjning, skæring og polering glas. Derfor iført personlige værnemidler (PPE), som øger sikkerheden, såsom beskyttelsesbriller og en kittel er kritisk. Derudover, fordi mange mennesker lider af, eller har potentiale til at udvikle, æg allergi, altid bruge handsker, når du håndterer æg. Med disse forholdsregler i tankerne, vagtel-duck kimære system, jegsa sikker, effektiv og relativt tilgængelig metode der har mange fremtidige ansøgninger.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af en National Institute of Dental og kraniofacial Research (NIDCR) F32 tilskud (DE021929) til JLF og en NIDCR R01 tilskud DE016402 til RAS
1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
Hank’s BSS w/o Phenol Red | Invitrogen | 14025-092 | |
Neutral Red | Sigma Aldrich | N4638-5G | .22µm filter-sterilized |
18G Needles | BD | 305195 | |
5 ml syringe | BD | 309646 | |
No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Straight Scissors | Fine Science Tools | 14028-10 | |
Curved Scissors | Fine Science Tools | 14029-10 | |
Spemann Pipet | Hand-made in lab | ||
Egg holder | Glass ashtray and modeling clay | ||
Alcohol burner | Fisher | 04-245-1 | |
Transparent tape | 3M Scotch | 600 | |
Glass Stirring Rod | Fisher | 11-380C | Tip is narrowed and rounded using a flame |
Tungston wire (.004 x 3 inches) | A-M Systems | 7190 | Tip is flame-sharpened in a propane torch |
Bunsun burner | Fisher Scientific | S49117 | |
Pasteur pipette | Fisherbrand | 22-183-632 | 9-inch (229 mm) |
rubber tubing | Fisher Scientific | 14-178C | amber, thin wall natural rubber; wall thickness: 0.0625 inches/1.6 mm; O.D.: 0.375 inches/9.5 mm; I.D.: 0.25 inches/6.4mm |
Propane fuel cylinder | BernzOmatic | UL2317 | TX-9 with torch style "A" with a screw-on brass "pencil flame" torch |
Diamond point pencil | Fisher Scientific | 22-268912 | |
Rubber bulbs | Fisherbrand | S32325 |