Summary
此协议的目的是证明细胞培养物对吸入有毒化学品的曝光方法。曝光的区别空气 - 液体界面的气道上皮细胞（ALI）的培养物提供了呼吸道暴露于有毒气体，如氯气的独特模式。在这个手稿，我们描述对上皮细胞的气-液界面培养氯曝光和心肌细胞的液体培养的效果。 体外曝光系统允许重要机理研究，以评估，然 后可以用于开发新的治疗剂的途径。
Abstract
细胞培养是必不可少的开发和研究治疗药物，其在动物模型中使用前药效。我们的模型以及分化的人类气道上皮细胞和心脏肌肉细胞的独特能力。这可能是非常有用的工具来研究的毒性吸入的化学物质，如氯，可以通常与细胞表面相互作用，并且在与水反应，并限制了它们在液态培养的影响形成的各种副产物的有害影响。采用高分化人支气管上皮细胞培养在空中liqiuid接口我们的模型绕过这个限制，以及提供了一个机会，以评估潜在的有毒化学物质吸入毒性的关键机制。我们描述了增强的损失细胞膜的完整性，一旦吸入有毒化学蛋白酶的释放和死亡，如氯曝光。在这篇文章中，我们提出的方法氯气暴露在哺乳动物心脏和呼吸道上皮C型号英语学习者的文化和简单的测试，以评估其对这些细胞类型的影响。
Introduction
接触有毒化学物质吸入（国际信托）/气体如氯（Cl 2）保持在意外风险，以及在其作为化学威胁代理可能使用一个持续的健康问题。虽然肺是主要的目标，器官，如心脏和大脑也受到影响1-3。 体内模型通常用于从国际信托测试毒性，但在体外实验进行毒性评估更简单，更快速，更具成本效益。 在体外模型还允许对可能难以在体内评估代理-细胞相互作用广泛的调查。这种体外曝光系统是罕见的，而且，在有毒物质被添加到其中的细胞被淹没培养基某些常规型号，代理商的属性可以改变由于相互作用和结合的培养基成分。在这样的情况下的细胞培养系统，例如气 - 液界面（ALI人原代气道上皮细胞，在这里提出，可直接暴露于气态试剂的）培养物可能是有希望的。
上皮细胞衬里的气道是抵御吸入有毒化学品的第一线。人类气道上皮细胞形成在肺中的腔管和相关的细胞之间的物理屏障，并参与肺的响应。它产生的许多细胞因子和其他亲和抗炎剂，以及分泌粘液/气道表面液体（ASL）覆盖的上皮。一个在常规浸没在体外培养系统中的限制也是覆盖上皮表面ASL和粘液除去或稀释。这并不反映被暴露在空气中的肺上皮细胞的生理条件。因此， 在体外系统的理想旅游业议会毒性试验应重复这种架构。目前在开发快速筛选米的极大兴趣ethods的预测体内毒性。在ALI生长上皮细胞分化并具有分化良好的结构和功能相比，细胞生长淹没和服务于呼吸道的卓越典范。
在这项研究中，我们描述了使用人的气道（支气管）上皮细胞，用于测试有毒气体吸入毒性气 - 液界面培养物，并将其与心肌细胞的浸没式细胞培养进行比较，从而研究毒性的另一个重要目标。
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Protocol
1。大鼠心肌细胞培养
- 根据批准的机构动物护理和使用委员会，IACUC协议被执行的所有实验。
- 从雄性大鼠使用前面4描述的方法的心（心室）（240-260克）获得大鼠心肌细胞。简单地说，用腹腔注射戊巴比妥麻醉动物（100毫克/千克;用脚趾捏法确认麻醉），然后取出心，10.0毫升，1毫米的Ca 2 +含克雷布斯Ringer缓冲液，pH值7.4。
- 漂洗心中5-6倍，除去血液，然后切换到Ca 2 +的免费林格克雷布斯含有0.02％蛋白酶和0.06％胶原酶（5.0毫升/心脏）的缓冲区。孵育的心在此溶液中10-15分钟，在37℃，偶尔摇动。
- 经过10-15分钟，洗出的酶溶液与Ca 2 +的免费的Krebs Ringer缓冲额外5分钟。从弛缓性组织我们释放细胞吹打悬浮上下几次ING 25毫升吸管。
- 通过70微米尼龙网过滤从组织分离细胞，并允许他们定居在含有0.1毫米的Ca 2 +的Krebs Ringer缓冲。暂停的细胞沉淀在1.0ml含0.2毫米的Ca 2 +的Krebs Ringer缓冲液。
- 仔细层以上5.0毫升60微克/毫升牛血清白蛋白，牛血清白蛋白，在15ml离心管中，向心肌细胞从nonmyocytes分开，并允许他们沉降30分钟。心肌较重，移动到管的底部。小心取出上清液细胞和介质。重复此步骤一次，以进一步纯化细胞。
- 洗（使用0.25毫米，0.5毫米，0.75毫米和1.0毫米的Ca 2 +的缓冲液的步骤）的心室肌细胞/心肌细胞，以1.0毫米的Ca 2 +的缓冲液和重悬浮在由Dulbecco改良的Eagle培养基ACCT介质逐渐过渡，DMEM containi纳克2毫克/毫升牛血清白蛋白，2mM的L-肉碱，5mM的肌酸，5mM的牛磺酸，100国际单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素。
- 板ACCT介质的心肌细胞在100〜150 个 / mm 2 100毫米或35毫米层粘连蛋白的浓度包被预包被层粘连蛋白（1微克/厘米2）的塑料培养皿或40×22毫米的玻璃盖玻片上。 1小时后，洗碗用2.0ml ACCT，除去未贴壁细胞。加入10.0毫升新鲜培养基孵育细胞。
人呼吸道上皮的基底细胞2。分化气 - 液界面（ALI）培养
- 根据机构审查委员会促使人体气管，支气管组织从国家疾病研究交换批准的协议。细胞收获和使用已发布的程序5,6进行文化。本程序采用细胞培养，因为他们是人类吸入风险，以信托投资一个精确的模型，但是，如果需要的话可以隔离和增长ALI月使用和/或大鼠呼吸道上皮细胞7,8。
- 简单地说，删除所有结缔组织和淋巴结后，使组织的小碎片（〜6.3英寸）。在乳酸林格氏液冲洗组织几次。加组织到一个50ml锥形管中，并加入蛋白酶溶液（1％Protease/0.01％DNA酶在最小必需培养基，MEM，组织，以液比（1:10））。
- 岩石的组织在4℃过夜。通过添加10％胎牛血清的最终组织的离解。刮除上皮表面用外科手术刀并通过离心（2000 rpm离心10分钟）收集细胞。
- 板在细胞上通过Fulcher的等 9中详细描述的方法制备在特殊ALI介质胶原包被的snapwells通道之一。培养，用于通过除去根尖媒体改变到空气 - 液体界面（ALI）前5天。
- 饲料采用ALI媒体每隔一天细胞，并允许细胞分化为另外的2-3周（进行曝光前，观察无数跳动的纤毛和黏液分泌）。用温热的PBS随着媒体的变化洗净顶面。
3，氯曝光
- 含氯曝光系统（CES）上一个合格的化学罩内有100英尺，可提供必要的二次密封，以防止意外氯气泄漏事件的人员暴露的操作表面风速。
- 经营体制下轻微正压（0.5英寸水柱）。干燥的空气被送入在15升/分钟和氯被馈送到达到所期望的最终的氯浓度适当的水平。该室有一个锁盖与4迷你BCU锁和低硬度硅胶垫片，以提供压力密封。
- 通过质量流量控制器提供了2氯混合。在CES使用含有1.0％的C18：2在干燥的氮气压缩气体钢瓶。
- 通过调节稀释气流定制设计的控制面板，同样调节氯离子浓度输送至曝光室。低流量采样泵就会从室成氯分析仪排气监测的浓度，然后记录在连接到分析仪的数据采集器。
- 在曝光之前使用流量计来保证平等送货和排气率测量中的腔室的流速。
- 通过除去上清液介质并加入新鲜培养基（在ALI培养基底外侧培养基）制备的细胞培养物进行曝光。与代理商的任何预处理可以在这个时候进行。
- 在两个密封的聚砜生物控制腔室暴露的气道上皮细胞的培养ALI到Cl 2中的气体（50，100，或300 ppm的30分钟）。心肌细胞（浸没或汇合在膜上培养物）暴露于50或100ppm Cl 2中15分钟。
- 曝光后冲洗室与空气，直至C升2水平低于1ppm的，可以安全地打开，取出细胞（5分钟内）。
4，跨上皮电阻（TER）测量
- 测量气 - 液界面的TER，ALI，使用上皮voltohmmeter有一对氯化银“筷子”电极文化。
- 平衡筷子电极在使用前，ALI媒体15分钟。
- 添加温暖的媒体心尖（1.0毫升）和基底（2.0毫升）表面，并使用voltohmmeter的筷子电极测量TER。
- 浸电极在心尖媒体短臂和基底介质的长臂。点击voltohmmeter的“测量”按钮来评价的电阻。
- 该voltohmmeter具有测量欧姆或k欧姆的选项。减去电阻两端的电阻的无细胞培养支持在每个细胞层测量，得到反上皮电阻（TER）。
5，胱天蛋白酶测量
- 加入新鲜ALI媒体（2.0毫升）的基底表面暴露后孵育的细胞在室温下。收集上清液媒体在4至24小时。
- 通过使用商用的caspase 3/7检测试剂盒测量在媒体上清的caspase 3/7活性。
6，Western blot和免疫细胞化学
- 用细胞裂解液如前文所述10进行Western印迹。暂停蛋白裂解液（20微克）的5倍减少上样缓冲液，煮沸5分钟。若使蛋白质裂解物进行SDS-PAGE（4-15％）和电泳印迹法所分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。
- 方框孵育膜用5％脱脂乳的洗涤缓冲液（PBS +0.1％洗涤剂）的非特异性结合，并与反SERCA2或肌节肌动蛋白一抗探测膜在1:1000稀释，过夜，在4℃下。接下来，清洗和膜孵育与各自的过氧化物酶标记的二抗和使用商业过氧化物酶检测试剂盒10之前描述的发展进行检测。
- 对于免疫细胞化学治疗生长在插入或盖玻片的6孔板中以0.4％的10mM柠檬酸钠缓冲液的Triton-X-100的PBS漂洗20分钟后的活细胞。
- 块由非特异性治疗的细胞，用5％驴血清20分钟，然后于室温孵育与非特异性IgG或个人的初级抗体特异性，以肌动蛋白或Ki-67的约束力。
- 用PBS洗涤细胞，并用荧光标记的二抗孵育，以检测一抗和核染色剂（1μg/ ml的DAPI）。
- 用PBS洗涤，并使用商业安装介质安装盖玻片。
- 用荧光显微镜可视化染色。
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Representative Results
主要杆状心肌细胞上附着层粘连蛋白基质和蔓延，并分化成融合培养（ 图1A和它的插图）。这些细胞的特征还在于肌节肌动蛋白和SERCA2表达（ 图1B和1C）的基础上。大鼠心肌细胞极易受到氯气的毒性为15分钟暴露于100ppm的氯引起广泛的细胞变圆，死在水下文化和融合层破坏的生长层粘连蛋白涂层膜（ 图1D）细胞。以前也有增强细胞凋亡通过半胱天冬所示3/7发行版中成长的插入（ 图1E）的心肌细胞。
曝光分化的人类呼吸道上皮细胞（ 图2，插页到面板1显示细胞培养的横截面与插入柱状，纤毛和杯状细胞）氯气造成脱落和LIF细胞膜婷在低温（100 ppm）的高（300 PPM）的浓度（ 图2面板A2和A3）。低浓度的氯损害迅速扭转（ 图2面板A5），但是，细胞暴露于较高浓度的氯气已延迟或没有修复能力（ 图2面板A6），通过目视检查，以及由Ki-67的细胞增殖评估染色（ 图2面板A9）。反式皮电阻，TER测量和caspase活性进一步证实了这些结果，并为细胞膜的完整性和细胞凋亡在氯气暴露的损失（ 图2，B组和C）提供依据。因此，我们的研究描述了体外 Cl 2中的曝光系统，导致丧失膜完整性及气道上皮细胞和心肌细胞死亡的发展。这种效果可能不是由于在心肌细胞的非生理pH值的变化为如通过使用所收集的媒体暴露后的pH计测得的介质在暴露于氯气后的pH值保持在〜7.4。
如在协议中所述并接种于层粘连蛋白包被的塑料培养皿（图A中，有代表性的光显微镜图像）或层粘连蛋白涂层刀片图1。大鼠心肌细胞的分离和暴露于氯。大鼠心肌细胞中分离得到。嵌入到面板A显示了杆状心肌细胞扩散和分化。对心肌细胞还有一个特点的基础上，横纹肌肌动蛋白的表达（图B表示通过免疫荧光法检测和车道一组C示出典型印迹扫描一个代表图像）和丰富的SERCA2表达（图C泳道b）。氯曝光（100 ppm的15分钟）引起广泛的细胞死亡浸没培养物，以及对插入件（图D示出了代表性的显微照片）的细胞单层的破坏。胱天蛋白酶3/7发布（图E）在生长在插入，在4小时和24小时后的氯曝光心肌细胞的上清液作为媒体的文字说明也进行了测定。显示的值是平均值±SEM和*表示显著（P <0.05）差异为0 ppm的控制。
图2：在分化的人类呼吸道上皮气-液界面（ALI）的文化。人类呼吸道上皮的基底细胞是胶原涂层snapwells培养氯气暴露的影响 。 5天之后被去除根尖媒体。分化培养物（包括基础的，纤毛，柱状，以及杯状细胞中所示在顶部来氟米特插图面板A的吨面板）暴露于氯气（100或300ppm以下）处理30分钟。总开支比率进行测定，并更换培养基和细胞培养24小时。在24小时后TER再次进行测定，并收集心尖媒体对胱天蛋白酶释放测定和细胞膜固定用于免疫组织化学。开放的箭头A组部分2和3所示脱落上皮细胞层和黑色箭头表示在插入空格。在面板中的箭头的部分5显示了再生上皮。配件7，8，和9细胞增殖所评估的Ki-67的免疫染色。显示的值是平均值±SEM和*表示显著（P <0.05）差异为0 ppm的控制。
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Discussion
当一个人呼吸有毒化学进入肺部急性毒性暴露的最常见的类型出现。这些化学物质也可以迅速吸收到血液中，并可能影响其他器官，如大脑和心脏。利用动物模型各种药剂吸入毒性进行了研究和广泛报道，但是机制了解较少。这是开发有效的治疗的一个主要障碍。 体外照射系统的缺席的背后是缺乏机械的见解的一个主要原因。在这里，我们描述了心脏肌肉和呼吸道，研究吸入有毒的化学物质，如氯暴露影响的细胞培养模型。氯气与水的表面迅速反应形成盐酸和次氯酸3,11,12。氯还可以与活性氧簇（ROS）的结合，产生高活性的化合物，可能导致气道的关键蛋白质和酶的氧化表面13。研究使用水下文化可能只展示了产品，如次氯酸影响的情况下氯气而不是气体本身。曝光这里描述的人类呼吸道上皮细胞的分化ALI的文化将允许研究抽动，如氯，在没有水介质相似， 在体内发生什么细胞表面的直接相互作用。
采用原代大鼠心肌细胞，我们还描述了氯气暴露引起细胞快速死亡淹没的文化。这些细胞不能生长在ALI，因为他们不分化，并形成紧密连接。因此，我们还利用生长在插入了一层薄薄的媒体心肌细胞的汇合培养物。曝光这些细胞单层的氯证明膜破坏，并增加caspase发布提示凋亡可能起到一定的作用。
这项研究表明，吸入呼吸道（主要目标，可以通过阿里文化视角进行复制ES）以及器官如心脏不生长在ALI可以使用体外暴露系统进行研究。这些体外暴露模型可以很容易地适应评估等有毒化学物质吸入（国际信托）的影响。利用这些模型，我们预计提供毒性的详细机理的认识，并制定新的战略，以减轻与旅游业议会/氯有关的中毒事件，然后进一步评估它们在体内 。虽然，这些风险是持续时间短的曝光系统需要更好的复制细胞培养条件。暴露于气体，如氯气限制了使用湿度的，因为它可能会腐蚀设备。 ALI的文化可能会受到冲击如以前在我们的臭氧曝光系统14,15用来模拟呼吸。目前，我们正在朝这些方向。
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Acknowledgments
这项研究是由抵消计划，美国国立卫生研究院（NIH），办公室主任，以及环境卫生科学研究所（NIEHS）授权号码U54 ES015678（CWW）的支持。 SA也由儿童医院的矿业合作试点奖＃G0100394和儿童医院科罗拉多研究所研究试点奖＃G0100471的科罗拉多州/科罗拉多学院的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Chlorine | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 kit | Promega | G8091 | |
| Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode | World Precision Instruments | EVOM and STX2 | |
| Snapwell inserts | Corning | 07-200-708 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Corning | #352360 | |
| Polysulfone biocontainment chambers | BCU, Allentown Cage Equipment | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| Sarcomeric actin antibody | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 antibody | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 antibody | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa 488-conjugated secondary antibody | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs Ringer Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Lactated Ringer solution | Abott Laboratories | 7953 | |
| Donkey serum | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4-15% SDS-PAGE gels | Bio-Rad | 456-1083 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Peroxidase detection kit | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting media, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M8028 | |
| Laminin | BD biosciences | 354259 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
References
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