Summary
Ce protocole est conçu pour démontrer Procédé d'exposition de cultures cellulaires à des produits chimiques toxiques inhalés. Exposition des différenciée interface air-liquide (ALI) des cultures de cellules épithéliales des voies aériennes fournit un modèle unique de l'exposition des voies respiratoires à des gaz toxiques tels que le chlore. Dans ce manuscrit, nous décrivons effet de l'exposition au chlore sur les cultures à l'interface air-liquide de cellules épithéliales et de la culture submergée de cardiomyocytes. In vitro des systèmes d'exposition permettent études mécanistiques importantes pour évaluer les voies qui pourraient ensuite être utilisés pour développer de nouveaux agents thérapeutiques.
Abstract
Les cultures cellulaires sont indispensables pour développer et d'étudier l'efficacité d'agents thérapeutiques, en vue de leur utilisation dans des modèles animaux. Nous avons la capacité unique de modéliser les cellules de l'épithélium respiratoire humain et le muscle cardiaque bien différenciées. Cela pourrait être un outil précieux pour étudier les effets délétères des produits chimiques toxiques inhalés, tels que le chlore, qui peuvent normalement interagir avec les surfaces cellulaires, et former divers sous-produits lors de la réaction avec de l'eau, et la limitation de leurs effets dans des cultures submergées. Notre modèle en utilisant des cultures de cellules épithéliales des voies aériennes humaines bien différenciés à l'interface air-liqiuid contourne cette limitation ainsi que fournit l'occasion d'évaluer les mécanismes critiques de la toxicité des produits chimiques toxiques inhalés potentiels. Nous décrivons perte accrue de l'intégrité de la membrane, la caspase libération et la mort sur chimique toxique par inhalation tels que l'exposition au chlore. Dans cet article, nous proposons des méthodes pour modéliser l'exposition au chlore dans le cœur des mammifères et des voies respiratoires épithéliales caunes de la culture et des tests simples pour évaluer son effet sur ces types cellulaires.
Introduction
L'exposition à des produits chimiques toxiques inhalés (CIT) / gaz comme le chlore (Cl 2) demeure un problème de santé en cours dans les expositions accidentelles ainsi que dans leur utilisation potentielle comme un agent de menace chimique. Bien que les poumons sont la cible principale, les organes tels que le coeur et le cerveau sont également touchés 1-3. Modèles in vivo sont généralement utilisés pour les tests de toxicité de TIC, mais des essais in vitro pour l'évaluation de la toxicité est plus simple, plus rapide et plus rentable. En modèles in vitro permettent également une enquête approfondie des interactions agent de cellules qui peuvent être difficiles à évaluer in vivo. Ces systèmes in vitro dans l'exposition sont rares et, en outre, dans certains modèles classiques où les agents toxiques sont ajoutées au milieu de culture dans lequel les cellules sont immergées, les propriétés des agents peuvent changer en raison des interactions et liaison aux composants dans le milieu. Dans de tels scénarios cellulaires des systèmes de culture tels que l'interface air-liquide (ALI) des cultures de cellules primaires épithéliales des voies respiratoires humaines, proposés ici, qui peuvent être directement exposés à des agents gazeux pourrait être prometteur.
Les cellules épithéliales qui tapissent les voies respiratoires sont les premières lignes de défense contre les produits chimiques toxiques inhalés. L'épithélium des voies respiratoires humaine constitue une barrière physique entre la lumière et les cellules sous-jacentes dans le poumon et participe à la réaction du poumon. Il produit un certain nombre de cytokines et d'autres agents pro-et anti-inflammatoires ainsi que sécrète le liquide de surface mucus / des voies respiratoires (ASL) recouvrant l'épithélium. Une des limitations à immergé conventionnelle dans les systèmes de culture in vitro est également que l'ASL et de mucus qui couvre la surface épithéliale est enlevé ou dilués. Cela ne reflète pas l'état physiologique des cellules épithéliales pulmonaires qui sont exposés à l'air. Ainsi, un idéal dans le système in vitro pour les tests de toxicité TIC devrait reproduire cette architecture. Il ya un grand intérêt dans le développement rapide de dépistage méthodes qui prédisent la toxicité in vivo. Les cellules épithéliales cultivées à l'ALI différencier et avoir des structures et des fonctions bien différenciées par rapport aux cellules cultivées submergés et servir un modèle supérieur des voies respiratoires.
Dans cette étude, nous décrivons l'utilisation de l'air liquide interface culture de voies respiratoires humaines (trachéo-bronchique) des cellules épithéliales pour tester toxique par inhalation de gaz toxiques et de le comparer avec une culture cellulaire immergé de cardiomyocytes, donc étudier une autre cible importante de la toxicité.
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Protocol
1. Cultures Rat cardiomyocytes
- Toutes les expériences ont été réalisées selon des protocoles approuvés par le soin des animaux et l'utilisation comité institutionnel, IACUC.
- Obtenir des cardiomyocytes de rats du cœur (ventricules) de rats mâles (240-260 g) en utilisant des méthodes décrites précédemment 4. En bref, anesthésier les animaux en utilisant une injection intrapéritonéale de pentobarbital (100 mg / kg; confirmer l'anesthésie par la méthode de pincement de l'orteil), puis retirez le cœur en 10,0 ml, 1 mM de Ca 2 + contenant un tampon Krebs Ringer, pH 7,4.
- Rincer les coeurs 5-6x pour enlever le sang et ensuite passer à un + tampon Krebs Ringer Ca 2 gratuit contenant 0,02% et 0,06% protéase collagénase A (5,0 ml / coeur). Incuber les coeurs dans cette solution pendant 10 à 15 min à 37 ° C avec agitation occasionnelle.
- Après 10-15 minutes, laver la solution enzymatique avec un tampon de Ca 2 + libre Krebs Ringer à 5 min de plus. Libérer les cellules du tissu mou nousment une pipette de 25 ml à la pipette la suspension de haut en bas plusieurs fois.
- Séparer les cellules du tissu par filtration à travers une maille de nylon de 70 um et leur permettre de s'installer dans Ringer Krebs contenant 0,1 mM de Ca 2 +. Suspendre le culot cellulaire dans 1,0 ml de tampon Krebs Ringer contenant 0,2 mM de Ca 2 +.
- Superposer soigneusement sur 5,0 ml de 60 pg / ml d'albumine de sérum bovin, BSA, 15 ml dans des tubes de centrifugation, afin de séparer les cardiomyocytes à partir de nonmyocytes et leur permettre de se déposer pendant 30 minutes. Les cardiomyocytes sont plus lourdes et se déplacent vers le fond du tube. Retirez soigneusement les cellules surnageant et les médias. Répétez cette étape une fois pour purifier les cellules.
- Une transition graduelle de lavage (dans les étapes à l'aide de 0,25 mM, 0,5 mM, 0,75 mM, et mM de Ca 1,0 2 tampon + contenant) les myocytes ventriculaires / cardiomyocytes pour mM de Ca 2 + contenant du tampon 1,0 et remises en suspension dans du milieu ACCT constitué de milieu Eagle modifié par Dulbecco , DMEM containing de 2 mg / ml de BSA, 2 mM de L-carnitine, la créatine 5 mM, 5 mM de taurine, 100 UI / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine.
- Plaquer les cardiomyocytes dans un milieu ACCT à une densité de 100 à 150 cellules / mm 2 sur 100 mm ou 35 mm revêtues de laminine des boîtes de culture en plastique ou des lamelles couvre-objet 40 x 22 mm de verre pré-enduites avec de la laminine (1 mg / cm 2). Après 1 heure, laver la vaisselle avec 2,0 ml ACCT pour éliminer les cellules qui ne sont pas attachés. Ajouter 10,0 ml de milieu frais et incuber les cellules.
2. Interface air-liquide différencié (ALI) culture de cellules humaines Airway basales
- Obtention de tissus humains trachéo-bronchique de recherche sur les maladies d'échange national en vertu de l'Institutional Review Board protocoles approuvés. récolte cellulaire et effectuer la culture en utilisant une procédure de 5,6 publié. Cette procédure utilise des cultures de cellules car ils sont un modèle précis pour l'exposition par inhalation humaine à TIC, cependant, si nécessaire, on peut isoler et cultiver à ALI moutiliser et / ou de cellules épithéliales des voies aériennes chez le rat 7,8.
- En bref, faire de petits morceaux (~ ¼ pouce) du tissu après avoir retiré tous les noeuds lymphatiques et des tissus conjonctifs. Laver le tissu plusieurs fois dans une solution de Ringer lactate. Ajouter tissus dans un tube conique de 50 ml et ajouter une solution de protease (1% Protease/0.01% de la DNase dans un milieu minimal essentiel, MEM, tissu de rapport de fluide (01:10)).
- Agitez le tissu à 4 ° C pendant une nuit. Mettre fin à la dissociation du tissu par l'addition de sérum bovin fœtal à 10%. Racler la surface de l'épithélium avec un scalpel chirurgical et recueillir les cellules par centrifugation (2000 rpm pendant 10 min).
- Cellules de la plaque au passage un sur snapwells revêtus de collagène dans un milieu spécial ALI préparés comme décrit en détail par Foucher et al 9. 5 jours de culture avant de changer d'interface air-liquide (ALI) en supprimant les médias apical.
- Alimenter les cellules en utilisant les médias ALI tous les deux jours et permettent aux cellules de se différencier pour 2-3 semaines supplémentaires (observer de nombreux cils battant et la sécrétion de mucus) avant d'effectuer l'exposition. Laver la surface apicale avec du PBS chaud ainsi que des changements dans les médias.
3. Chlore exposition
- Contenir le système d'exposition au chlore (CES) dans une hotte chimique qualifié avec une vitesse nominale de fonctionnement de 100 pieds par minute qui fournit l'enceinte de confinement secondaire nécessaire pour éviter l'exposition du personnel en cas de fuites accidentelles de chlore.
- Faire fonctionner le système sous une légère pression positive (0,5 pouces d'eau). L'air sec est amené à 15 L / min et à un niveau approprié de chlore est introduit pour atteindre la concentration désirée en chlore final. Les chambres disposent d'un couvercle de verrouillage avec 4 mini serrures de BCU et une dureté joint en silicone bas pour assurer l'étanchéité de pression.
- Fournir un mélange Cl 2 par un contrôleur de débit massique. La CES utilise une bouteille de gaz comprimé contenant 1,0% de Cl 2 dans de l'azote sec.
- Réguler le débit d'air de dilution à l'aide duconçu sur mesure panneau de commande et de réglementer de façon similaire la concentration Cl 2 livré aux chambres d'exposition. Une pompe d'échantillonnage de faible volume extrait de l'échappement à partir des chambres dans un analyseur de chlore pour surveiller les concentrations qui sont ensuite enregistrées sur un enregistreur de données connecté à l'analyseur.
- Mesurer les vitesses d'écoulement à l'intérieur des chambres, avant l'exposition à l'aide d'un débitmètre pour assurer les frais de port et d'échappement égales.
- Préparer les cultures de cellules d'exposition en enlevant les médias surnageant et ajouter du milieu frais (médias basolatérales dans les cultures ALI). Prétraitements éventuels avec les agents pourraient être effectuées à cette époque.
- Exposer les cultures ALI cellules épithéliales des voies aériennes à Cl 2 gaz (50, 100 ou 300 ppm pendant 30 min) dans les deux chambres étanches polysulfone de confinement biologique. Les cardiomyocytes (cultures submergées ou sur les membranes confluentes) sont exposées à 50 ou 100 ppm de Cl 2 pendant 15 min.
- Après l'exposition vider les chambres à air jusqu'à ce que le Cl 2 niveau tombe en dessous de 1 ppm, et peut être ouverte en toute sécurité pour éliminer les cellules (à moins de 5 min).
4. Transepitheliale résistance électrique (TER) Mesure
- Mesurer le TER de l'air liquide interface, ALI, cultures en utilisant une voltohmmeter épithéliale avec une paire de chlorure électrodes "baguettes" argent.
- Equilibrer l'électrode de baguettes dans le ALI médias 15 min avant utilisation.
- Ajouter un média chaud au apicale (1,0 ml) et basolatéral (2,0 ml) et mesurer la surface TER en utilisant les électrodes de baguettes de la voltohmmeter.
- Trempez le bras le plus court de l'électrode dans les médias apical et le bras le plus long dans les médias basolatérales. Cliquez sur le bouton «mesure» sur la voltohmmeter pour évaluer la résistance électrique.
- Le voltohmmeter a la possibilité de mesurer ohms ou k ohms. Soustraire la résistance à travers un support de culture acellulaire à partir de la résistance mesurée aux bornes de chaque couche de cellules pour donner le transrésistance épithéliale (TER).
5. Caspase Mesure
- Ajouter des milieux frais ALI (2,0 ml) à la post-exposition de la surface basolatérale et incuber la cellule à la température ambiante. Recueillir milieu surnageant à 4 et 24 heures.
- Mesurer la caspase 3/7 activité dans les surnageants de média en utilisant une caspase commercial 3/7 de la trousse de dosage.
6. Western Blot et Immunocytochemistry
- Effectuer des transferts Western utilisant des lysats cellulaires comme décrit précédemment 10. Suspendre le lysat de protéines (20 pg) dans 5x tampon réduite de l'échantillon et faire bouillir pendant 5 min. Soumettre le lysat de protéine à une SDS-PAGE (4-15%) et de transférer les protéines séparées sur une membrane de nitrocellulose par transfert électrophorétique.
- Bloquer la liaison non spécifique par incubation de la membrane avec 5% de lait dans du tampon de lavage (PBS + 0,1% de détergent) et de la sonde les membranes avec des anticorps primaires contre l'actine ou SERCA2 sarcomère à 1:1000 dilution, pendant une nuit à 4 ° C. Ensuite, laver et incuber les membranes avec les anticorps secondaires conjugués à la peroxydase et de développer respectifs pour la détection comme décrit ci-dessus 10 en utilisant le kit de détection de la peroxydase du commerce.
- Par immunocytochimie traitent des cellules vivantes cultivées sur des inserts ou des lamelles couvre-objet en verre dans des plaques de 6 puits avec 0,4% de Triton-X-100 dans du tampon de citrate de sodium à 10 mM pendant 20 min après le rinçage avec du PBS.
- Bloquer la liaison non spécifique en traitant les cellules avec du sérum d'âne à 5% pendant 20 min, et ensuite incuber les cellules avec de l'IgG non spécifique ou spécifique des anticorps primaires individuels à l'actine sarcomère ou Ki-67.
- Laver les cellules avec du PBS et incubation avec des anticorps secondaires conjugués fluorescents pour détecter l'anticorps primaire et un colorant nucléaire (1 ug / ml de DAPI).
- Laver avec du PBS et monter des lamelles en utilisant un milieu de montage commerciales.
- Visualisez la coloration en utilisant un microscope à fluorescence.
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Representative Results
Tige principale cardiomyocytes forme attachent sur des matrices de laminine et se propagent et se différencient en cultures confluentes (figure 1A et son encart). Ces cellules ont été en outre caractérisés sur la base de l'actine et de l'expression de sarcomère SERCA2 (Figures 1B et 1C). cardiomyocytes de rat sont très sensibles à la toxicité du chlore en tant que 15 minutes d'exposition à 100 ppm de chlore a causé des arrondissement des cellules et la mort dans des cultures submergées et la rupture des couches confluentes sur des cellules cultivées sur des membranes revêtues de laminine (Figure 1D). Il a également été renforcée mort cellulaire par apoptose, comme indiqué par la caspase 3/7 de presse dans les cardiomyocytes cultivés sur des inserts (figure 1E).
Exposition des différenciée épithélium respiratoire humain (Figure 2, encadré au panneau 1, montrant une section transversale de la culture cellulaire insère avec colonnes, ciliées et cellules caliciformes) au chlore causé l'envasement et liftion des membranes cellulaires à la fois faible (100 ppm) et (300 ppm) des concentrations élevées (Figure 2 Panneau A2 et A3). Dommages causés par de faibles concentrations de chlore a été rapidement inversée (Figure 2 panneau A5), cependant, les cellules exposées à des concentrations de chlore supérieures avaient retardé ou pas de capacité de réparation (Figure 2 panneau A6), comme indiqué par l'inspection visuelle ainsi que l'évaluation de la prolifération cellulaire par Ki-67 coloration (figure 2 panneau A9). Résistance électrique épithéliale, les mesures de TER trans et de l'activité de la caspase encore confirmé ces résultats et fournir des preuves en cas de perte de l'intégrité de la membrane et de la mort cellulaire par apoptose lors de l'exposition au chlore (figure 2, tableau B et C). Ainsi, nos études décrivent le développement d'un Cl 2 système d'exposition in vitro qui provoque la perte de l'intégrité de la membrane et de la mort de l'épithélium des voies aériennes et de cardiomyocytes. Cet effet ne peut pas être due à des changements de pH non physiologiques dans les cardiomyocytes commele pH du milieu après l'exposition au chlore a été maintenue à ~ 7,4, telle que mesurée à l'aide d'un pH-mètre dans la post-exposition de média collecté.
Figure 1. L'isolement des cardiomyocytes de rat et l'exposition à des cardiomyocytes de rats chlore. Ont été isolés comme décrit dans le protocole et étalées sur des boîtes en plastique laminine (panneau A, une image microscopique de la lumière représentant) ou inserts revêtues de laminine. Encastrés au panneau A montre une tige en forme de cardiomyocytes propagation et la différenciation. Les cardiomyocytes ont également été caractérisées sur la base de l'expression de l'actine sarcomérique (panneau B montrant une image représentant détectée par immunofluorescence et de file d'un panneau C montre un balayage représentant de Western blot) et l'expression de SERCA2 abondante (panneau C voie b). exposition de chlore (100 ppm de 15 min) a causé des mort cellulaire danscultures immergées, ainsi que les perturbations de la monocouche de cellules sur les inserts (panneau D montre les microphotographies représentatives). Caspase 3/7 de presse (panneau E) dans les médias de surnageant de cardiomyocytes cultivés sur des inserts, à 4 h et 24 h après l'exposition au chlore a également été mesurée comme décrit dans le texte. Les valeurs indiquées sont la moyenne ± SEM et * indique significative (p <0,05) de 0 contrôle ppm.
Figure 2. Effet de l'exposition de chlore sur différenciée voies respiratoires humaines épithéliales interface air-liquide (ALI). Cultures cellules basales de l'épithélium des voies respiratoires humaines ont été cultivées sur revêtues de collagène snapwells. Après le jour 5 médias apicale a été retiré. Cultures différenciées (constitués de base, ciliées, colonnes et cellules caliciformes comme indiqué dans l'encadré en haut left panneau de panneau A) ont été exposés à du chlore (100 ou 300 ppm) pendant 30 min. Le TER a été mesurée et les médias a été changé et les cellules incubées pendant 24 heures. À 24 h TER a été mesuré à nouveau et médias apicale ont été recueillies pour la mesure de la caspase de libération et les membranes cellulaires ont été fixés pour l'immunohistochimie. La flèche ouvert dans les parties A du panneau 2 et 3 spectacles muées off couche épithéliale et flèches noires montrent des espaces vides sur l'insert. La flèche dans le panneau Une partie 5 montre épithélium régénéré. Parties 7, 8, et 9 montrent la prolifération cellulaire tels qu'évalués par Ki-67 immunologique. Les valeurs indiquées sont la moyenne ± SEM et * indique significative (p <0,05) de 0 contrôle ppm.
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Discussion
Le type le plus commun des expositions toxiques aigus se produit lorsque l'on respire un produit chimique toxique dans les poumons. Ces produits chimiques peuvent aussi être prises rapidement dans la circulation sanguine et peuvent avoir un impact d'autres organes tels que le cerveau et le cœur. Toxicité à l'inhalation de divers agents utilisant des modèles animaux sont étudiés et largement rapporté, mais les mécanismes sont moins bien compris. Il s'agit d'un obstacle majeur dans le développement de thérapies efficaces. Absence de systèmes in vitro dans l'exposition est une des principales raisons derrière le manque de connaissances mécaniques. Nous décrivons ici les modèles de culture de cellules de muscle cardiaque et des voies respiratoires afin d'étudier l'impact des produits chimiques inhalés toxiques tels que l'exposition au chlore. Le chlore réagit rapidement avec les surfaces aqueux pour former de l'acide chlorhydrique et hypochloreux 3,11,12. Le chlore peut aussi se combiner avec les espèces réactives de l'oxygène (ROS) pour produire des composés hautement réactifs qui peuvent conduire à l'oxydation des protéines et des enzymes essentielles de la voie aérienne des surfaces 13. Étudesen utilisant des cultures submergées ne peut démontrer les effets de par des produits tels que HOCl en cas de chlore plutôt que le gaz lui-même. L'exposition des cultures ALI différenciées des cellules épithéliales des voies aériennes humaines décrites ici permettrait étude des interactions directes de TIC tels que le chlore avec des surfaces de cellules en l'absence de milieux aqueux semblables à ce qui se passe in vivo.
Utilisation des cardiomyocytes primaires de rat, nous décrivons également que l'exposition au chlore provoque une mort cellulaire rapide dans des cultures immergées. Ces cellules sont incapables de croître à ALI car ils ne polarisent et forment des jonctions serrées. Par conséquent, nous avons également utilisé des cultures confluentes de cardiomyocytes cultivés sur des inserts avec une fine couche de médias. L'exposition de ces monocouches de cellules à chlore démontré rupture de la membrane et une libération accrue de la caspase suggérant l'apoptose peut jouer un rôle.
Cette étude démontre que les voies respiratoires (la cible principale de l'inhalation qui peut être reproduit par ALI cultures) ainsi que les organes tels que le cœur qui ne se développe pas à ALI peuvent être étudiés en utilisant des systèmes d'exposition in vitro. Ces modèles in vitro de l'exposition peuvent être facilement adaptés pour évaluer les effets d'autres produits chimiques inhalés toxiques (CIT). En utilisant ces modèles, nous prévoyons de fournir une compréhension mécaniste détaillée des toxicités et développer de nouvelles stratégies pour atténuer les manifestations toxiques associés à TIC / chlore, puis évaluer les autre in vivo. Bien que ces expositions sont de courte durée du système d'exposition a besoin de mieux reproduire les conditions de culture des cellules. L'exposition à des gaz tels que le chlore limite l'utilisation de l'humidité telle qu'elle peut corroder le dispositif. Les cultures ALI pourraient être secoué pour simuler la respiration comme précédemment utilisés dans notre système de 14,15 exposition à l'ozone. Nous travaillons actuellement dans ce sens.
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Acknowledgments
Cette recherche est soutenue par le Programme CounterACT, National Institutes of Health (NIH), Bureau du Directeur, et l'Institut national des sciences de la santé environnementale (NIEHS) Nombre Grant U54 ES015678 (MTE). SA est également soutenue par l'hôpital pour enfants de Colorado / Colorado School of Mines Collaboration Award pilote # G0100394 et Colorado Hospital Research Institute Award pilote n ° de G0100471 pour enfants.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Chlorine | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 kit | Promega | G8091 | |
| Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode | World Precision Instruments | EVOM and STX2 | |
| Snapwell inserts | Corning | 07-200-708 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Corning | #352360 | |
| Polysulfone biocontainment chambers | BCU, Allentown Cage Equipment | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| Sarcomeric actin antibody | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 antibody | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 antibody | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa 488-conjugated secondary antibody | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs Ringer Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Lactated Ringer solution | Abott Laboratories | 7953 | |
| Donkey serum | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4-15% SDS-PAGE gels | Bio-Rad | 456-1083 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Peroxidase detection kit | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting media, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M8028 | |
| Laminin | BD biosciences | 354259 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
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