Summary
Questo protocollo è progettato per dimostrare metodo di esposizione di colture cellulari a sostanze chimiche tossiche inalate. Esposizione di differenziata interfaccia aria-liquido (ALI) colture di cellule epiteliali delle vie aeree fornisce un modello unico di esposizione vie aeree per gas tossici quali cloro. In questo manoscritto descriviamo effetto dell'esposizione cloro su colture di interfaccia aria-liquido di cellule epiteliali e coltura sommersa di cardiomiociti. Sistemi di esposizione in vitro consentono importanti studi meccanicistici per valutare percorsi che possono poi essere utilizzati per sviluppare nuovi agenti terapeutici.
Abstract
Le colture cellulari sono indispensabili per sviluppare e studiare l'efficacia di agenti terapeutici, prima del loro utilizzo in modelli animali. Abbiamo la capacità unica di modellare cellule dell'epitelio delle vie respiratorie umane e del muscolo cardiaco ben differenziate. Questo potrebbe essere uno strumento prezioso per studiare gli effetti deleteri delle sostanze chimiche tossiche per via inalatoria, come il cloro, che può normalmente interagire con le superfici delle cellule e formare vari sottoprodotti su reagendo con l'acqua, e limitare i loro effetti nelle culture sommerse. Il nostro modello utilizzando colture di cellule epiteliali delle vie respiratorie umane ben differenziati a interfaccia aria-liqiuid aggira questa limitazione, nonché offre la possibilità di valutare i meccanismi critici di tossicità delle sostanze chimiche potenzialmente tossiche per via inalatoria. Descriviamo una maggiore perdita dell'integrità della membrana, il rilascio caspasi e morte su tossica chimica per via inalatoria come l'esposizione al cloro. In questo articolo, vi proponiamo i metodi per modellare l'esposizione cloro nel cuore dei mammiferi e delle vie respiratorie epiteliale cells di cultura e di semplici test per valutare il suo effetto su questi tipi di cellule.
Introduction
Esposizione a sostanze chimiche tossiche inalatoria (tic) / gas come cloro (Cl 2) rimane un problema sanitario in corso in esposizioni accidentali che nel loro uso potenziale come agente minaccia chimica. Anche se i polmoni sono l'obiettivo primario, organi come cuore e cervello sono anche colpiti 1-3. Modelli in vivo sono generalmente utilizzati per la tossicità di test da tic, ma in vitro per la valutazione della tossicità sono più semplici, più veloci e più conveniente. In modelli in vitro consentono anche vasto studio delle interazioni agente-cellulari che possono essere difficili da valutare in vivo. Tali sistemi di esposizione in vitro sono rari e inoltre, in alcuni modelli convenzionali dove gli agenti tossici vengono aggiunti al mezzo di coltura in cui le cellule sono sommersi, le proprietà degli agenti possono cambiare a causa di interazioni di legame e dai componenti del mezzo. In tali scenari sistemi di coltura cellulari come interfaccia aria-liquido (ALI) colture di cellule primarie umane epiteliali delle vie aeree, qui proposte, che possono essere direttamente esposti ad agenti gassosi potrebbero essere promettenti.
Cellule epiteliali che rivestono le vie respiratorie sono le prime linee di difesa contro le sostanze chimiche tossiche inalate. L'epitelio delle vie aeree umano forma una barriera fisica tra il lume e le celle sottostanti nel polmone e partecipa alla risposta del polmone. Si produce una serie di citochine e altri agenti pro e anti-infiammatori e secerne muco liquido superficie / vie aeree (ASL) che copre l'epitelio. Una delle limitazioni nella convenzionale sommerso in sistemi di coltura in vitro è anche che l'ASL e muco che copre la superficie epiteliale viene rimosso o diluite. Questo non riflette lo stato fisiologico delle cellule epiteliali del polmone che sono esposte all'aria. Così, un sistema ideale in vitro per test di tossicità TIC dovrebbe replicare questa architettura. C'è grande interesse per lo sviluppo rapido di screening metodi che predicono tossicità vivo. Le cellule epiteliali coltivate nella ALI differenziare e hanno strutture e funzioni ben differenziati rispetto alle cellule coltivate sommerse e servire un modello superiore delle vie respiratorie.
In questo studio, descriviamo l'uso della cultura aria-liquido-interfaccia vie respiratorie umane (tracheobronchiale), le cellule epiteliali per testare la tossicità velenoso gas inalato e lo confrontiamo con una cultura di cellule sommerso di cardiomiociti, quindi studiando un altro obiettivo importante di tossicità.
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Protocol
1. Culture Rat cardiomiociti
- Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dalla cura degli animali e l'uso comitato istituzionale, IACUC.
- Ottenere cardiomiociti di ratto dal cuore (ventricoli) di ratti maschi (240-260 g) utilizzando metodi descritti in precedenza 4. Brevemente, anestetizzare animali con una iniezione intraperitoneale di pentobarbital (100 mg / kg; confermare anestesia metodo pizzico piedi) e quindi rimuovere cuori in 10,0 ml, Ca 2 + contenente tampone Krebs Ringer, pH 7,4 1 mM.
- Sciacquare i cuori 5-6x per rimuovere il sangue e poi passare a un buffer di Ca 2 + libero Krebs Ringer contenente 0,02% della proteasi e 0,06% collagenasi A (5.0 ml / cuore). Incubare i cuori in questa soluzione per 10-15 minuti a 37 ° C con agitazione intermittente.
- Dopo 10-15 minuti, lavare la soluzione enzimatica con tampone di Ca 2 + libero Krebs Ringer per un ulteriore 5 min. Rilasciare le cellule dal tessuto flaccido noizione di una pipetta 25 ml pipettando sospensione su e giù parecchie volte.
- Separare le cellule dal tessuto per filtrazione attraverso una rete di nylon 70 micron e permettono loro di stabilirsi in tampone Krebs Ringer contenente 0,1 mM Ca 2 +. Sospendere il pellet di cellule in 1,0 ml di tampone Krebs Ringer contenente 0,2 mM Ca 2 +.
- Strato con cautela over 5,0 ml 60 mg / ml di albumina sierica bovina, BSA, in 15 ml provette per centrifuga per separare cardiomiociti da nonmyocytes e permettere loro di accontentarsi di 30 min. I cardiomiociti sono più pesanti e si portano sul fondo della provetta. Rimuovere accuratamente le cellule surnatante e dei media. Ripetere questo passaggio una volta per purificare ulteriormente le cellule.
- A poco a poco la transizione da lavare (in gradini con 0,25 mm, 0,5 mm 0,75 mm e 1,0 mM Ca 2 + contenente tampone) le ventricolari miociti / cardiomiociti a 1,0 mM Ca 2 + contenente tampone e risospeso in mezzo ACCT composto da Dulbecco Modified Eagle Medium , DMEM containing 2 mg / ml BSA, 2 mM L-carnitina, creatina 5 mM, taurina 5 mM, 100 IU / ml di penicillina, e 100 pg / ml streptomicina.
- Piastra cardiomiociti in ACCT mezzo ad una densità da 100 a 150 cellule / mm 2 sul 100 o 35 mm laminina capsule di Petri di plastica o 40 x 22 mm coprioggetto di vetro rivestiti con laminina (1 mg / cm 2) rivestite. Dopo 1 ora, lavare i piatti con 2,0 ml ACCT per rimuovere le cellule che non sono collegati. Aggiungere 10,0 ml di mezzo fresco e incubare le cellule.
2. Differenziata aria-liquido Interface (ALI) La cultura di cellule umane Airway epiteliali basali
- Procurarsi tessuti tracheobronchiale umani da National Disease Research Interchange sotto Institutional Review Board protocolli approvati. La raccolta delle cellule ed eseguire cultura utilizzando una procedura 5,6 pubblicata. Questa procedura utilizza colture di cellule in quanto sono un preciso modello per le esposizioni inalatorie umana verso TIC, tuttavia, se necessario, si può isolare e crescere a mo ALIutilizzare e / o cellule epiteliali delle vie aeree di ratto 7,8.
- In breve, fare piccoli pezzi (~ ¼ pollice) del tessuto dopo aver rimosso tutti i nodi del tessuto connettivo e linfonodi. Lavare il tessuto più volte in soluzione di Ringer lattato. Aggiungere tessuti in una provetta da 50 ml e aggiungere la soluzione di proteasi (1% Protease/0.01% DNasi in terreno minimo essenziale, MEM, tessuto a rapporto fluido (1,10)).
- Muovere il tessuto a 4 ° C per tutta la notte. Terminare la dissociazione del tessuto con l'aggiunta di siero bovino fetale al 10%. Raschiare la superficie epiteliale con un bisturi chirurgico e raccogliere le cellule per centrifugazione (2000 rpm per 10 min).
- Cellule piastra a passaggio uno snapwells collagene rivestite in mezzo speciale ALI preparati come descritto in dettaglio da Fulcher et al 9. Culture per 5 giorni prima di cambiare all'interfaccia aria-liquido (ALI) rimuovendo i media apicali.
- Nutrire le cellule utilizzando mezzi ALI ogni giorno si alternano e permettono alle cellule di differenziarsi per ulteriori 2-3 settimane (osservare numerose ciglia battitura e secrezione di muco) prima di eseguire le esposizioni. Lavare la superficie apicale con il caldo PBS con i cambiamenti dei media.
3. Cloro esposizione
- Contenere il sistema di esposizione cloro (CES) all'interno di una cappa chimica qualificato con velocità frontale operativa di 100 fpm che fornisce il contenimento secondario necessaria per evitare l'esposizione del personale in caso di perdite accidentali di cloro.
- Utilizzare il sistema sotto una leggera pressione positiva (0,5 pollici di acqua). Aria secca viene alimentata a 15 L / min e un adeguato livello di cloro viene alimentato per raggiungere la concentrazione di cloro finale desiderata. Le camere hanno un coperchio di chiusura con 4 mini serrature BCU e un basso durometro guarnizione siliconica per realizzare la tenuta a pressione.
- Consegnare la miscela Cl 2 attraverso un controller di portata massica. Il CES utilizza una bombola di gas compresso contenente 1,0% Cl 2 in azoto secco.
- Regolare il flusso d'aria di diluizione con l'progettato su misura del pannello di controllo e, analogamente, regolare la concentrazione di Cl 2 consegnato alle camere di esposizione. Una pompa di campionamento a volume basso tira scarico dalle camere in un analizzatore di cloro per monitorare le concentrazioni che vengono poi registrati su un registratore di dati collegato all'analizzatore.
- Misurare le portate all'interno delle camere di prima dell'esposizione utilizzando un misuratore di flusso per assicurare parità di tassi di consegna e di scarico.
- Preparare le colture cellulari per l'esposizione rimuovendo il materiale surnatante e l'aggiunta di mezzi freschi (supporti basolaterali nelle culture ALI). Tutti i pretrattamenti con agenti potrebbero essere eseguite in questo momento.
- Esporre le colture ALI di cellule epiteliali delle vie aeree a Cl 2 gas (50, 100, o 300 ppm per 30 min) nelle due camere polisulfone biocontenimento sigillati. I cardiomiociti (immersi o culture sulle membrane confluente) sono esposti per 50 o 100 ppm Cl 2 per 15 min.
- Dopo l'esposizione irrigare le camere con aria fino alla Cl 2 livello scende al di sotto di 1 ppm e può essere aperta in modo sicuro per rimuovere le cellule (entro 5 minuti).
4. Transepiteliale resistenza elettrica (TER) Misura
- Misurare il TER di aria-liquido-interfaccia, ALI, culture usando un voltohmmeter epiteliale con un paio di argento cloruro elettrodi "bacchette".
- Equilibrare l'elettrodo bacchette nel ALI mezzi 15 minuti prima dell'uso.
- Aggiungi mezzi di caldo al apicale (1,0 ml) e basolaterale (2,0 ml) di superficie e misurare la TER utilizzando gli elettrodi bacchette del voltohmmeter.
- Immergere il braccio più corto del elettrodo in apicali e il braccio più lungo nei media basolaterale. Fare clic sul pulsante 'misura' sul voltohmmeter per valutare la resistenza elettrica.
- Il voltohmmeter ha la possibilità di misurare ohm o ohm k. Sottrarre la resistenza attraverso un supporto di coltura privo di cellule dalla resistenza misurata su ogni strato di cellule a cedere il transresistenza epiteliale (TER).
5. Caspase misura
- Aggiungere mezzi freschi ALI (2,0 ml) alla superficie basolaterale post esposizione e incubare la cella a temperatura ambiente. Raccogliere i media surnatante a 4 e 24 ore.
- Misurare caspasi 3/7 attività nei surnatanti Media mediante una caspasi commerciale 3/7 kit di analisi.
6. Western Blot e Immunocytochemistry
- Eseguire western blot utilizzando lisati cellulari come descritto in precedenza 10. Sospendere il lisato proteico (20 mg) a 5x tampone campione ridotto e far bollire per 5 min. Sottoporre il lisato proteico di SDS-PAGE (4-15%) e trasferire le proteine separate da una membrana di nitrocellulosa blotting elettroforetico.
- Bloccare il legame non specifico incubando la membrana con 5% di latte in tampone di lavaggio (PBS + 0,1% di detergente) e sondare le membrane con anticorpi primari contro SERCA2 o actina sarcomerica a 1:1000 diluizione, overnight a 4 ° C. Avanti, lavare e incubare le membrane con i rispettivi anticorpi secondari coniugati con perossidasi e sviluppare per il rilevamento come descritto in precedenza 10 utilizzando kit per il rilevamento perossidasi commerciale.
- Per immunocitochimica trattano cellule vive coltivate su inserti o vetrini in piastre da 6 pozzetti con 0,4% Triton-X-100 in 10 mM tampone citrato di sodio per 20 minuti dopo risciacquo con PBS.
- Blocco legame non specifico trattando le cellule con siero asino 5% per 20 minuti, e poi incubare le cellule con IgG non specifiche o di singoli anticorpi primari specifici per actina sarcomerica o Ki-67.
- Lavare le cellule con PBS e incubare con anticorpi secondari coniugati fluorescenti per rilevare l'anticorpo primario e un colorante nucleare (1 mg / ml DAPI).
- Lavare con PBS e montare coprioggetto utilizzando un mezzo di montaggio commerciali.
- Visualizza la colorazione utilizzando un microscopio a fluorescenza.
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Representative Results
Cardiomiociti forma di bastoncello primaria attaccano su matrici laminina e si diffondono e si differenziano in colture confluenti (Figure 1A e il suo inserto). Queste cellule sono state ulteriormente caratterizzate in base actina sarcomerica ed espressione SERCA2 (Figure 1B e 1C). Cardiomiociti di ratto sono molto sensibili alla tossicità del cloro come 15 minuti di esposizione a 100 ppm di cloro causato ingenti arrotondamento e morte cellulare nelle culture sommerse e interruzione di strati confluenti su cellule coltivate su laminina rivestite con membrane (Figura 1D). C'era anche migliorato la morte cellulare per apoptosi, come indicato dalla caspasi 3/7 uscita in cardiomiociti coltivati su inserti (Figura 1E).
Esposizione di differenziata epitelio delle vie aeree umano (Figura 2, incasso per pannello 1 mostra una sezione trasversale di coltura cellulare inserti con colonnare, ciliato e calice celle) al cloro causato desquamazione e lifting delle membrane cellulari sia a bassa (100 ppm) e (300 ppm) concentrazioni elevate (Figura 2 Pannello A2 e A3). Danni da basse concentrazioni di cloro è stato rapidamente invertito (Figura 2 pannello A5), tuttavia, le cellule esposte a concentrazioni di cloro superiori aveva nessuna capacità di riparazione (Figura 2 pannello A6) come mostrato mediante ispezione visiva, così come la valutazione della proliferazione cellulare da Ki-67 ritardata o colorazione (Figura 2 pannello A9). Trans epiteliale resistenza elettrica, misure TER e l'attività delle caspasi ulteriormente confermato questi risultati e forniscono la prova per la perdita dell'integrità della membrana e la morte cellulare per apoptosi in caso di esposizione al cloro (Figura 2, pannello B e C). Così i nostri studi descrivono lo sviluppo di un sistema di esposizione Cl 2 in vitro che causa la perdita di integrità della membrana e morte di epitelio delle vie aeree e cardiomiociti. Questo effetto può non essere dovuto a cambiamenti non fisiologici di pH nei cardiomiociti comeil pH dei media dopo l'esposizione al cloro è stata mantenuta a ~ 7,4 come misurato utilizzando un pHmetro nel postexposure media raccolti.
Figura 1. Rat isolamento cardiomiociti e l'esposizione di cardiomiociti di ratto cloro. Stati isolati come descritto nel protocollo e placcato in plastica piatti laminina rivestite (pannello A, una immagine al microscopio ottico rappresentante) o inserti laminina rivestito. Incasso per pannello A mostra un cardiomiociti forma di asta diffusione e differenziazione. I cardiomiociti sono stati caratterizzati in base all'espressione actina sarcomerica (pannello B mostra un'immagine rappresentativa rilevata mediante immunofluorescenza e di corsia un pannello C mostra una scansione rappresentante western blot) ed espressione SERCA2 abbondante (pannello C corsia b). Esposizione cloro (100 ppm 15 min) causato ingenti morte cellulare incolture sommerse e interruzione del monostrato cellulare sugli inserti (pannello D mostra le microfotografie rappresentativi). Caspasi 3/7 rilascio (pannello E) nei mezzi supernatante di cardiomiociti coltivati su inserti, a 4 ore e 24 ore di esposizione cloro post è stato inoltre misurato come descritto nel testo. I valori indicati sono media ± SEM e * indica significativo (p <0,05), differenza 0 controllo ppm.
Figura 2. Effetto dell'esposizione cloro sulla differenziata epiteliali delle vie respiratorie umane interfaccia aria-liquido (ALI) colture. Cellule basali epiteliali delle vie respiratorie dell'uomo erano coltivate su collagene rivestito snapwells. Dopo 5 giorni il supporto apicale è stato rimosso. Culture differenziate (costituiti basale, ciliate, colonnare, e calice cellule, come mostrato nel riquadro in alto left pannello di pannello A) sono stati esposti al cloro (100 o 300 ppm) per 30 min. Il TER è stato misurato e media è stato cambiato e le cellule incubate per 24 ore. A 24 ore TER è stato misurato di nuovo e multimediale apicale è stato raccolto per la misurazione rilascio caspasi e le membrane cellulari sono stati fissati per immunoistochimica. La freccia aperto nelle parti A pannelli 2 e 3 spettacoli scrollata via strato epiteliale e frecce nere mostrano spazi vuoti sul foglietto. La freccia nel pannello A parte 5 mostra dell'epitelio rigenerato. Parti 7, 8 e 9 mostrano proliferazione cellulare, come valutato dal Ki-67 immunoistochimica. I valori indicati sono media ± SEM e * indica significativo (p <0,05), differenza 0 controllo ppm.
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Discussion
Il tipo più comune di esposizioni tossiche acuta si verifica quando si respira una sostanza chimica velenosa nei polmoni. Queste sostanze chimiche possono anche essere rapidamente assorbiti nel flusso sanguigno e possono influenzare altri organi come il cervello e il cuore. Tossicità per inalazione di vari agenti utilizzando modelli animali è stata studiata e riportata ampiamente, ma i meccanismi sono meno conosciuti. Questo è un grande ostacolo nello sviluppo di terapie efficaci. Assenza di sistemi di esposizione in vitro è la ragione principale dietro la mancanza di idee meccanicistiche. Qui si descrive modelli di coltura di cellule del muscolo cardiaco e delle vie aeree per studiare l'impatto delle sostanze chimiche tossiche inalate come l'esposizione cloro. Il cloro reagisce rapidamente con superfici acquose per formare acido cloridrico e ipocloroso 3,11,12. Il cloro può anche combinare con le specie reattive dell'ossigeno (ROS) per la produzione di composti altamente reattivi che possono portare a ossidazione delle proteine critici e gli enzimi delle vie respiratorie superfici 13. Studiusando colture sommerse può dimostrare solo effetti di prodotti quali HOCl in caso di cloro piuttosto che il gas stesso. Esposizione di culture ALI differenziate di cellule epiteliali delle vie aeree umane qui descritte consentirebbe studio delle interazioni dirette di tic come cloro con superfici cellulari in assenza di mezzi acquosi simili a quanto accade in vivo.
Utilizzo di cardiomiociti di ratto primarie, anche noi descriviamo che l'esposizione al cloro provoca la morte cellulare rapida nelle culture sommerse. Queste cellule sono in grado di crescere a ALI quanto non polarizzano e formano giunzioni strette. Pertanto, abbiamo anche utilizzato colture confluenti di cardiomiociti coltivati su inserti con un sottile strato di supporto. L'esposizione di questi monostrati cellulari di cloro dimostrato rottura della membrana e aumento del rilascio delle caspasi suggerendo l'apoptosi può svolgere un ruolo.
Questo studio dimostra che le vie aeree (l'obiettivo primario di inalazione che può essere replicato da ALI culturEs) e gli organi quali cuore che non crescono in ALI possono essere studiate usando in sistemi di esposizione in vitro. Questi modelli in vitro di esposizione in possono essere facilmente adattati per valutare gli effetti di altre sostanze chimiche tossiche per via inalatoria (IAT). L'utilizzo di questi modelli ci aspettiamo di fornire dettagliata comprensione meccanicistica delle tossicità e di sviluppare nuove strategie per attenuare gli eventi tossici associati TIC / cloro e poi valutare ulteriormente in vivo. Anche se, queste esposizioni sono di breve durata al sistema di esposizione necessario per replicare meglio le condizioni di coltura delle cellule. L'esposizione ai gas come cloro limita l'uso di umidità come può corrodere il dispositivo. Le colture ALI potrebbero essere scosso per simulare la respirazione come precedentemente utilizzata nel nostro sistema di 14,15 esposizione all'ozono. Stiamo attualmente lavorando in queste direzioni.
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Acknowledgments
Questa ricerca è sostenuta dal Programma CounterACT, National Institutes of Health (NIH), Ufficio del Direttore, e l'Istituto Nazionale delle Scienze di Salute ambientale (NIEHS) Sovvenzione Numero U54 ES015678 (CWW). SA è supportato anche da ospedale per bambini Colorado / Colorado School of Mines collaborazione Pilot Award # G0100394 e Ospedale Pediatrico Colorado Research Institue Pilot Award # G0100471.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Chlorine | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 kit | Promega | G8091 | |
| Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode | World Precision Instruments | EVOM and STX2 | |
| Snapwell inserts | Corning | 07-200-708 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Corning | #352360 | |
| Polysulfone biocontainment chambers | BCU, Allentown Cage Equipment | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| Sarcomeric actin antibody | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 antibody | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 antibody | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa 488-conjugated secondary antibody | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs Ringer Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Lactated Ringer solution | Abott Laboratories | 7953 | |
| Donkey serum | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4-15% SDS-PAGE gels | Bio-Rad | 456-1083 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Peroxidase detection kit | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting media, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M8028 | |
| Laminin | BD biosciences | 354259 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
References
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