Summary
Este protocolo destina-se a demonstrar o método de exposição de culturas de células a produtos químicos tóxicos inalados. Exposição de diferenciado interface ar-líquido (LPA) culturas de células epiteliais das vias aéreas oferece um modelo único de exposição das vias aéreas de gases tóxicos como o cloro. Nesse artigo, descrevem efeito de exposição ao cloro em culturas de interface ar-líquido de células epiteliais e de cultura submersa de cardiomiócitos. Em sistemas de exposição in vitro permitem estudos sobre os mecanismos importantes para avaliar as vias que poderia, então, ser utilizados para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos.
Abstract
As culturas celulares são indispensáveis para desenvolver e estudar a eficácia de agentes terapêuticos, antes da sua utilização em modelos animais. Nós temos a capacidade única de modelar células do epitélio das vias aéreas humana e do músculo cardíaco bem diferenciadas. Esta poderia ser uma ferramenta de valor inestimável para estudar os efeitos deletérios de produtos químicos tóxicos inalados, tais como o cloro, que normalmente podem interagir com as superfícies das células, e formam vários subprodutos quando reagem com água, e limitar os seus efeitos em culturas submersas. Nosso modelo utilizando culturas de células epiteliais das vias aéreas o bem diferenciadas em interface ar-liqiuid contorna essa limitação, bem como fornece uma oportunidade para avaliar mecanismos críticos de toxicidade de potenciais químicos inalados venenosas. Descrevemos aprimorada perda da integridade da membrana, liberação caspase e morte sobre química inalado tóxico, como a exposição de cloro. Neste artigo, propomos métodos para modelar exposição de cloro no coração de mamíferos e das vias aéreas epitelial cvaras de cultura e testes simples para avaliar seu efeito sobre esses tipos de células.
Introduction
A exposição a produtos químicos tóxicos inalados (tiques) / gases, tais como o cloro (Cl 2) continua a ser um problema de saúde em curso em exposição acidental, assim como no seu uso potencial como um agente de ameaça química. Embora os pulmões são o principal alvo, órgãos como o coração eo cérebro também são afetados 1-3. Modelos in vivo são geralmente utilizados para testes de toxicidade de TICs, mas em ensaios in vitro para avaliação de toxicidade são mais simples, mais rápido e mais rentável. In vitro modelos também permitem extensa investigação de interações célula-agente que podem ser difíceis de avaliar in vivo. Tais sistemas de exposição in vitro são raros e, além disso, em alguns dos modelos convencionais, onde os agentes tóxicos são adicionadas ao meio de cultura no qual as células são submergidas, as propriedades dos agentes pode mudar devido a interacções e ligação de componentes do meio. Em tais cenários sistemas de cultura de células, como a interface ar-líquido (ALI) culturas de células primárias das vias respiratórias humanas epiteliais, aqui propostas, que podem ser diretamente expostos a agentes gasosos pode ser promissor.
As células epiteliais que revestem as vias aéreas são as primeiras linhas de defesa contra substâncias químicas tóxicas inaladas. O epitélio das vias respiratórias humanas forma uma barreira física entre o lúmen e as células subjacentes no pulmão e participa na resposta do pulmão. Ela produz um número de citocinas e outros agentes pro-e anti-inflamatórias bem como segrega líquido superfície muco / vias aéreas (ASL) que cobre o epitélio. Uma das limitações em convencional submerso em sistemas de cultura in vitro é também que o ASL e muco que cobre a superfície epitelial é removido ou diluído. Isto não reflecte o estado fisiológico das células epiteliais pulmonares, que são expostas ao ar. Assim, um ideal sistema in vitro para testes de toxicidade TIC deve replicar esta arquitetura. Há um grande interesse no desenvolvimento rápido de triagem métodos que predizem em toxicidade in vivo. As células epiteliais cultivadas no ALI diferenciar e têm estruturas e funções bem diferenciadas em comparação com células cultivadas submersas e servir um modelo superior das vias respiratórias.
Neste estudo, descrevemos o uso de cultura de ar-líquido interface de vias respiratórias humanas (traqueobrônquicos) células epiteliais para testar a toxicidade do gás inalado venenoso e compará-lo com uma cultura de células submersa de cardiomiócitos, portanto, estudar um outro alvo importante de toxicidade.
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Protocol
1. Culturas de cardiomiócitos de rato
- Todos os experimentos foram realizados sob protocolos aprovados pelo cuidado com os animais e uso comitê institucional, IACUC.
- Obter cardiomiócitos de ratos a partir de corações (ventrículos) de ratos machos (240-260 g), utilizando métodos descritos anteriormente 4. Resumidamente, anestesiar os animais com uma injecção intraperitoneal de pentobarbital (100 mg / kg; confirmar anestesia pelo método de aperto do dedo do pé) e, em seguida, remover o coração em 10.0 ml, 1 mM de Ca 2 + contendo tampão Krebs-Ringer, pH 7,4.
- Lavar os corações 5-6x para remover o sangue e, em seguida, mudar para um buffer de Ca 2 + livre Krebs Ringer contendo 0,02% de protease e 0,06% de colagenase A (5,0 ml / coração). Incubar os corações nesta solução durante 10-15 min a 37 ° C com agitação ocasional.
- Após 10-15 minutos, lave a solução enzimática com Ca 2 + tampão Krebs Ringer livre para um adicional de 5 min. Solte as células do tecido flácido nosção de uma pipeta 25 ml pipetando a suspensão para cima e para baixo várias vezes.
- Separam-se as células a partir de tecido por filtração através de uma malha de nylon de 70 ^ m e permitir-lhes que se contentar em tampão Krebs-Ringer contendo 0,1 mM de Ca 2 +. Suspende-se o sedimento de células em tampão 1,0 ml de Krebs Ringer contendo 0,2 mM Ca 2 +.
- Camada cuidadosamente ao longo de 5,0 ml de 60 ug / ml de albumina de soro bovino, BSA, em 15 ml de tubos de centrífuga, para separar os cardiomiócitos de nonmyocytes e permitir-lhes que se contentar com 30 min. Os cardiomiócitos são mais pesados e se mover para a parte inferior do tubo. Retire cuidadosamente as células sobrenadante e mídia. Repetir esta etapa para purificar mais uma vez as células.
- Gradualmente transição por lavagem (em etapas usando 0,25 mM, 0,5 mM, 0,75 mM, e 1,0 mM Ca 2 + contendo tampão) os miócitos / cardiomiócitos ventriculares para mM Ca 2 + contendo tampão 1,0 e novamente suspensas em meio ACCT consistindo de Dulbecco Modified Eagle Médium , DMEM containing de 2 mg / ml de BSA, 2 mM de L-carnitina, creatina 5 mM, 5 mM de taurina, 100 UI / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina.
- Placa cardiomiócitos em meio ACCT, a uma densidade de 100 a 150 células / mm 2 a 100 mm, ou 35 milímetros laminina pratos de cultura de plástico ou 40 x 22 mm de lamelas de vidro pré-revestidas com laminina (1 mg / cm 2) revestido. Após 1 h, lavar os pratos com 2,0 ml ACCT para remover as células que não estão ligados. Adicionar 10,0 ml de meio fresco e incuba-se as células.
2. Diferenciada interface ar-líquido (ALI) Cultura da Human Airway células basais epiteliais
- Procure tecidos humanos traqueobrônquicas de Doenças National Research Interchange sob Institutional Review Board protocolos aprovado. Colheita celular e realizar a cultura utilizando um procedimento publicado 5,6. Este procedimento utiliza culturas de células como eles são um modelo preciso para exposições de inalação humana para TICs, no entanto, se necessário, pode-se isolar e crescer a ALI moutilizar e / ou células epiteliais das vias respiratórias do rato 7,8.
- Resumidamente, fazer pequenos pedaços (~ ¼ de polegada) de tecido após a remoção de todos os nódulos linfáticos e dos tecidos conjuntivos. Lave o tecido várias vezes em solução de Lactato de Ringer. Adicionar os tecidos para um tubo de 50 ml e adicionar solução de protease (1% Protease/0.01% de DNase em meio mínimo essencial, MEM, a proporção de tecido fluido (1:10)).
- Balance o tecido a 4 ° C durante a noite. Terminar a dissociação do tecido pela adição de 10% de soro fetal bovino. Raspar a superfície epitelial com um bisturi cirúrgico e recolher as células por centrifugação (2000 rpm durante 10 min).
- As células em placas a uma passagem em poços com tampa revestida com colagénio em meio especial ALI preparados como descrito em detalhe por Fulcher et al 9. Cultura durante 5 dias antes de mudar para a interface ar-líquido (ALI), removendo meios de apicais.
- Alimentar as células usando meios de LPA em dias alternados, e permitir que as células se diferenciam em 2-3 semanas adicionais (observar numerosos cílios batendo e secreção de muco) antes de realizar exposições. Lavar a superfície apical com PBS quente juntamente com as mudanças de mídia.
3. Cloro exposição
- Contêm o sistema de exposição de cloro (CES) dentro de uma capa química qualificado com uma velocidade nominal de 100 fpm operacional que proporciona o confinamento secundário necessário para evitar a exposição do pessoal no caso de fugas acidentais do cloro.
- Operar o sistema sob uma ligeira pressão positiva (0,5 polegadas de água). O ar seco é alimentado a 15 L / min, e um nível adequado de cloro é alimentado para atingir a concentração final desejada de cloro. As câmaras têm uma tampa de bloqueio com 4 mini fechaduras BCU e uma junta de silicone de baixa dureza para fornecer o selo de pressão.
- Entregar a mistura Cl 2 através de um controlador de fluxo de massa. O CES usa um cilindro de gás comprimido que contém 1,0% de Cl 2, em azoto seco.
- Regular o fluxo de ar de diluição com oprojetado painel de controle e regulação semelhante a concentração Cl 2 entregues para as câmaras de exposição. A bomba de amostragem baixo volume puxa a exaustão das câmaras em um analisador de cloro para monitorar as concentrações que são então gravados em um registrador de dados conectado ao analisador.
- Medir as taxas de fluxo dentro das câmaras antes da exposição utilizando um medidor de fluxo de garantir taxas de fornecimento e exaustão iguais.
- Prepare as culturas de células para a exposição, removendo os meios de sobrenadante e adicionando meio fresco (mídia basolateral em culturas ALI). Qualquer pré-tratamentos com agentes pode ser realizada nesta altura.
- Expor as culturas de células com LPA epiteliais das vias respiratórias a Cl 2 de gás (50, 100, ou 300 ppm, durante 30 min) nas duas câmaras de polissulfona biocontainment seladas. Os cardiomiócitos (submersas ou culturas confluentes nas membranas) são expostas a 50 ou 100 ppm Cl 2 durante 15 min.
- Após a exposição lavar as câmaras com ar até o Cl 2 nível cai abaixo de 1 ppm e pode ser aberta com segurança para remover as células (no prazo de 5 min).
4. Resistência elétrica transepitelial (TER) Medição
- Meça o TER de ar-líquido-interface, ALI, culturas usando um voltohmmeter epitelial com um par de eletrodos de cloreto de "pauzinho" de prata.
- Equilibrar o eletrodo pauzinho na ALI media 15 min antes do uso.
- Adicionar mídia quente para a apical (1,0 ml) e basolateral (2,0 ml) de superfície e medir o TER de usar os eletrodos pauzinho do voltohmmeter.
- Mergulhe o braço mais curto do eletrodo na mídia apicais e quanto mais tempo o braço na mídia basolateral. Clique no botão "medida" no voltohmmeter para avaliar a resistência elétrica.
- O voltohmmeter tem a opção de medir ohms ou k ohms. Subtraia a resistência através de um livre de células de apoio a cultura da resistência medida em cada camada de células para produzir o transresistência epitelial (TER).
5. Medição Caspase
- Adicionar mídia ALI fresco (2,0 ml) para a exposição de pós superfície basolateral da célula e incubar à temperatura ambiente. Colete mídia sobrenadante a 4 e 24 horas.
- Medir a caspase 3/7 actividade nas sobrenadantes de meios utilizando uma caspase comercial 3/7 Kit de ensaio.
6. Western Blot e Imunocitoquímica
- Realizar as transferências Western usando lisados de células, como anteriormente descrito 10. Suspender o lisado de proteína (20 mg) em 5x tampão de amostra reduzida e deixe ferver por 5 min. Sujeitou-se o lisado de proteína a SDS-PAGE (4-15%) e transferir as proteínas separadas para uma membrana de nitrocelulose por transferência electroforética.
- Bloquear a ligação não-específica por incubação da membrana com leite a 5% em tampão de lavagem (PBS + 0,1% de detergente) e sondar as membranas com anticorpos primários contra SERCA2 ou actina sarcomérica na diluição 1:1.000, durante a noite a 4 ° C. Em seguida, lavar e incubar as membranas com os respectivos anticorpos secundários conjugados com peroxidase e desenvolvimento para a detecção, tal como descrito antes de 10 usando o kit comercial de detecção com peroxidase.
- Para imunocitoquímica, o tratamento de células vivas cultivadas em insertos ou lamelas de vidro em placas de 6 poços com 0,4% de Triton-X-100 em tampão de citrato de sódio 10 mM durante 20 min, após a lavagem com PBS.
- Bloco de ligação não específica por tratamento das células com 5% de soro de burro, durante 20 min, e em seguida, incuba-se as células com IgG não específicas ou os anticorpos primários individuais específicos para actina sarcomérica ou Ki-67.
- Lavar as células com PBS e incuba-se com anticorpos secundários conjugados fluorescentes para detectar o anticorpo primário e um corante nuclear (1 ug / ml de DAPI).
- Lavar com PBS e montar lamelas usando a mídia de montagem comerciais.
- Visualizar a coloração utilizando um microscópio de fluorescência.
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Representative Results
Haste primária cardiomiócitos em forma anexar em matrizes de laminina e se espalhar e se diferenciar em culturas confluentes (Figura 1A e sua inserção). Estas células foram adicionalmente caracterizados com base na expressão de actina e sarcomérica SERCA2 (Figuras 1B e 1C). Rato cardiomiócitos são altamente suscetíveis à toxicidade de cloro como 15 minutos de exposição a 100 ppm de cloro causou extensos arredondamento celular e morte em culturas submersas e rompimento de camadas confluentes de células cultivadas em laminina revestido membranas (Figura 1D). Há também foi melhorada morte celular por apoptose como indicado pela caspase 3/7 libertação em cardiomiócitos cultivados em inserções (Figura 1E).
Exposição do epitélio das vias aéreas humano diferenciado (Figura 2, inserida no painel 1, mostrando uma seção transversal de cultura de células insere com colunar, ciliadas e caliciformes) ao cloro causou descamação e lifting das membranas celulares, tanto de baixo (100 ppm) e alta (300 ppm) concentrações (Figura 2 painel A2 e A3). Os danos causados por concentrações baixas de cloro foi rapidamente revertida (Figura 2 painel A5), no entanto, as células expostas a concentrações elevadas de cloro tinha atrasado ou nenhuma capacidade de reparação (Figura 2 painel A6) como se mostra por meio de inspecção visual, bem como a avaliação da proliferação de células por Ki-67 coloração (Figura 2 painel A9). Resistência eléctrica epitelial, as medições de TER trans e actividade da caspase confirmou estes resultados e ainda fornecem evidência para a perda da integridade da membrana e morte celular por apoptose por exposição de cloro (Figura 2, painel B e C). Assim, os nossos estudos descrevem o desenvolvimento de um sistema de exposição Cl 2 in vitro, que causa a perda de integridade da membrana e morte de cardiomiócitos e epitélio das vias aéreas. Este efeito não pode ser devido a mudanças de pH não fisiológicas nos cardiomiócitos comoo pH do meio, após a exposição ao cloro foi mantida a ~ 7,4 como medido usando um medidor de pH no pós-exposição mídia recolhido.
Figura 1. Rato isolamento cardiomiócitos e exposição ao cloro. Cardiomiócitos de rato foram isoladas como descrito no protocolo e semeadas em revestido por placas de plástico de laminina (painel A, uma imagem por microscopia de luz representante) ou laminina revestido inserções. Inset para o painel A mostra uma haste em forma de cardiomiócitos se espalhando e diferenciador. Os cardiomiócitos foram também caracterizados com base na expressão de actina sarcomérica (painel B mostra uma imagem representativa detectado por imunofluorescência e a faixa um painel C mostra uma varredura de western blot representativo) e expressão abundante SERCA2 (painel C pista b). Exposição ao cloro (100 ppm de 15 min) causou morte celular extensa emculturas submersas, bem como a interrupção da monocamada de células nas inserções (painel D mostra fotomicrografias representativas). Caspase 3/7 release (painel E) na mídia sobrenadante dos cardiomiócitos cultivados em inserções, em 4 horas e 24 horas pós-exposição de cloro também foi medida como descrito no texto. Os valores apresentados são a média ± EPM e * indica significativa (p <0,05) da diferença de controlo 0 ppm.
Figura 2. Efeito da exposição de cloro no diferenciada epitelial das vias aéreas humano interface ar-líquido (LPA) culturas. Epiteliais das vias aéreas células basais humanos foram cultivadas em colágeno revestido poços com tampa. Após o dia 5 a mídia apical foi removida. Culturas diferenciados (que consistem em basal, ciliadas, colunar e células caliciformes, como mostrado na inserção no topo left painel de painel A) foram expostos ao cloro (100 ou 300 ppm) durante 30 min. O TER foi medido e o meio foi mudado e as células incubadas durante 24 horas. Aos 24 hr TER foi medido novamente e mídia apical foi coletado para a medição de liberação caspase e as membranas celulares foram fixados para imuno-histoquímica. A seta aberta nas partes A do painel 2 e 3 mostra descartadas camada epitelial e setas pretas mostram os espaços vazios na inserção. A seta no painel A parte 5 mostra epitélio regenerado. Partes 7, 8 e 9 mostram a proliferação celular avaliadas por Ki-67 imunocoloração. Os valores apresentados são a média ± EPM e * indica significativa (p <0,05) da diferença de controlo 0 ppm.
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Discussion
O tipo mais comum de exposição tóxica aguda ocorre quando se respira um produto químico venenoso para os pulmões. Estes produtos químicos também podem ser tomadas rapidamente na corrente sanguínea e pode afetar outros órgãos, como o cérebro eo coração. Inalação de toxicidade de vários agentes que utilizam modelos animais são amplamente estudado e relatado, no entanto, os mecanismos são menos bem compreendidas. Este é um grande obstáculo no desenvolvimento de terapias eficazes. Ausência de em sistemas de exposição in vitro é a principal razão por trás da falta de perspectivas mecanicistas. Aqui nós descrevemos os modelos de cultura de células de músculo cardíaco e das vias aéreas para estudar o impacto de produtos químicos tóxicos inalados, como a exposição de cloro. O cloro reage rapidamente com superfícies aquosas, para formar o ácido clorídrico e ácido hipocloroso 3,11,12. O cloro também pode combinar com espécies reativas de oxigênio (ROS) para produzir compostos altamente reativos que podem levar à oxidação de proteínas e enzimas críticas das vias aéreas superfícies 13. Estudosutilizando culturas submersas só podem demonstrar efeitos de produtos, tais como o HOCl no caso de cloro, em vez de o próprio gás. A exposição de culturas ALI diferenciadas de células epiteliais das vias respiratórias humanas aqui descritas poderia permitir o estudo de interacções directas dos Tiques tais como o cloro, com as superfícies das células, na ausência de meios aquosos semelhantes ao que ocorre in vivo.
Usando cardiomiócitos de ratos primários, também descrevem que a exposição de cloro provoca a morte celular rápida em culturas submersas. Estas células são capazes de crescer a ALI, pois não polarizar e formam junções apertadas. Portanto, também utilizado culturas confluentes de cardiomiócitos cultivados em inserções com uma fina camada de material. A exposição destas células a monocamadas cloro demonstrado ruptura da membrana e libertação intensificada caspase sugerindo apoptose pode desempenhar um papel.
Este estudo demonstra que as vias aéreas (o principal alvo de inalação, que pode ser replicado por ALI cultures), assim como de órgãos tais como o coração, que não crescem em LPA pode ser estudada usando sistemas de exposição in vitro. Estes modelos in vitro de exposição pode ser facilmente adaptado para avaliar os efeitos de outros produtos químicos tóxicos inalados (TICs). Usando esses modelos prevemos para fornecer uma compreensão mecanicista detalhada dos efeitos tóxicos e desenvolver novas estratégias para mitigar os eventos tóxicos associados com TIC / cloro e depois avaliá-los ainda mais in vivo. Embora, estas exposições são de curta duração o sistema de exposição precisa de melhor reproduzir as condições de cultura de células. A exposição a gases, como o cloro limita o uso de humidade, uma vez que pode corroer o dispositivo. As culturas LPA poderia ser abalada para simular a respiração, como anteriormente utilizado em nosso sistema 14,15 exposição ao ozono. No momento estamos trabalhando nessas direções.
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Acknowledgments
Esta pesquisa é apoiada pelo Programa CounterACT, National Institutes of Health (NIH), Gabinete do Diretor, e do Instituto Nacional de Ciências de Saúde Ambiental (NIEHS) Número Grant U54 ES015678 (CWW). SA também é suportado pelo Hospital Infantil Escola Colorado / Colorado de Minas Collaboration Award Pilot # G0100394 e Hospital Infantil de Colorado Research Institue Award Pilot # G0100471.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Chlorine | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 kit | Promega | G8091 | |
| Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode | World Precision Instruments | EVOM and STX2 | |
| Snapwell inserts | Corning | 07-200-708 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Corning | #352360 | |
| Polysulfone biocontainment chambers | BCU, Allentown Cage Equipment | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| Sarcomeric actin antibody | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 antibody | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 antibody | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa 488-conjugated secondary antibody | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs Ringer Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Lactated Ringer solution | Abott Laboratories | 7953 | |
| Donkey serum | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4-15% SDS-PAGE gels | Bio-Rad | 456-1083 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Peroxidase detection kit | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting media, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M8028 | |
| Laminin | BD biosciences | 354259 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
References
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