Summary
Este protocolo está diseñado para demostrar método de exposición de cultivos de células a productos químicos tóxicos inhalados. La exposición de diferenciada interfaz aire-líquido (ALI) cultivos de células epiteliales de las vías respiratorias proporciona un modelo único de la exposición de las vías respiratorias a los gases tóxicos tales como el cloro. En este manuscrito se describe el efecto de la exposición al cloro en las culturas de la interfaz aire-líquido de las células epiteliales y la cultura sumergida de los cardiomiocitos. In vitro sistemas de exposición permiten importantes estudios sobre el mecanismo para evaluar las vías que podrían entonces ser utilizados para desarrollar nuevos agentes terapéuticos.
Abstract
Los cultivos celulares son indispensables para desarrollar y estudiar la eficacia de los agentes terapéuticos, antes de su uso en modelos animales. Tenemos la capacidad única de modelar las células del epitelio de la vía aérea humana y del músculo del corazón bien diferenciadas. Esto podría ser una herramienta muy valiosa para estudiar los efectos nocivos de los productos químicos tóxicos inhalados, como el cloro, que normalmente pueden interactuar con las superficies de las células, y forman varios subproductos al reaccionar con el agua, y la limitación de sus efectos en cultivos sumergidos. Nuestro modelo utilizando cultivos de células epiteliales de la vía aérea humana bien diferenciados en la interfaz aire liqiuid elude esta limitación, así como proporciona una oportunidad para evaluar los mecanismos fundamentales de la toxicidad de los potenciales químicos inhalados venenosas. Describimos una mayor pérdida de la integridad de la membrana, la liberación de caspasa y la muerte sobre químicos tóxicos inhalados, como la exposición al cloro. En este artículo, se propone métodos para modelar la exposición al cloro en el corazón de los mamíferos y de las vías respiratorias epiteliales cells en la cultura y sencillas pruebas para evaluar su efecto en estos tipos de células.
Introduction
La exposición a productos químicos tóxicos inhalados (TICs) / gases como el cloro (Cl 2) sigue siendo un problema de salud en curso en exposiciones accidentales, así como en su uso potencial como un agente de amenaza química. Aunque los pulmones son el blanco principal, órganos como el corazón y el cerebro también se ven afectados 1-3. Modelos in vivo se utilizan generalmente para las pruebas de toxicidad de las TIC, pero en los ensayos in vitro para la evaluación de la toxicidad son más simples, más rápido y más rentable. En modelos in vitro también permiten la extensa investigación de las interacciones célula-agente que pueden ser difíciles de evaluar in vivo. Tales sistemas de exposición in vitro en son raros y por otra parte, en algunos modelos convencionales donde se añaden agentes tóxicos al medio de cultivo en el que se sumergen las células, las propiedades de los agentes pueden cambiar debido a las interacciones y la unión a componentes en el medio. En tales sistemas de cultivo de células escenarios tales como la interfaz aire-líquido (ALI) cultivos de células primarias vías respiratorias humanas epiteliales, que aquí se proponen, que pueden estar expuestos directamente a los agentes gaseosos podrían ser prometedores.
Las células epiteliales que recubren las vías respiratorias son las primeras líneas de defensa contra sustancias químicas tóxicas inhaladas. El epitelio de la vía aérea humana forma una barrera física entre la luz y las células subyacentes en el pulmón y participa en la respuesta del pulmón. Se produce un número de citoquinas y otros agentes pro-y anti-inflamatorias, así como segrega líquido de la superficie de moco / las vías respiratorias (ASL) que cubre el epitelio. Una de las limitaciones en sumergido en sistemas de cultivo in vitro convencionales es también que la ASL y el moco que cubre la superficie epitelial se quita o se diluyen. Esto no refleja el estado fisiológico de las células epiteliales del pulmón que se exponen al aire. Por lo tanto, un ideal sistema in vitro para las pruebas de toxicidad TIC debe replicar esta arquitectura. Hay un gran interés en el desarrollo de la detección rápida métodos que predicen la toxicidad in vivo. Las células epiteliales cultivadas en el ALI diferenciar y tienen estructuras y funciones bien diferenciadas en comparación con las células cultivadas sumergidas y servir a un modelo superior de las vías respiratorias.
En este estudio, se describe el uso de la cultura-líquido interfaz aérea de las vías respiratorias humanas (traqueobronquiales) las células epiteliales para las pruebas de toxicidad por inhalación de gas venenoso y lo comparamos con un cultivo de células sumergida de los cardiomiocitos, estudiando, por lo tanto otro objetivo importante de la toxicidad.
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Protocol
1. Culturas Rata cardiomiocitos
- Todos los experimentos se realizaron bajo protocolos aprobados por el cuidado de los animales y el uso comité institucional, IACUC.
- Obtener cardiomiocitos de rata de los corazones (ventrículos) de ratas macho (240-260 g) empleando los métodos descritos anteriormente 4. En pocas palabras, anestesiar a los animales con una inyección intraperitoneal de pentobarbital (100 mg / kg; confirmar la anestesia por el método pizca dedo del pie) y luego retire corazones en 10,0 ml, 1 mM Ca 2 + que contiene tampón Krebs Ringer, pH 7,4.
- Enjuague los corazones 5-6x para quitar la sangre y luego cambiar a un 2 tampón Krebs Ringer Ca + gratuito que contiene 0,02% de proteasa y 0,06% de colagenasa A (5,0 ml / corazón). Incubar los corazones en esta solución durante 10-15 min a 37 ° C con agitación ocasional.
- Después de 10-15 minutos, lavar la solución enzimática con tampón Ca 2 + libre de Krebs Ringer durante 5 min. Liberar las células del tejido fláccido nosotrosing una pipeta de 25 ml con la pipeta la suspensión arriba y abajo varias veces.
- Separar las células de los tejidos mediante el filtrado a través de una malla de nylon de 70 micras y permitir que se asienten en tampón Krebs Ringer que contenía 0,1 mM Ca 2 +. Suspender el sedimento de células en 1,0 ml de tampón Krebs Ringer que contenía 0,2 mM Ca 2 +.
- Capa cuidadosamente más de 5,0 ml 60 / ml de albúmina de suero bovino mg, BSA, en 15 ml tubos de centrífuga, para separar los cardiomiocitos de nonmyocytes y permitir que se asienten durante 30 min. Los cardiomiocitos son más pesados y se mueven a la parte inferior del tubo. Retire con cuidado las células sobrenadante y medios de comunicación. Repita este paso una vez para purificar aún más las células.
- Transición gradual por lavado (en pasos utilizando 0,25 mM, 0,5 mM, 0,75 mM, y 1,0 mM de Ca 2 tampón + que contiene) los miocitos ventriculares / cardiomiocitos a 1,0 mM de Ca tampón 2 + que contiene y se resuspendieron en medio ACCT que consiste en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco , DMEM containing 2 mg / ml de BSA, 2 mM de L-carnitina, creatina 5 mM, 5 mM de taurina, 100 UI / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina.
- Placa de los cardiomiocitos en medio ACCT a una densidad de 100 a 150 células / mm 2 en 100 mm o 35 mm de laminina recubierto placas de cultivo de plástico o 40 x 22 mm cubreobjetos de vidrio recubiertos previamente con laminina (1 g / cm 2). Después de 1 hora, lavar los platos con ACCT 2,0 ml para eliminar las células que no están conectados. Añadir 10,0 ml de medio fresco y se incuban las células.
2. Interfaz de aire-líquido diferenciada (ALI) Cultivo de células de las vías respiratorias humanas epiteliales basales
- Adquirir tejidos traqueobronquiales humanos de la enfermedad de Investigaciones Científicas de intercambio bajo la Junta de Revisión Institucional de los protocolos aprobados. Cosecha celular y realizar cultivo utilizando un 5,6 procedimiento publicado. Este procedimiento utiliza cultivos de células, ya que son un modelo preciso de la exposición por inhalación humana a TICs, sin embargo, si es necesario se puede aislar y crecer a ALI moutilizar y / o células epiteliales de las vías respiratorias de rata 7,8.
- Brevemente, hacer piezas pequeñas (~ ¼ de pulgada) de tejido después de la eliminación de todos los nodos de tejido conjuntivo y los ganglios. Lave el tejido varias veces en solución de Ringer con lactato. Añadir los tejidos a un tubo cónico de 50 ml y añadir solución de proteasa (1% Protease/0.01% de DNasa en medio mínimo esencial, MEM, tejido a la proporción de fluido (01:10)).
- Rock the tejido a 4 ° C durante la noche. Fin de la disociación del tejido mediante la adición de suero bovino fetal al 10%. Raspar la superficie epitelial con un bisturí quirúrgico y recoger las células por centrifugación (2000 rpm durante 10 min).
- Las células de la placa en el paso uno en snapwells recubiertas de colágeno en medio especial ALI preparados como se describe en detalle por Fulcher et al 9. Cultura durante 5 días antes de cambiar a la interfase aire-líquido (ALI) mediante la eliminación de los medios apicales.
- Alimentar a las células por medio de los medios de comunicación ALI cada dos días y permitir que las células se diferencien por 2-3 semanas adicionales (observar numerosos cilios paliza y la secreción de moco) antes de realizar las exposiciones. Lave la superficie apical con PBS caliente junto con los cambios de los medios.
3. La exposición al cloro
- Contener el sistema de exposición al cloro (CES) dentro de una campana química calificada con una velocidad de extracción de funcionamiento de 100 pies por minuto que proporciona la contención secundaria necesaria para evitar la exposición del personal en caso de fugas accidentales de cloro.
- Haga funcionar el sistema bajo presión ligeramente positiva (0,5 pulgadas de agua). El aire seco se alimenta a 15 L / min y un nivel adecuado de cloro se alimenta para alcanzar la concentración de cloro final deseado. Las cámaras tienen una tapa de cierre con 4 mini cerraduras BCU y una junta de silicona de durómetro bajo para proporcionar el sello de presión.
- Entregar la mezcla de Cl 2 a través de un controlador de flujo másico. El CES utiliza un cilindro de gas comprimido que contiene 1,0% de Cl 2 en nitrógeno seco.
- Regular el flujo de aire de dilución utilizando eldiseñado a medida del panel de control y del mismo modo regular la concentración de Cl2 entregado a las cámaras de exposición. Una bomba de muestreo de bajo volumen saca los gases de escape de las cámaras en un analizador de cloro para controlar las concentraciones que luego se graban en un registrador de datos conectado al analizador.
- Medir las tasas de flujo dentro de las cámaras antes de la exposición usando un medidor de flujo para asegurar velocidades de suministro y de escape iguales.
- Preparar los cultivos celulares para la exposición mediante la eliminación de los medios de comunicación de sobrenadante y añadir medio fresco (medio basolateral en culturas ALI). Cualquier pretratamientos con agentes podrían ser realizados en este momento.
- Exponga las culturas ALI de las células epiteliales de la vía aérea a Cl 2 gas (50, 100, o 300 ppm durante 30 minutos) en las dos cámaras bioconfinamiento polisulfona selladas. Los cardiomiocitos (sumergidas o culturas en las membranas confluentes) están expuestos a 50 o 100 ppm de Cl 2 durante 15 min.
- Después de la exposición limpiar las cámaras de aire hasta que la Cl 2 nivel cae por debajo de 1 ppm y se puede abrir de forma segura para eliminar las células (dentro de 5 min).
4. Resistencia eléctrica transepitelial (TER) Medición
- Mida la TER de aire-líquido-interfaz, ALI, culturas utilizando un voltohmmeter epitelial con un par de electrodos de cloruro de "palillos" de plata.
- Equilibrar el electrodo palillo en el ALI medios 15 min antes de su uso.
- Añadir media caliente al apical (1,0 ml) y basolateral (2,0 ml) de la superficie y medir la TER usando los electrodos palillos del voltohmmeter.
- Sumergir el brazo más corto del electrodo en medios apical y el brazo más largo en los medios de comunicación basolateral. Haga clic en el botón de "medida" en el voltohmmeter para evaluar la resistencia eléctrica.
- El voltohmmeter tiene la opción para medir ohmios o K ohmios. Restar la resistencia a través de un soporte de cultivo libre de células a partir de la resistencia medida a través de cada capa de células para producir el transresistencia epitelial (TER).
5. Medición de Caspasa
- Añadir medios ALI fresco (2,0 ml) a la exposición basolateral mensaje superficie e incubar la célula a temperatura ambiente. Recoger medio sobrenadante a las 4 y 24 horas.
- Medir la caspasa 3/7 actividad en los sobrenadantes de los medios de comunicación mediante el uso de una caspasa comercial 3/7 kit de ensayo.
6. Western Blot e inmunocitoquímica
- Realizar transferencias de Western usando lisados de células como se ha descrito previamente 10. Suspender el lisado de proteínas (20 g) en tampón de muestra 5x reducida y hervir durante 5 min. Se somete el lisado de proteínas a SDS-PAGE (4-15%) y transferir las proteínas separadas a una membrana de nitrocelulosa mediante transferencia electroforética.
- Bloquear la unión no específica mediante la incubación de la membrana con leche 5% en tampón de lavado (PBS + 0,1% de detergente) y la sonda las membranas con anticuerpos primarios contra SERCA2 o actina sarcomérica en dilución 1:1000, durante la noche a 4 ° C. A continuación, lavar e incubar las membranas con los respectivos anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa y desarrollar para la detección como se ha descrito antes 10 usando el kit de detección de peroxidasa comercial.
- Por inmunocitoquímica tratan células vivas cultivadas en insertos o cubreobjetos de vidrio en placas de 6 pocillos con 0,4% Triton-X-100 en mM tampón de citrato de sodio 10 durante 20 minutos después de enjuagar con PBS.
- Bloquear la unión no específica tratando las células con 5% de suero de burro durante 20 min, y luego incubar las células con IgG no específica o anticuerpos primarios individuales específica a la actina sarcomérica o Ki-67.
- Lavar las células con PBS y se incuban con anticuerpos secundarios fluorescentes conjugado para detectar el anticuerpo primario y un tinte nuclear (1 g / ml DAPI).
- Lavar con PBS y montar cubreobjetos utilizando medio de montaje comercial.
- Visualizar la tinción utilizando un microscopio de fluorescencia.
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Representative Results
Cardiomiocitos en forma de varilla primaria se adhieren sobre matrices de laminina y se propagan y se diferencian en cultivos confluentes (Figura 1A y su inserción). Estas células se caracterizan además sobre la base de actina sarcomérica y la expresión de SERCA2 (Figuras 1B y 1C). Cardiomiocitos de rata son altamente susceptibles a la toxicidad de cloro como 15 minutos de exposición a 100 ppm de cloro causó grandes redondeo celular y muerte en cultivos sumergidos y la interrupción de capas confluentes en las células cultivadas en membranas de laminina recubierto (Figura 1D). También se mejoró la muerte celular por apoptosis, como se indica por la caspasa 3/7 liberación en cardiomiocitos cultivados en inserciones (Figura 1E).
La exposición de las vías respiratorias humanas diferenciadas epitelio (Figura 2, la inserción de panel 1 muestra una sección transversal de cultivo celular inserta con columnar, ciliadas y células caliciformes) al cloro causó el desprendimiento y LIFTing de las membranas celulares, tanto bajo (100 ppm) y (300 ppm) altas concentraciones (Figura 2 panel de A2 y A3). Daño por bajas concentraciones de cloro se invirtió rápidamente (Figura 2 Panel de A5), sin embargo, las células expuestas a las concentraciones de cloro superiores había retrasado o ninguna capacidad de reparación (Figura 2 Panel A6) como se muestra mediante inspección visual, así como la evaluación de la proliferación celular por Ki-67 tinción (Figura 2 Panel A9). Resistencia eléctrica epitelial, Mediciones de la TER trans y actividad de la caspasa confirmaron aún más estos resultados y proporcionan evidencia de la pérdida de integridad de la membrana y la muerte celular apoptótica después de la exposición de cloro (Figura 2, panel B y C). Así, nuestros estudios describen el desarrollo de un sistema de exposición Cl 2 in vitro que causa la pérdida de integridad de la membrana y la muerte de epitelio de las vías respiratorias y los cardiomiocitos. Este efecto puede no ser debido a cambios no fisiológicos de pH en los cardiomiocitos comoel pH de los medios de comunicación después de la exposición al cloro se mantuvo a ~ 7,4 tal como se mide mediante el uso de un medidor de pH en el medio recogido después de la exposición.
Se aislaron Figura 1. Rata aislamiento de cardiomiocitos y la exposición al cloro. Cardiomiocitos de rata como se describe en el protocolo y chapada en laminina recubierto platos de plástico (panel A, una imagen de microscopía óptica representante) o insertos laminina revestida. La inserción de panel A muestra un cardiomiocitos en forma de barra difusión y diferenciador. Los cardiomiocitos también se caracterizaron sobre la base de la expresión de actina sarcomérica (panel B muestra una imagen representativa detectada por inmunofluorescencia y Lane un panel C muestra un análisis de transferencia de Western representativo) y abundante expresión de SERCA2 (panel C Línea B). Exposición de cloro (100 ppm 15 min) causó una extensa muerte celular encultivos sumergidos, así como la interrupción de la monocapa de células en los insertos (Panel D muestra las fotomicrografías representativas). Caspasa 3/7 de liberación (grupo E) en los medios de sobrenadante de los cardiomiocitos cultivados en las inserciones, a las 4 horas y 24 h después de la exposición al cloro también se midió como se describe en el texto. Los valores mostrados son la media ± SEM y * indica significativa (p <0,05) entre 0 y el control ppm.
Figura 2. Efecto de la exposición al cloro en el epitelio de la vía aérea humana diferenciada interfase aire-líquido (ALI) culturas. Células basales del epitelio de las vías respiratorias humanas se cultivaron en snapwells revestidos de colágeno. Después de 5 días se retiró el medio apical. Culturas diferenciadas (consistente basal, ciliadas, columnar y células caliciformes como se muestra en el recuadro de la parte superior left del panel del panel A) se expusieron a cloro (100 o 300 ppm) durante 30 min. El TER se midió y se cambió el medio y las células se incubaron durante 24 horas. A las 24 h TER se mide de nuevo y se recogió medios apical para medir la liberación de caspasa y las membranas celulares se fija para inmunohistoquímica. La flecha abierta en el panel A las partes 2 y 3 muestra desprendió la capa epitelial y flechas negras muestran espacios vacíos en el inserto. La punta de flecha en el panel A parte 5 muestra epitelio regenerado. Partes 7, 8 y 9 muestran la proliferación celular según la evaluación de Ki-67 inmunotinción. Los valores mostrados son la media ± SEM y * indica significativa (p <0,05) entre 0 y el control ppm.
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Discussion
El tipo más común de exposición a sustancias tóxicas agudas se produce cuando se respira un producto químico venenoso en los pulmones. Estas sustancias químicas también pueden ser tomadas rápidamente en el torrente sanguíneo y pueden afectar otros órganos, como el cerebro y el corazón. Toxicidad por inhalación de diversos agentes que utilizan modelos animales son estudiados e informó ampliamente, sin embargo los mecanismos son menos conocidos. Esto es un obstáculo importante en el desarrollo de terapias eficaces. Ausencia de sistemas de exposición in vitro en una razón principal detrás de la falta de conocimientos sobre mecánica. Aquí se describen los modelos de cultivo celular de músculo cardíaco y las vías respiratorias para estudiar el impacto de los productos químicos tóxicos inhalados, tales como la exposición al cloro. El cloro reacciona rápidamente con superficies acuosas para formar ácido clorhídrico y hipocloroso 3,11,12. El cloro también se puede combinar con especies reactivas de oxígeno (ROS) para producir compuestos altamente reactivos que pueden conducir a la oxidación de proteínas críticas y las enzimas de la vía aérea superficies 13. Estudiosel uso de cultivos sumergidos sólo puede demostrar los efectos de por productos tales como HOCl en caso de cloro en lugar de la propia de gas. Exposición de cultivos ALI diferenciadas de células epiteliales de las vías respiratorias humanas descritas aquí permitiría estudio de las interacciones directas de tics tales como el cloro con superficies de las células en ausencia de medios acuosos similares a lo que ocurre in vivo.
El uso de cardiomiocitos de rata primarios, también se describe que la exposición al cloro produce la muerte rápida de las células en cultivos sumergidos. Estas células son incapaces de crecer en Ali, ya que no se polarizan y forman uniones estrechas. Por lo tanto, también utilizamos cultivos confluentes de cardiomiocitos cultivados en insertos con una fina capa de medios de comunicación. La exposición de estas monocapas de células al cloro demostró disrupción de la membrana y aumento de la liberación de caspasa lo que sugiere la apoptosis puede desempeñar un papel.
Este estudio demuestra que las vías respiratorias (el objetivo principal de la inhalación que puede ser replicado por ALI culturES) así como los órganos tales como corazón que no crecen a ALI pueden ser estudiados utilizando en sistemas de exposición in vitro. Estos modelos in vitro de exposición en se pueden adaptar fácilmente para evaluar los efectos de otros productos químicos tóxicos inhalados (TICs). El uso de estos modelos que anticipamos para proporcionar la comprensión mecanicista detallada de las toxicidades y desarrollar nuevas estrategias para mitigar los eventos tóxicos asociados con TIC / cloro y luego evaluar más a fondo en vivo. A pesar de que estas exposiciones son de corta duración el sistema de exposición necesario para replicar mejor las condiciones de cultivo de células. La exposición a gases tales como el cloro limita el uso de la humedad ya que puede corroer el dispositivo. Las culturas ALI podrían sacudieron para simular la respiración como se utiliza anteriormente en nuestro sistema 14,15 exposición al ozono. Actualmente estamos trabajando en estas direcciones.
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Acknowledgments
Esta investigación es apoyada por el Programa de CounterACT, Institutos Nacionales de Salud (NIH), la Oficina del Director, y el Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental (NIEHS) Número de Grant U54 ES015678 (CWW). SA también es apoyado por el Hospital de Niños Escuela de Minas de Colaboración Premio Pilot # G0100394 y el Hospital de Niños # Premio Piloto de Investigación de Colorado Institue G0100471 Colorado / Colorado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Chlorine | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 kit | Promega | G8091 | |
| Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode | World Precision Instruments | EVOM and STX2 | |
| Snapwell inserts | Corning | 07-200-708 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Corning | #352360 | |
| Polysulfone biocontainment chambers | BCU, Allentown Cage Equipment | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| Sarcomeric actin antibody | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 antibody | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 antibody | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa 488-conjugated secondary antibody | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs Ringer Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Lactated Ringer solution | Abott Laboratories | 7953 | |
| Donkey serum | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4-15% SDS-PAGE gels | Bio-Rad | 456-1083 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Peroxidase detection kit | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting media, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M8028 | |
| Laminin | BD biosciences | 354259 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
References
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