Summary
Este artigo fornece detalhes sobre como Elvax 40W pode ser utilizado como um método de libertação lenta para entrega da droga à retina de um rato adulto. O protocolo para a preparação, o carregamento e entrega o complexo droga-resina, para o olho é descrito.
Abstract
Doenças da retina, são difíceis de tratar como na retina encontra-se profundamente no interior do olho. Métodos invasivos de entrega de drogas são muitas vezes necessários para tratar essas doenças. Doenças da retina crônicas, tais como edema retinal ou neovascularização normalmente requerem múltiplas injecções intra-oculares para tratar eficazmente a doença. No entanto, os riscos associados a estas injecções aumentar com a repetição de uma entrega da droga. Portanto, métodos alternativos de entrega precisam ser estabelecidos, a fim de minimizar os riscos de reinjeção. Várias outras investigações têm desenvolvido métodos para administrar medicamentos ao longo do tempo prolongado, através de materiais capazes de libertar lentamente produtos químicos para dentro do olho. Na presente investigação, que descrevem a utilização de Elvax 40W, uma resina de copolímero, para actuar como um veículo para a entrega da droga à retina de um rato adulto. A resina é feita e carregados com o fármaco. O complexo de droga-resina é então implantado na cavidade vítrea, que irá libertar o fármaco lentamente durante time. Este método foi testada utilizando 2-amino-4-fosfonobutirato (APB), um análogo de glutamato que bloqueia a resposta à luz da retina. Demonstrou-se que o APB foi libertada lentamente a partir da resina, e foi capaz de bloquear a resposta da retina por 7 dias após a implantação. Isto indica que a entrega de droga de libertação lenta utilizando esta resina de copolímero é eficaz para o tratamento da retina, e pode ser utilizada de forma terapêutica com outros ensaios.
Introduction
O tratamento de doenças crônicas, como diabetes e pressão arterial elevada apresenta muitos desafios, como essas doenças geralmente necessitam de tratamento por longos períodos de tempo, muitas vezes por toda a vida. Este apelou para o desenvolvimento de sistemas de liberação de liberação lenta, o que reduz a necessidade de doses freqüentes. A eficácia destes métodos de libertação lenta tem sido demonstrada através de desenvolvimento de bombas de insulina, para reduzir o número de injecções de insulina necessários para o tratamento da diabetes. As doenças crônicas do olho, particularmente aquelas que afetam suas camadas internas, requerem a administração freqüente de drogas através de procedimentos invasivos. Uma doença crônica, que afeta o olho humano é a idade degeneração macular relacionada à (AMD). Ela afecta a retina central, que é uma camada de tecido neural situado na parte de trás do olho responsável por iniciar a visão. AMD é a principal causa de cegueira no mundo ocidental 1. Um desafio particular com o tratamento de redoenças tinal é que a droga é necessária para atingir esta camada profunda no olho, o que muitas vezes requer a entrega de métodos invasivos. As drogas são geralmente administradas a câmara vítrea e retina utilizando injecções intravítreas. No entanto, com cada injecção há o risco de complicações após a injecção, incluindo endoftalmite, descolamento da retina, catarata e hemorragia vítrea 2. Este risco é multiplicado com cada reinjecção do fármaco.
Reduzindo a necessidade de múltiplas injeções seria um grande benefício no tratamento da AMD. Para tratar a forma úmida de DMRI, onde crescimento de novos vasos é uma característica marcante, a estratégia terapêutica estabelecida é atingir os factores de crescimento endotelial (VEGF) que usam inibidores de VEGF 3. No momento, estes são entregues através de injeções intravítreas repetidas. De igual modo, no tratamento de edema macular, uma complicação comum da retinopatia diabética, os corticosteróides são fornecidos através de injecções repetidas A noção de um sistema de entrega de droga de libertação lenta foi descrita pela primeira vez utilizando um veículo de borracha de silicone para proporcionar moléculas pequenas em tecidos animais 5. Desde então, outros métodos de libertação lenta foram desenvolvidos para entregar moléculas grandes, algumas das quais foram testadas no olho. Transportadoras de partículas, tais como microesferas biodegradáveis, poli-láctido-co-glicólido (PLGA) nanopartículas e vesículas de fosfolípidos (lipossomas) podem ser úteis como veículos de distribuição de 6,7. Nanopartículas e lipossomas PLGA foram comparados num ambiente in vitro quanto à sua capacidade para entregar agentes anti-cancerígenos através da esclera 7 ao longo do tempo. Ambos os veículos foram eficazes na lentamente liberando as drogas. No entanto, o estudo foi realizado apenas num ambiente in vitro. Bochot et al. (2002) 8 testadosa eficácia de lipossomas para entregar moléculas para a retina in vivo. Eles demonstraram que os lipossomas entregam com sucesso oligonucleótidos pequenos para a retina do coelho. Os autores sugeriram que os lipossomas podem ser benéficos no tratamento de doenças da retina 8. No entanto, a natureza destas vesículas para flutuar no vítreo significa que eles provavelmente borrar ou prejudicar a visão 9. Okabe et ai. (2003) 10 não utilizados discos de polímero biodegradável constituída por 33% de etileno-acetato de vinilo para aplicar beta-dexametasona em coelhos. Eles discos implantados no bolso escleral e demonstraram a libertação eficaz da droga no vítreo e retina de até um mês 10. No entanto, este protocolo em particular, o implante foi relativamente grande e rígida, e é necessária uma cirurgia mais complexa, incluindo uma grande incisão escleral e sutura. Um estudo anterior investigou a tissue resposta a vários veículos de polímero por implantá-las para a córnea do olho de coelho, e verificou que os copolímeros de etileno-acetato de vinila, lavados em álcool não causou inflamação ou irritação. Estes complexos foram mostrados para sustentar a entrega de compostos de maior dimensão em tecidos animais, por períodos de tempo alargados, excedendo alguns até 100 dias dependentes da droga 11. Um tal tipo de resina de copolímero foi desenvolvido industrialmente, sob a forma de Elvax 40W (40% em peso de etileno-vinil-acetato com conteúdo de comonómero de «W» amida aditivo para melhorar o tratamento da pelota). Esta resina de copolímero é uma substância inerte, que é estável a ambos os quarto e a temperatura do corpo. Não tem sido demonstrado causar alergias ou toxicidade no tecido biológico. Esta resina tem efectivamente fornecida uma grande variedade de drogas, em diferentes modelos experimentais que investigam as funções de vários sistemas, tais como o sistema ductal de mama 12, o córtex auditivo primário 13,14 </ Sup>, eo sistema visual 15 sapo. Esta resina tem também sido utilizada no olho para entregar drogas para o desenvolvimento de tartaruga 16,17, 18,19 embrião de galinha, e de adultos furão retinas 20. No sistema nervoso central de rato, a resina foi usada apenas no cérebro de 21-23, mas o seu uso no olho do rato não foi documentada. As vantagens da utilização desta resina de copolímero para entregar drogas lentamente a retina através de outros métodos, é que é um composto estável que não cause inflamação ou irritação no olho. Ao contrário das partículas transportadoras, o complexo de droga-resina não iria prejudicar a visão, após o implante, uma vez que normalmente permanece no local da entrega, em vez de flutuar no vítreo. Só seria necessário um processo simples implantação na cavidade vítrea próxima ao limbo do olho, e que não requerem a sutura após o implante. Recentemente, tem havido uma emergência em vários novos sistemas de distribuição, tais comotecnologia de célula encapsulada (ECT) 24,25, hidrogéis 26 e 27 de microfilmes. No entanto, o método utilizado no presente estudo para a preparação e fornecimento do complexo droga-resina é fácil de seguir e de baixo custo, sendo assim mais vantajosa para utilização num ambiente de investigação básica. O desafio de utilizar este complexo para entregar drogas tratamentos de longo prazo é determinar a melhor concentração da droga que irá maximizar os benefícios terapêuticos da redução do número de injeções intravítreas. Este artigo tem como objetivo demonstrar o uso do complexo droga-resina para tratamento a longo prazo da retina de ratos adultos. A eficácia deste modo de entrega é testado usando o análogo do glutamato 2-amino-4-fosfonobutirato (APB) como a droga. Blocos APB a resposta à luz das células bipolares ON imitando glutamato, um neurotransmissor endógeno na retina 28. Quando APB concorre com o glutamato para o seu receptor, ele bloqueia o lighresposta t. APB foi usado em estudos fisiológicos para controlar a função da retina e medir o seu efeito através de métodos electrofisiológicos como electroretinografia (ERG). Em estudos anteriores, APB foi usado para tanto a curto prazo 29 e o tratamento de longo prazo da retina em desenvolvimento; este último envolvido que dá uma dose única, por injecção intra-ocular ao dia durante 30 dias 30. A mesma quantidade de APB (0,092 mg em solução salina estéril, a uma concentração de 50 ^ M) foi usada para todas as injecções, tal como sugerido em 28,29,31 trabalho anterior. Escolhemos APB para testar o complexo droga-resina, como um veículo de libertação lenta para entregar drogas no olho. Os métodos descritos neste estudo são similares aos métodos descritos anteriormente, envolvendo a preparação da droga-resina complexo 16,32; no entanto, também detalhar o seu uso principalmente no olho de um rato adulto. Após a implantação cirúrgica da resina APB-carregado para dentro do olho, ERG foi realizado para determinar se APB abole a rresposta à luz etinal e, portanto, se APB foi lançado com sucesso no vítreo e retina.
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Protocol
Todos os experimentos realizados foram de acordo com a Declaração de ARVO para o Uso de Animais em Oftálmica e Vision Research, e com a aprovação do Comitê de Ética da Universidade de L'Aquila animal e ao Comité do Australian National University Ética em Experimentação Animal. Ratos adultos (P100-200) foram utilizados ao longo deste estudo.
1. Prepare os grânulos de resina de copolímero
- Colocar 20 pastilhas Elvax 40W em um pequeno copo de vidro na câmara de exaustão.
- Encher o balão com 100% de etanol garantindo-se a cobrir todas as pelotas.
- Cobrir a proveta com Parafilm e embeber os granulados em etanol a 100% à temperatura ambiente, durante 7-10 dias. NOTA: A partir desta etapa em diante, não use metal ou plástico para manipular ou armazenar a resina.
2 Preparar a solução de Drogas para carregar
- Dissolve-se o fármaco de escolha em 0,1% de dimetil-sulfóxido (DMSO). Adicione a solução de fármaco até 40 mL de volume.Carregar a resina com três vezes a concentração do medicamento que seria dado numa dose única.
3. Preparar e carregar o complexo de droga-resina
- Transferir os 20 pelotas lavadas com outra pequena proveta de vidro. Dissolve-se as pelotas em 4 ml de diclorometano durante aproximadamente 45 min. Cobrir o copo com Parafilm enquanto as pelotas estão se dissolvendo.
- Prepara-se uma solução de Fast Green FCF, dissolvendo-o em 0,1% de DMSO a uma concentração de 0,001 mg / ml.
- Tome uma pipeta, e elaborar 40 mL da solução da droga preparada anteriormente. Coloque outra pipeta, com 40 ml de solução de Fast Green.
- Adicionar as duas soluções em simultâneo para o copo. Mistura-se rapidamente com uma vareta de vidro, até que o corante verde é uniformemente distribuída por toda a mistura.
- Imediatamente transferir a taça sobre gelo seco durante 10 min a congelação rápida da resina.
- Configurar uma "câmara de evaporação" para evaporar o solvente. Encha umamaior recipiente até um terço de pedrinhas de sulfato de cálcio. Criar um poço nas pedras, e coloque cuidadosamente o copo no poço para que as pedrinhas chegar até a metade do copo, para estabilizar o copo na câmara.
- Cubra o recipiente fora maior com Parafilm.
- Transferir a câmara de evaporação para o congelador. Manter a -20 ° C durante 2-3 semanas.
4 Prepare o complexo de droga-resina para implantação cirúrgica
- Retire a câmara de evaporação do congelador. Transferir o bloco de droga-resina sólido para um prato de vidro mantidos em gelo.
- Com a ajuda de um microscópio ou lupa, cortar um pedaço de aproximadamente 0,05 mm de diâmetro e 0,1 mm de comprimento do bloco, utilizando uma ferramenta ou punção trefina.
- Envolver o remanescente do bloco de material à prova de congelação (por exemplo, uma folha de alumínio) e manter a -20 ° C até ser necessário.
5. Cirurgicamente Implant o complexo de droga-resina para a Rat Eye
NOTA: A lidocaína cloridrato minimizes desconforto local.
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Representative Results
Electroretinografia de campo total (ERG) foi utilizado para detectar o efeito de APB na retina. Para detalhes sobre como o ERG foi realizada, consulte os seguintes estudos 33,34. Em resumo, depois de anestesiar o animal, um eléctrodo de ouro foi colocado sobre a córnea do olho, e o eléctrodo de referência foi colocado no couro cabeludo anterior, entre os olhos, para registar a actividade eléctrica da retina. Os estímulos foram geradas usando uma unidade de flash electrónico e a intensidade variou de 10-10 junho fotoisomerização, que representa o número de moléculas fotossensíveis activados por vara. Nestas experiências, os registos de ERG foram tomadas a 1 e 7 dias após o procedimento. O olho direito de cada animal foi implantado com o complexo de droga-resina, ao passo que o sujeito olho esquerdo foi usado como controlo interno não tratada.
A Figura 1 mostra as alterações na amplitude da onda b com um aumento por fotoisomerização haste(Φ). No olho de controlo, a amplitude da onda b aumenta à medida que aumenta a intensidade de flash. Na Figura 1A, as gravações de resposta da retina é dado um dia após o implante. O olho implantado mostrou um padrão de amplitude semelhante ao olho de controlo. A diferença de amplitude entre os dois olhos tornou-se significativamente diferentes em 10 6 φ (p <0,0001). Isto indica que, nesta fase inicial, o complexo de droga-resina não tem um efeito sobre a resposta da retina até atingir intensidades de inflamação superiores. Figura 1B mostra alterações na resposta do ERG aos 7 dias após a implantação. A onda b é abolida em todos os níveis de intensidade de flash no olho implantado, quando comparado com o olho de controlo, que tem amplitudes comparáveis às gravações 1 dia. Este valor é significativamente diferente de todas as amplitudes de olho implantado a 1 dia (p <0,0001). Isto mostra que a resposta da retina foi abolida por (uma semana) após as implantatino complexo de droga-resina para dentro do olho.
Figura 1 A amplitude da onda b no 1 dia e 1 semana após a implantação do complexo de droga-resina. Para ambos os painéis, o olho de controlo é mostrado na laranja (quadrados), enquanto que o olho implantado é mostrado em verde ( círculos). O símbolo * representa significado neste ponto entre os dois olhos, onde p <0,0001. Para todos os grupos, n = 5 (A) A amplitude da onda b 1 dia após a implantação do complexo de droga-resina para dentro do olho. A amplitude da onda b no que diz respeito à intensidade de flash (fotoisomerização por haste φ) é um indicador da resposta da retina. Não existe diferença significativa na amplitude da onda b entre os olhos em todas as intensidades de flash em 10 excepto φ 6, em que o olho implantadotem uma amplitude menor. (B) A amplitude da onda b 1 semana (7 dias) depois da implantação. As amplitudes registradas de ambos os olhos são significativamente diferentes em todas as intensidades de flash. Na retina implantado, amplitude da onda-b não era mensurável em qualquer intensidade de estímulo.
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Discussion
Este trabalho demonstrou a utilização de um complexo de droga-resina para a entrega de libertação lenta de drogas para a retina. Nosso objetivo foi apresentar um método que é relativamente barato e fácil de aplicar em um modelo animal pequeno.
Tendo em conta que a função do APB é actuar como um análogo do glutamato, que vai bloquear a resposta da retina no olho. Os resultados mostram que o bloqueio provocado APB da resposta da retina de uma semana após a implantação. Isto indica que foi APB modelo com sucesso para dentro do vítreo e da retina, e que o seu efeito foi reduzido para o olho, que o complexo droga-resina foi implantado. O efeito total do fármaco tornaram-se evidentes, uma semana após a implantação (Figura 1B). Figura 1A mostra que o fim de 1 dia após a implantação, uma redução significativa da onda b só estava presente em 10 a 6 intensidade φ nos olhos implantados. Isto pode indicar que, neste ponto de tempo precoce, apenas ocone de via, que responde a maiores intensidades de luz, foi afetada. Para determinar a duração do tempo que a resina pode entregar o APB para a retina, mais pontos de tempo deve ser investigada. Propõe-se que deve ser tomado em gravações mais pontos de tempo dentro do intervalo de 0-7 dias, por exemplo, aos 3 e 5 dias após a implantação, para determinar exactamente quando a resposta da retina é totalmente abolido. Além disso, as gravações devem ser tomadas além de 7 dias, para determinar quanto tempo o APB é liberado para. Este seria evidente como a resposta da retina iria continuar a ser abolido se APB está continuamente sendo liberado lentamente dentro do vítreo.
Neste estudo, o complexo de droga-resina foi encontrado para ser seguro para entrega para a retina. APB foi dissolvido em DMSO a 0,1%. Em concentrações iguais ou superiores a 0,6%, o DMSO pode causar toxicidade da retina. No entanto, a 0,1% de DMSO foi encontrado para ser um meio seguro para o fornecimento de compostos para oolho de rato 35, e esta concentração foi usada em todas as experiências no presente estudo. Os implantes foram inseridos transclerally na cavidade vítrea a ora serrata. Os implantes foram observados para permanecer na ora serrata em criocortes de olho de rato, o qual foi recolhido depois de os registos de ERG foram feitos. Este posicionamento do implante garante que o complexo droga-resina não causa problemas de visão. Este método envolve o complexo droga-resina foi testado com outros compostos (publicação em preparação), e verificou-se que nenhum dano estrutural ou funcional para o olho foi observado até dois meses após a implantação. Um total de 60 animais foram implantados, e em 90% dos casos, a posição do implante permaneceu inalterado.
Várias modificações podem ser feitas para a técnica, se necessário. Nestas experiências, três vezes a concentração de uma única dose do APB foi carregado na resina (50 ^ M x 3 = 150 uM), e isto should ser usado como um guia para a preparação da solução da droga para o carregamento. No entanto, a concentração eficaz do fármaco na resina é variável, e devem ser testadas e modificadas em conformidade. Os pontos de tempo em que a análise é conduzida também pode ser modificado, para determinar quanto tempo a resina é eficaz em libertar o fármaco. Nestas experiências, foi mostrado que a dose eficaz estável do fármaco é distribuído através do complexo de droga-resina, pelo menos, uma semana, então recomenda-se que a análise do tecido é realizada pelo menos uma semana após a implantação. Durante o passo de carga de droga, Fast Green foi usada para assegurar que a mistura tinha homogeneizada. Outros corantes de cor biologicamente seguras podem ser utilizadas como uma alternativa para Fast verde, para visualizar a uniformidade da droga no interior da resina. A limitação deste método é que o corante verde rápido é a única medida de uma mistura uniforme. Esta técnica também pode ser testada utilizando modelos animais e medicamentos alternativos, com apenas pequenas anúnciocessária para o método. Se uma quantidade maior de medicamento, tem de ser entregue, um implante de tamanho maior podem ser necessários. Se for bem sucedido nestes modelos, esta resina de copolímero pode ser considerado como uma opção terapêutica para a entrega de drogas lentamente à retina para ter um efeito continuado ao longo do tempo.
Há vários passos críticos no âmbito do protocolo onde o cuidado extra deve ser tomado. Instrumentos de plástico e de metal não deve ser usado em toda a síntese e manipulação da resina. Isto impede a contaminação do polímero, como o diclorometano pode dissolver plástico e corroer metal. Secura adequada do bloco de drogas resina devem ser alcançados antes de usá-lo para implantação cirúrgica. Certifique-se de que o copo contendo a droga e a resina está completamente exposto para o sulfato de cálcio, a fim de evaporar o solvente. Alternativamente, um liofilizador pode ser usada para liofilizar-se a resina de drogas. O bloco de droga-resina está pronta para utilização, quando o solvente ter evaporado totalmente, eapenas um bloco sólido azulado permanece no copo. Ao cortar um pedaço do bloco para a implantação, cada peça só deve ser preparada imediatamente antes da cirurgia, como as peças são muito pequenas e são difíceis de armazenar. Uma ferramenta ou punção trefina deve ser usada para cortar pedaços de igual tamanho, garantindo que cada peça contém aproximadamente a mesma quantidade de fármaco. Finalmente, ao inserir a peça no ferimento feito pelo G agulha 25, use uma pinça fina, pontudas para guiar cuidadosamente a peça na ferida. Um microscópio cirúrgico ou de alta lupa poder deve ser usado como uma ajuda visual.
Apenas fármacos hidrofílicos e compostos foram testados usando este método. Os complexos de droga-resina não mostraram qualquer precipitação ou a formação de subproduto indesejável, quando o fármaco foi misturado com o polímero e o diclorometano. Sugere-se que, com cada nova droga, a concentração, a meia-vida do efeito, e quaisquer possíveis reacções com a mistura de resina deveser testada pelo utilizador para determinar se o método é adequado.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elvax 40W Pellets | Du Pont, DE, USA | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA | ||
| 2-amino-4-phosphonobutyric acid (APB) | Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA | A1910 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA | 34856 | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA | ||
| Drierite, calcium sulfate | Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA | 238910 | |
| Ketamine, Ilium Ketamil | Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia | ||
| Xylazine, Ilium Xylazil-20 | Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia | ||
| Atropine sulphate, Minims eye drops | Bausch & Lomb Pty. Ltd., NSW, Australia | ||
| Tetracaine hydrochloride, Minims eye drops | Bausch & Lomb Pty. Ltd., NSW, Australia | ||
| Chloramphenicol, Chlorsig ointment | Aspen Pharma Pty. Ltd., NSW, Australia | ||
| Pentobarbital, Lethabarb | Virbac Australia Pty. Ltd., NSW, Australia | ||
| Lidocaine hydrochloride, Ilium Lignocaine-20 | Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia | ||
| Uni-Core Punch Tool | World Precision Instruments Inc., FL, USA | ||
| Curved Forceps | World Precision Instruments Inc., FL, USA | ||
| Operating Microscope, Zeiss OPMI 99 | Zeiss, West Germany | ||
| 25 G Insulin needle | Terumo Corp., Tokyo, Japan | ||
| Dumont tweezers | World Precision Instruments Inc., FL, USA |
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