Summary
Dettagli del presente documento come Elvax 40W può essere utilizzato come metodo lento rilascio per la somministrazione di farmaci alla retina di ratto adulto. Il protocollo per la preparazione, il caricamento, e consegna del complesso farmaco-resina per l'occhio viene descritto.
Abstract
Malattie della retina sono difficili da trattare, come la retina si trova in profondità all'interno dell'occhio. Metodi invasivi di somministrazione di farmaci sono spesso necessari per il trattamento di queste malattie. Malattie della retina croniche come l'edema retinico o neovascolarizzazione di solito richiedono più iniezioni intraoculari per trattare efficacemente la condizione. Tuttavia, i rischi associati a queste iniezioni aumentano con la consegna ripetuta del farmaco. Pertanto, metodi di consegna alternativi devono essere stabiliti in modo da minimizzare i rischi di reiniezione. Diversi altri studi hanno sviluppato metodi per fornire farmaci nel corso del tempo prolungato, attraverso materiali capaci di rilasciare sostanze chimiche lentamente nell'occhio. In questa indagine, delineiamo l'uso di Elvax 40W, una resina copolimero, di agire come un veicolo per la somministrazione di farmaci alla retina di ratto adulto. La resina è realizzato e caricato con il farmaco. Il complesso farmaco-resina viene poi impiantato nella cavità vitreale, dove lentamente rilasciare il farmaco sopra time. Questo metodo è stato testato utilizzando 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB), un analogo glutammato che blocca la risposta luce della retina. È stato dimostrato che l'APB è stato rilasciato lentamente dalla resina, ed è stato in grado di bloccare la risposta della retina di 7 giorni dopo l'impianto. Ciò indica che la somministrazione di farmaci a lento rilascio con questa resina copolimero è efficace per il trattamento della retina, e potrebbe essere utilizzato terapeuticamente con ulteriori test.
Introduction
Il trattamento di malattie croniche come il diabete e pressione alta presenta molte sfide, in quanto queste malattie in genere richiedono un trattamento per lunghi periodi di tempo, spesso per tutta la vita. Ciò ha richiesto lo sviluppo di sistemi di somministrazione di farmaci a rilascio lento, che riducono la necessità di dosaggio frequente. L'efficacia di questi metodi a lento rilascio è stata dimostrata attraverso lo sviluppo di pompe di insulina, per ridurre il numero di iniezioni di insulina necessarie per trattare il diabete. Le malattie croniche degli occhi, in particolare quelli che interessano i suoi strati interni, richiedono la somministrazione frequente di farmaci attraverso procedure invasive. Una tale malattia cronica che colpisce l'occhio umano è la degenerazione maculare senile (AMD). Essa colpisce la retina centrale, che è uno strato di tessuto neurale situata nella parte posteriore dell'occhio responsabile di avviare la visione. AMD è la principale causa di cecità nel mondo occidentale 1. Una sfida particolare per il trattamento di rimalattie fonodale è che il farmaco è necessario per raggiungere questo strato profondo negli occhi, che spesso richiede metodi invasivi di consegna. I farmaci sono di solito somministrati alla camera vitreo e la retina con iniezioni intravitreali. Tuttavia, con ogni iniezione vi è il rischio di complicanze post-iniezione, tra cui endoftalmite, distacco di retina, cataratta ed emorragia del vitreo 2. Tale rischio è moltiplicato per ogni reiniezione del farmaco.
Ridurre la necessità di iniezioni multiple sarebbe un vantaggio importante nel trattamento di AMD. Per trattare la forma umida di AMD, in cui la crescita di nuovi vasi è un segno distintivo, la strategia terapeutica stabilita è di indirizzare i fattori di crescita endoteliale (VEGF) utilizzando inibitori VEGF 3. Allo stato attuale, questi vengono forniti attraverso iniezioni intravitreali ripetute. Allo stesso modo, per il trattamento di edema maculare, una complicanza comune della retinopatia diabetica, i corticosteroidi vengono consegnati attraverso iniezioni ripetute La nozione di un sistema di erogazione di farmaci a lento rilascio è stata descritta prima con un veicolo gomma di silicone per offrire piccole molecole in tessuti animali 5. Da allora, altri metodi a lento rilascio sono stati sviluppati per fornire molecole più grandi, molti dei quali sono stati testati negli occhi. Vettori di particelle, come microsfere biodegradabili, poli-lattide-co-glicolico (PLGA) nanoparticelle e vescicole fosfolipidiche (liposomi) possono essere utili come veicoli di consegna 6,7. Nanoparticelle di PLGA e liposomi sono stati confrontati in un ambiente in vitro per la loro capacità di fornire agenti anti-cancro attraverso la sclera nel tempo 7. Entrambi i veicoli sono stati efficaci nel rilasciando lentamente la droga. Tuttavia, lo studio è stato condotto solo in un ambiente in vitro. Bochot et al. (2002) 8 testatil'efficacia di liposomi per fornire molecole alla retina in vivo. Essi hanno dimostrato che i liposomi consegnare con successo i piccoli oligonucleotidi alla retina di coniglio. Gli autori hanno suggerito che i liposomi potrebbe essere utile nel trattamento di malattie della retina 8. Tuttavia, la natura di queste vescicole a galleggiare nel vitreo significa che essi saranno probabilmente sfocare o mettere in pericolo la visione 9. Okabe et al. (2003) 10 usato dischi non polimeriche biodegradabili costituite da 33% acetato di etilene-vinile applicare beta-methasone nei conigli. Hanno impiantato dischi in una tasca sclerale e dimostrato l'effettivo rilascio del farmaco nel vitreo e retina per fino a un mese 10. Tuttavia, in questo particolare protocollo, l'impianto era relativamente grande e rigido, e richiede una procedura chirurgica più complessa che include una vasta incisione sclerale e la sutura. Un precedente studio ha esaminato la tissue risposta a vari veicoli polimero li impiantare nella cornea degli occhi di coniglio, e ha scoperto che di etilene-vinile copolimeri acetato lavati in alcool non causano infiammazione o irritazione. Questi complessi sono stati mostrati per sostenere l'erogazione dei composti più grandi in tessuti animali per lunghi periodi di tempo, qualche superiore fino a 100 giorni dipendenti dal farmaco 11. Un tale tipo di resina copolimero è stato sviluppato industrialmente in forma di Elvax 40W (40% in peso di etilene-vinil acetato contenuto di comonomero con un additivo ammide 'W' per migliorare la maneggevolezza pellet). Questa resina copolimero è una sostanza inerte, stabile sia ambiente e la temperatura corporea. Non è stato dimostrato di causare allergie o tossicità nei tessuti biologici. Questa resina ha effettivamente fornito una grande varietà di farmaci in diversi modelli sperimentali che investigano le funzioni dei vari sistemi, come il sistema duttale mammario 12, la corteccia uditiva primaria 13,14 </ Sup>, e il sistema visivo 15 rana. Questa resina è stata utilizzata anche negli occhi di consegnare la droga a sviluppare tartaruga 16,17, pollo embrione 18,19, e furetto adulto retine 20. Nel sistema nervoso centrale di ratto, la resina è stata utilizzata solo nel cervello 21-23, ma il suo uso nell'occhio ratto non è stata documentata. I vantaggi di utilizzare questa resina copolimero a consegnare i farmaci lentamente alla retina rispetto ad altri metodi, è che si tratta di un composto stabile che non provoca infiammazione o irritazione negli occhi. A differenza di vettori di particelle, il complesso farmaco-resina non compromettere la visione dopo l'impianto, che rimane normalmente nel sito di consegna anziché galleggianti nel vitreo. Sarebbe necessario soltanto un semplice processo di impianto nella cavità vitreale vicino al limbus dell'occhio, e non richiederebbe sutura dopo l'impianto. Recentemente, c'è stato un emergere in diversi sistemi di consegna di nuovi, come ad esempiotecnologia delle celle incapsulate (ECT) 24,25, gli idrogel 26, 27 e microfilm. Tuttavia, il metodo utilizzato nel presente studio per la preparazione e la realizzazione del complesso farmaco-resina è sia facile da seguire e poco costoso, essendo quindi più vantaggioso per l'utilizzo in un ambiente di ricerca di base. La sfida di utilizzare questo complesso per fornire trattamenti farmacologici a lungo termine è quello di determinare la concentrazione ottimale del farmaco in grado di massimizzare i benefici terapeutici di avere un minor numero di iniezioni intravitreali. Questo lavoro si propone di illustrare l'utilizzo del complesso farmaco-resina per trattamento a lungo termine della retina di ratto adulto. L'efficacia di questa modalità di consegna viene testata utilizzando il glutammato analogico 2-amino-4-phosphonobutyrate (APB), come la droga. APB blocca la risposta luce delle cellule bipolari ON imitando glutammato, un neurotrasmettitore endogeno nella retina 28. Quando APB compete con glutammato per il suo recettore, blocca il lighrisposta t. APB è stato utilizzato in studi fisiologici per controllare la funzione retinica e misurare il suo effetto utilizzando metodi elettrofisiologici quali elettroretinografia (ERG). In studi precedenti, APB è stato usato sia a breve termine 29 e trattamento a lungo termine della retina sviluppo; quest'ultimo coinvolto dando una dose singola per via intraoculare giorno per 30 giorni 30. La stessa quantità di APB (0,092 mg in soluzione fisiologica sterile, ad una concentrazione di 50 mM) è stato utilizzato per tutte le iniezioni come suggerito nel precedente 28,29,31 lavoro. Abbiamo scelto APB per testare il complesso farmaco-resina come veicolo lento rilascio per fornire farmaci nell'occhio. I metodi descritti in questo studio sono simili ai metodi precedentemente descritti comportano la preparazione del farmaco-resina complesso 16,32; tuttavia abbiamo anche dettaglio il suo utilizzo specifico negli occhi ratto adulto. Dopo impianto chirurgico della resina APB-caricato nell'occhio, ERG è stata eseguita per stabilire se APB abolisce il rrisposta chiara etinal, e quindi se APB è stata rilasciata con successo nel vitreo e la retina.
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Protocol
Tutti gli esperimenti condotti erano in conformità con la Dichiarazione ARVO per l'uso di animali in Oftalmica e Vision Research, e con l'approvazione dell 'Università di L'Aquila comitato etico degli animali e la sperimentazione comitato etico degli animali Australian National University. Ratti adulti (P100-200) sono stati utilizzati in questo studio.
1 Preparare il pellet Copolimero resina
- Mettere 20 pellet Elvax 40W in un piccolo bicchiere di vetro nella cappa.
- Riempire il bicchiere con il 100% di etanolo garantire a coprire tutte le pellet.
- Coprire il becher con Parafilm, e godersi il pellet in 100% di etanolo a temperatura ambiente per 7-10 giorni. NOTA: Da questo punto in poi, non utilizzare metallo o plastica per maneggiare o conservare la resina.
2 Preparare la soluzione di droga per il caricamento
- Sciogliere il farmaco di scelta nel 0,1% dimetilsolfossido (DMSO). Rendere la soluzione farmaco fino a 40 microlitri di volume.Caricare la resina con tre volte la concentrazione del farmaco che verrebbe somministrato in una singola dose.
3 Preparare e caricare il complesso farmaco-resina
- Trasferire le 20 palline lavati in un altro bicchiere di vetro piccolo. Sciogliere il pellet in 4 ml di diclorometano per circa 45 min. Coprire il becher con Parafilm, mentre i pellet si stanno dissolvendo.
- Preparare una soluzione di Fast Verde FCF sciogliendolo in 0,1% DMSO ad una concentrazione di 0,001 mg / ml.
- Prendete una pipetta, e redige 40 microlitri della soluzione di farmaco preparato in precedenza. Caricare un altro pipetta con 40 ml di soluzione veloce verde.
- Aggiungere le due soluzioni contemporaneamente nel bicchiere. Mescolare rapidamente con un bicchiere mescolando asta fino a quando il colorante verde è distribuita uniformemente in tutta la miscela.
- Prontamente trasferire il bicchiere sul ghiaccio secco per 10 minuti per congelare la resina digiunare.
- Impostare una "camera di evaporazione" per far evaporare il solvente. Riempire uncontenitore più grande fino a un terzo con ciottoli solfato di calcio. Creare un pozzo in ciottoli, e posizionare con cura il bicchiere nel pozzo in modo che i sassolini arrivano fino alla metà del bicchiere, per stabilizzare il bicchiere nella camera.
- Coprire il contenitore esterno più grande con Parafilm.
- Trasferire la camera di evaporazione per il freezer. Conservare a -20 ° C per 2-3 settimane.
4 Preparare il complesso farmaco-resina per impianto chirurgico
- Rimuovere la camera di evaporazione dal freezer. Trasferire il blocco farmaco-resina solida per un piatto di vetro tenuta in ghiaccio.
- Con l'aiuto di un microscopio o lente, tagliare un pezzo circa 0,05 mm di diametro e 0,1 mm di lunghezza del blocco utilizzando uno strumento di trapano o punzone.
- Avvolgere il resto del blocco in materiale resistente congelamento (ad esempio, un foglio di alluminio) e conservare a -20 ° C fino all'utilizzo.
5. chirurgicamente Implant il complesso farmaco-resina nel ratto Eye
NOTA: lidocaina cloridrato minminimizza le disagio locale.
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Representative Results
Elettroretinografia pieno campo (ERG) è stato utilizzato per rilevare l'effetto di APB sulla retina. Per i dettagli su come è stata eseguita l'ERG, fare riferimento ai seguenti studi 33,34. In breve, dopo anestetizzare l'animale, un elettrodo d'oro è stata posta sulla cornea dell'occhio, e l'elettrodo di riferimento è stato posto nel cuoio capelluto anteriore tra gli occhi, per registrare l'attività elettrica della retina. Gli stimoli sono stati generati utilizzando un flash elettronico e l'intensità variava da 10-10 GIUGNO fotoisomerizzazione, che rappresenta il numero di molecole fotosensibili attivati per asta. In questi esperimenti, registrazioni ERG sono state prese a 1 e 7 giorni procedura di post. L'occhio destro di ciascun animale è stato impiantato con il complesso farmaco-resina, mentre la collega occhio sinistro è stato utilizzato come controllo interno non trattato.
La figura 1 mostra le variazioni di ampiezza del b-onda con un aumento fotoisomerizzazione per asta(Φ). Nell'occhio controllo, l'ampiezza del b-onda aumenta l'intensità del flash aumenta. Nella Figura 1A, registrazioni di risposta della retina sono date 1 giorno dopo l'impianto. L'occhio impiantato mostrato un andamento in ampiezza simile all'occhio controllo. La differenza di ampiezza tra i due occhi è diventato significativamente diversa a 10 6 φ (p <0,0001). Ciò indica che in questa fase iniziale, il complesso farmaco-resina non ha un effetto sulla risposta della retina fino a raggiungere più elevati intensità del flash. Figura 1B mostra i cambiamenti nella risposta ERG a 7 giorni dopo l'impianto. Il b-wave è abolita a tutti i livelli di intensità del flash negli occhi impiantato, rispetto per l'occhio di controllo, che ha ampiezze paragonabili alle registrazioni 1 giorno. Questo è significativamente diversa da tutte le ampiezze per l'occhio impiantato a 1 giorno (p <0,0001). Questo dimostra che la risposta della retina è stata abolita da (una settimana) dopo i implantatisul del complesso farmaco-resina nell'occhio.
Figura 1 L'ampiezza del b-onda a 1 giorno, 1 settimana dopo l'impianto del complesso farmaco-resina. Per entrambi i pannelli, l'occhio di controllo è mostrata in arancione (quadrati), mentre l'occhio impiantato è mostrato in verde ( cerchi). Il simbolo * rappresenta significato a questo punto tra i due occhi, dove p <0,0001. Per tutti i gruppi, n = 5 (A) L'ampiezza del b-onda 1 giorno dopo l'impianto del complesso farmaco-resina nell'occhio. L'ampiezza della b-onda in relazione alla intensità del flash (fotoisomerizzazione per asta φ) è un indicatore della risposta retinica. Non vi è alcuna differenza significativa nella ampiezza b-wave tra gli occhi a tutte le intensità del flash se non a 10 6 φ, dove l'occhio impiantatoha una ampiezza inferiore. (B) L'ampiezza del b-onda 1 settimana (7 giorni) dopo l'impianto. Le ampiezze registrate da entrambi gli occhi sono significativamente differenti in tutte le intensità del flash. Nella retina impiantato, ampiezza di b-onda non era misurabile in qualsiasi intensità di stimolo.
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Discussion
Questo documento dimostra l'uso di un complesso farmaco-resina per la consegna lento rilascio di farmaci alla retina. Abbiamo puntato a presentare un metodo che è relativamente poco costoso e facile da applicare in un piccolo modello animale.
Dato che la funzione di APB è di agire come un analogo glutammato, bloccherà la risposta retinica nell'occhio. I risultati mostrano che APB ha causato il blocco della risposta retinica di una settimana dopo l'impianto. Ciò indica che APB è stato rilasciato con successo nel vitreo e la retina, e che il suo effetto è stato limitato per l'occhio che il complesso farmaco-resina è stato impiantato in. Il pieno effetto del farmaco diventato evidente una settimana dopo l'impianto (Figura 1B). Figura 1A mostra che a 1 giorno dopo l'impianto, una riduzione significativa del b-onda era presente solo l'intensità φ 10 6 nell'occhio impiantato. Questo potrebbe indicare che a questo punto tempo all'inizio, solo lacono percorso, che risponde di intensità di luce più elevate, è stata influenzata. Per determinare il periodo di tempo che la resina in grado di fornire l'APB alla retina, ulteriori punti di tempo dovrebbero essere studiati. Si propone che le registrazioni presso altri punti di tempo nell'arco 0-7 giorni dovrebbero essere prese, per esempio, a 3 e 5 giorni dopo l'impianto, per determinare esattamente quando la risposta della retina è completamente abolita. Inoltre, le registrazioni dovrebbero essere prese al di là di 7 giorni, per determinare quanto tempo l'APB è rilasciato per. Questo sarebbe evidente come la risposta della retina avrebbe continuato ad essere abolito se APB viene continuamente rilasciato lentamente nel vitreo.
In questo studio, il complesso farmaco-resina è stata trovata per essere sicuro per la consegna alla retina. APB è stato disciolto in 0,1% DMSO. A concentrazioni pari o superiore a 0,6%, DMSO può causare tossicità retinica. Tuttavia, 0,1% DMSO è stato trovato per essere un veicolo sicuro per la consegna dei composti alratto occhio 35, e questa concentrazione è stato utilizzato in tutti gli esperimenti in questo studio. Gli impianti sono stati inseriti transclerally nella cavità vitreale alla serrata. Gli impianti sono stati osservati a rimanere alla serrata in criosezioni dell'occhio ratto, che è stato raccolto dopo che sono state effettuate le registrazioni ERG. Questo posizionamento dell'impianto garantisce che il complesso farmaco-resina non provoca problemi visivi. Questo metodo coinvolge il complesso farmaco-resina è stato testato con altri composti (pubblicazione in preparazione), e si è constatato che nessun danno strutturale o funzionale per l'occhio è stato osservato fino a due mesi dopo l'impianto. Un totale di 60 animali è stato impiantato, e nel 90% dei casi, la posizione dell'impianto è rimasto invariato.
Diverse modifiche possono essere apportate alla tecnica se necessario. In questi esperimenti, tre volte la concentrazione di una singola dose di APB è stato caricato nella resina (50 mM x 3 = 150 mM), e questo shoULD essere utilizzato come guida per la preparazione della soluzione di farmaco per il carico. Tuttavia, l'effettiva concentrazione del farmaco nella resina è variabile, e deve essere testato e modificato di conseguenza. I punti di tempo in cui l'analisi viene condotta può anche essere modificato, per determinare quanto tempo la resina è efficace al rilascio del farmaco. In questi esperimenti, è stato dimostrato che la dose stabile efficace del farmaco viene trasportato attraverso il complesso farmaco-resina per almeno una settimana, per cui si raccomanda che l'analisi del tessuto viene effettuata almeno una settimana dopo l'impianto. Durante la fase di caricamento farmaco, Verde fast stato usato per assicurare che la miscela era omogeneizzata. Altri coloranti colore biologicamente sicuri possono essere utilizzati come alternativa a Fast Verde, per visualizzare l'uniformità del farmaco all'interno della resina. Un limite di questo metodo è che il colorante Fast Green è l'unica misura di miscelazione uniforme. Questa tecnica potrebbe anche essere testato utilizzando modelli animali alternativi e farmaci, con solo annuncio minorijustments al metodo. Se una quantità maggiore di farmaco deve essere trasportato, un impianto più grande, può essere necessario. In caso di successo in questi modelli, questa resina copolimero potrebbe essere considerato come opzione terapeutica per fornire farmaci lentamente alla retina per avere un effetto costante nel tempo.
Ci sono diversi passaggi critici all'interno del protocollo in cui dovrebbe essere presa la cura supplementare. Strumenti di plastica e di metallo non devono essere utilizzati durante la sintesi e la manipolazione della resina. Questo impedisce la contaminazione del polimero, come diclorometano può sciogliere plastica e corrodere metalli. Secchezza corretta del blocco farmaco-resina deve essere raggiunto prima di utilizzarlo per impianto chirurgico. Assicurarsi che il becher contenente il farmaco e la resina è completamente esposto al solfato di calcio in modo da far evaporare il solvente. In alternativa, un liofilizzatore può essere utilizzato per congelare asciugare farmaco-resina. Il blocco farmaco-resina è pronto per l'uso quando il solvente è completamente evaporato, esolo un blocco solido bluastro rimane nel becher. Quando si taglia un pezzo dal blocco per l'impianto, ogni pezzo deve essere preparata solo immediatamente prima della chirurgia come i pezzi sono molto piccole e sono difficili da memorizzare. Uno strumento trapano o pugno deve essere usato per tagliare pezzi di uguale dimensione, in modo che ogni pezzo contiene circa la stessa quantità di farmaco. Infine, quando si inserisce il pezzo nella ferita puntura fatta dal G ago 25, utilizzare pinzette a punta fine, per guidare con attenzione il pezzo nella ferita. Un microscopio operatorio o ad alta potenza lente dovrebbero essere usate come un aiuto visivo.
Solo i farmaci idrofili e composti sono stati testati con questo metodo. I complessi farmaco-resina non hanno mostrato alcuna precipitazione o sottoprodotto indesiderata formazione, quando il farmaco è stato mescolato con il polimero e il diclorometano. Si suggerisce che con ogni nuovo farmaco, la concentrazione, tempo di dimezzamento di effetto, e le eventuali reazioni con la miscela di resina deveessere testato dall'utente per determinare se il metodo è adatto.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a divulgazione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elvax 40W Pellets | Du Pont, DE, USA | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA | ||
| 2-amino-4-phosphonobutyric acid (APB) | Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA | A1910 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA | 34856 | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA | ||
| Drierite, calcium sulfate | Sigma-Aldrich Co. LLC., MO, USA | 238910 | |
| Ketamine, Ilium Ketamil | Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia | ||
| Xylazine, Ilium Xylazil-20 | Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia | ||
| Atropine sulphate, Minims eye drops | Bausch & Lomb Pty. Ltd., NSW, Australia | ||
| Tetracaine hydrochloride, Minims eye drops | Bausch & Lomb Pty. Ltd., NSW, Australia | ||
| Chloramphenicol, Chlorsig ointment | Aspen Pharma Pty. Ltd., NSW, Australia | ||
| Pentobarbital, Lethabarb | Virbac Australia Pty. Ltd., NSW, Australia | ||
| Lidocaine hydrochloride, Ilium Lignocaine-20 | Troy Laboratories Pty. Ltd., NSW, Australia | ||
| Uni-Core Punch Tool | World Precision Instruments Inc., FL, USA | ||
| Curved Forceps | World Precision Instruments Inc., FL, USA | ||
| Operating Microscope, Zeiss OPMI 99 | Zeiss, West Germany | ||
| 25 G Insulin needle | Terumo Corp., Tokyo, Japan | ||
| Dumont tweezers | World Precision Instruments Inc., FL, USA |
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