Summary
इकोकार्डियोग्राफी निर्देशित percutaneous intramyocardial इंजेक्शन murine दिल में जीन स्थानांतरण एजेंटों या कोशिकाओं के वितरण के लिए एक कुशल, विश्वसनीय, और लक्ष्य साधन का प्रतिनिधित्व करता है. इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित चरणों का पालन, ऑपरेटर जल्दी से इस बहुमुखी, कम आक्रामक तकनीक में सक्षम हो सकता है.
Abstract
हृदय रोग का murine मॉडल pathophysiological तंत्र की जांच और संभावित पुनर्योजी उपचारों की खोज के लिए महत्वपूर्ण हैं. दौरे इंजेक्शन से जुड़े प्रयोगों वर्तमान में एक thoracotomy के माध्यम से प्रत्यक्ष शल्य चिकित्सा का उपयोग करके प्रदर्शन कर रहे हैं. ऐसे कोरोनरी धमनी बंधाव के रूप में एक और प्रयोगात्मक हेरफेर के समय किया जब सुविधाजनक वहीं intramyocardial वितरण के लिए एक आक्रामक प्रक्रिया के लिए आवश्यकता के संभावित प्रयोगात्मक डिजाइन की सीमा. कभी अल्ट्रासाउंड संकल्प और उन्नत noninvasive इमेजिंग तौर तरीकों में सुधार के साथ, यह नियमित रूप से अल्ट्रासाउंड निर्देशित, percutaneous intramyocardial इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए अब संभव है. इस साधन कुशलतापूर्वक और मज़बूती से मायोकार्डियम के एक लक्षित क्षेत्र के लिए एजेंट बचाता है. इस तकनीक का लाभ शल्य रुग्णता का परिहार, चुनिंदा अल्ट्रासाउंड मार्गदर्शन में मायोकार्डियम के क्षेत्रों को लक्षित करने की सुविधा है, और myocardiu को injectate देने का अवसर शामिलकई पूर्व निर्धारित समय अंतराल पर एम. अभ्यास तकनीक के साथ, intramyocardial इंजेक्शन से जटिलताओं दुर्लभ हैं, और चूहों जल्दी संवेदनाहारी से वसूली पर सामान्य गतिविधि के लिए वापसी. इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित चरणों का पालन, बुनियादी इकोकार्डियोग्राफी अनुभव के साथ ऑपरेटर जल्दी से इस बहुमुखी, कम आक्रामक तकनीक में सक्षम हो सकता है.
Introduction
हृदय रोग प्रतिवर्ष 600,000 लोगों की मृत्यु 1 के लिए लेखांकन, संयुक्त राज्य अमेरिका में पुरुषों और महिलाओं दोनों के लिए मौत का प्रमुख कारण है. हृदय रोग का murine मॉडल pathophysiological तंत्र की जांच के लिए और संभावित उपचारों की खोज के लिए महत्वपूर्ण हैं. जीन थेरेपी वैक्टर के दौरे वितरण, कोशिकाओं, संशोधित RNAs, और हृदय रोग 2-7 के लिए उनके चिकित्सीय क्षमता के अन्य चिकित्सीय एजेंट परमिट जांच स्टेम. वर्तमान में, माउस मॉडल 6 में चिकित्सीय एजेंटों के दौरे प्रसव के लिए सीमित विकल्प हैं. प्रत्यक्ष दृश्य के तहत Intramyocardial इंजेक्शन आमतौर पर इस्तेमाल किया, लेकिन एक sternotomy या thoracotomy की आवश्यकता है और दिल के उजागर क्षेत्र तक ही सीमित है. ऐसे लाड बंधाव के रूप में एक और प्रयोगात्मक हेरफेर के समय किया जब सुविधाजनक वहीं intramyocardial वितरण के लिए एक आक्रामक प्रक्रिया के लिए आवश्यकता के संभावित प्रयोगात्मक डिजाइन की सीमा और एक परिचयप्रक्रिया से dditional प्रभाव (जैसे, thoracotomy के कारण फाइब्रोसिस). वायरल वैक्टर percutaneous पेरिकार्डियल वितरण सूचना दी गई है, लेकिन साइट और चिकित्सीय एजेंट के वितरण सजातीय नहीं है और नियंत्रण 8 के लिए मुश्किल है. इंजेक्शन सामग्री, लेकिन कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कोरोनरी प्रसव के अधिक समरूप वितरण में percutaneous कोरोनरी इंजेक्शन परिणाम murine मॉडल में चुनौती दे रहा है.
यहाँ, हम अल्ट्रासाउंड मार्गदर्शन में चिकित्सीय एजेंटों की न्यूनतम इनवेसिव, ऑपरेटर नियंत्रित लक्ष्यीकरण की अनुमति देता है कि एक बंद छाती intramyocardial इंजेक्शन तकनीक का वर्णन. तकनीक, जानने के लिए आसान है thoracotomy या sternotomy और उनके परिचर प्रयोगात्मक जटिलताओं के लिए जरूरत अनावश्यक है, और समय और intramyocardial इंजेक्शन की साइटों पर अधिक से अधिक लचीलापन प्रदान करता है. इस प्रकार, इकोकार्डियोग्राफी की सहायता intramyocardial इंजेक्शन जोड़ तोड़ की एक तकनीकी रूप से सरल और अत्यधिक प्रभावी विधि का प्रतिनिधित्व करता हैmurine प्रयोगात्मक मॉडल में मायोकार्डियम.
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Protocol
सभी वर्णित चरणों बोस्टन बच्चों के अस्पताल के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत प्रदर्शन किया गया.
1 तैयारी
- Intramyocardial इंजेक्शन के लिए इष्टतम तय ट्रांसड्यूसर स्थिति शरीर रचना और समारोह के मूल्यांकन की रूपरेखा के लिए इष्टतम मानक दृश्य उपज नहीं हो सकता है, जैसा कि पूर्व इंजेक्शन प्रोटोकॉल शुरुआत करने इकोकार्डियोग्राफी द्वारा आधारभूत हृदय संरचनात्मक और कार्यात्मक मूल्यांकन कार्य करें.
- इंजेक्शन सेटअप आंकड़े 1 ए -1 सी में दिखाया गया है. एक sheathed सुई के साथ एक खाली सिरिंज प्लेस, बेवल उन्मुख ऊपर की तरफ, सिरिंज दबाना में (चित्रा 1C देखें) और स्कैन सिर दबाना में अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर जांच सुरक्षित (चित्रा 1 बी देखें). स्कैन सिर दबाना गेंद ताला संयुक्त (चित्रा 1 बी) ढीला और यह सुई की धुरी के समानांतर गठबंधन किया है कि ताकि ट्रांसड्यूसर उन्मुखीकरण हेरफेर. Scan- फिक्सस्कैन सिर दबाना गेंद ताला संयुक्त कस द्वारा सिर की स्थिति.
नोट: वयस्क चूहों में इंजेक्शन के लिए, एक 1 इंच / 2.5 सेमी लंबाई के साथ एक 30 जी सुई इष्टतम है. एक gastight सिरिंज छोटे संस्करणों की अधिक सटीक नियंत्रण (5-10 μl) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि एक 1 मिलीलीटर सिरिंज, बड़ी मात्रा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. - अपनी संपूर्णता साथ सिर को कवर करने के लिए एक रंग के साथ ट्रांसड्यूसर टिप करने के लिए उदारतापूर्वक अल्ट्रासाउंड जेल लागू करें. ध्यान से सुई unsheathe और सुई सीधे ट्रांसड्यूसर के तहत और दृश्य के लिए अल्ट्रासाउंड जेल के भीतर सुई अग्रिम करने के लिए नियंत्रण माउंट का उपयोग करें. सुई अल्ट्रासाउंड छवि पर इसकी लंबाई के साथ स्पष्ट रूप से कल्पना की है कि ताकि सुई नियंत्रण माउंट का उपयोग मामूली समायोजन करें. ट्रांसड्यूसर ठीक से 1.4 कदम में सुई के समानांतर गठबंधन किया गया था तो यह उन्नत और इंजेक्शन नियंत्रण दस्ता (चित्रा 1C) के साथ वापस ले लिया है, तो सुई इमेजिंग विमान के भीतर रहना चाहिए.
- बाद के चरणों में, जरूरत परेशान मत करोक्षैतिज अक्ष में या तो ले जाकर ले / ट्रांसड्यूसर क्षैतिज संरेखण. बल्कि, सुई की खड़ी (शाफ़्ट) स्थिति माउंट बदलकर और पशु मंच ले जाकर इंजेक्शन के लिए दिल के विशिष्ट क्षेत्रों को लक्षित.
- पशु मंच पर anesthetized माउस के बाद नियुक्ति की अनुमति के लिए स्कैन ऊंचाई नियंत्रण (चित्रा 1 बी) का उपयोग कर पशु मंच से ऊंचा ट्रांसड्यूसर ले जाएँ. इस सुई की लंबी अक्ष के ट्रांसड्यूसर की एक्स अक्ष संरेखण को बाधित नहीं होगा.
- सिरिंज दबाना से संरेखण के लिए इस्तेमाल किया और ध्यान से त्यागने था कि सिरिंज निकालें. नई सुई लोड और सिरिंज टिप में मृत अंतरिक्ष के लिए अनुमति देता है, अंतिम लक्ष्य मात्रा को injectate साथ सिरिंज. हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए सावधान रहें. इसकी एक्स अक्ष संरेखण समायोजन के बिना सिरिंज दबाना में सिरिंज रखें. पूरी तरह से इंजेक्शन नियंत्रण का उपयोग सिरिंज वापस लेना.
नोट: प्रारंभिक प्रशिक्षण प्रयोजनों के लिए, इवान नीले रंग का उपयोगडाई (1%), Trypan नीले दाग (0.4%) या injectate रूप फ्लोरोसेंट microspheres की एक निलंबन योग्यता और लक्षित इंजेक्शन की सफलता की पुष्टि में ऑपरेटर की सहायता कर सकते हैं.
2 इंजेक्शन
- ताप मंच का एकीकृत गरम पर मुड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए यह निर्धारित किया है. ऑपरेटर के लिए निकटतम पशु की संज्ञाहरण नली बंद और सिर के साथ, सामान्य इमेजिंग अभिविन्यास से पशु मंच 180 ° रखें. यह (सीने के बाईं ओर में) दिल सिरिंज दबाना और सुई को ipsilateral होने के लिए अनुमति देता है. नोट: पशु मंच करने के लिए अतिरिक्त नाबालिग दक्षिणावर्त घूर्णन समायोजन इंजेक्शन (2A चित्रा) के लिए इस्तेमाल किया जाएगा कि parasternal कम अक्ष इमेजिंग विमान के लिए सही ढंग से दिल उन्मुख करने के लिए आवश्यक हो सकता है.
- पहले 9 के रूप में रिपोर्ट इकोकार्डियोग्राफी के लिए चूहों तैयार करें. 2% isoflurane साथ एक प्रेरण कक्ष में माउस anesthetize. बालों को हटाने क्रीम एक साथ छाती के बाल निकालेंश्वेतपटल के सूखने को रोकने के लिए दोनों आंखों को जेल चिकनाई लागू घ.
- स्कैन सिर ऊंचाई नियंत्रण (चित्रा 1 बी) का उपयोग ट्रांसड्यूसर उठाएँ. 1-3 isoflurane% (आंकड़े 2A-2 बी) पहुंचाने एक नाक शंकु के भीतर थूथन के साथ गरम पशु मंच के ऊपर anesthetized माउस लापरवाह रखें. धीरे एक गुदा जांच डालने और बिजली के संपर्क के लिए इलेक्ट्रोड जेल लागू करने, ईसीजी इलेक्ट्रोड को चार पंजे टेप.
नोट: संज्ञाहरण की एक उचित स्तर जानवर की मानवीय व्यवहार के लिए सुनिश्चित किया जाना चाहिए. दिल की दर में कोई बदलाव नहीं आया और छाती दीवार के माध्यम से सुई की नियुक्ति के लिए कोई प्रतिक्रिया नहीं होनी चाहिए. हाइपोथर्मिया रिश्तेदार मंदनाड़ी, निलय फैलने, और संभव असुविधा का परिणाम देगा के रूप में पशु मंच का एकीकृत समस्थिति तापमान नियंत्रण, normothermia (37 ± 0.5 डिग्री सेल्सियस) बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. - माउस पशु मंच पर सुरक्षित है एक बार, depila पर ट्रांसड्यूसर कमस्कैन सिर ऊंचाई नियंत्रण (चित्रा 1 बी) का उपयोग टेड छाती. दिल मानक एचोकर्दिओग्रफिक तकनीक के अनुसार, parasternal कम अक्ष अभिविन्यास में देखे जा करने के लिए इंजेक्शन के लिए इष्टतम अल्ट्रासाउंड सेटअप है. कम अक्ष इमेजिंग विमान (आंकड़े 2A-2 बी) में इंजेक्शन के लिए इष्टतम ध्वनिक खिड़की प्राप्त करने के लिए पशु मंच 20-30 ° दक्षिणावर्त घुमाएँ. नोट: वैकल्पिक रूप से, इंजेक्शन पशु मंच (चित्रा -2) की वामावर्त रोटेशन से एक parasternal लंबे अक्ष उन्मुखीकरण से किया जा सकता है.
- देखने के क्षेत्र को समायोजित करने के लिए और बाएं निलय मायोकार्डियम में किसी भी वांछित इंजेक्शन साइट को लक्षित करने के लिए पशु मंच समायोजन नियंत्रण का प्रयोग करें. बाएं निलय मायोकार्डियम (आंकड़े 3 ए -3 सी) में वांछित इंजेक्शन स्थान लक्षित करने के लिए दिल के आधार पर शीर्ष से पीछे और आगे पैन. नोट: midpapillary parasternal कम अक्ष दृश्य (चित्रा 3A) reproducibl प्रदान करता हैइंजेक्शन साइट का फॉलोअप इमेजिंग की अनुमति है कि ई स्थलों. नोट: वैकल्पिक रूप से, parasternal लंबे अक्ष दृश्य एक पूर्वनिर्धारित इंजेक्शन साइट (चित्रा 3 डी) को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- पूरी तरह से मुकर सिरिंज दबाना में सिरिंज के साथ शुरू, धीरे धीरे इंजेक्शन नियंत्रण दक्षिणावर्त (चित्रा -4 ए) मोड़ से पशु की छाती की ओर सिरिंज अग्रिम. यह छाती दृष्टिकोण के रूप में दिल और सुई टिप दोनों का स्पष्ट अल्ट्रासाउंड दृश्य अनुमति देने के लिए, छाती के बाएं किनारे पर अल्ट्रासाउंड जेल का खूब इस्तेमाल करते हैं और इकोकार्डियोग्राफी नियंत्रण पर देखने का एक व्यापक क्षेत्र की स्थापना द्वारा ध्वनिक खिड़की का अनुकूलन. इंजेक्शन के लिए लक्ष्य साइट पर केन्द्र बिन्दु / क्षेत्र सेट करें. सुई को मामूली समायोजन नियंत्रण इसकी लंबाई के साथ सुई की छवि का अनुकूलन कर सकते माउंट.
नोट: कुछ अल्ट्रासाउंड मशीनों डिजिटल लक्ष्य मायोकार्डियम के माध्यम से सुई की लंबी अक्ष के साथ एक लाइन का विस्तार करने के लिए एक सुई गाइड सॉफ्टवेयर समारोह(चित्रा 4 बी). इस तरह की एक सॉफ्टवेयर उपकरण सहायक हो लेकिन जरूरी नहीं है सकते हैं. - पशु उचित बेहोश साथ, ध्यान से सब पर beveled सुई टिप की स्थिति देख, माउस की छाती दीवार के माध्यम से और मायोकार्डियम में सुई अग्रिम (1-3 isoflurane% 0.5-0.8 एल / मिनट 100% ऑक्सीजन के साथ मिश्रित) टाइम्स. सुई टिप लक्ष्य मायोकार्डियम (चित्रा 4C) के भीतर है जब आगे बढ़ बंद करो. पूरे beveled टिप पेरिकार्डियल अंतरिक्ष में injectate रिसाव से बचने के लिए, सुरक्षित मायोकार्डियम के भीतर होना चाहिए.
- टिप इच्छित स्थान में है, सिरिंज सवार पर धकेलने के द्वारा injectate पहुँचा. 5-30 सेकंड से अधिक है, धीरे धीरे injectate उद्धार (मात्रा के आधार पर दिया जा रहा है). Injectate के 50 μl निलय समारोह समझौता किए बिना दिया जा सकता है. इंजेक्शन दौरे क्षेत्र के लिए एक क्षणिक echobright उपस्थिति सफल इंजेक्शन के बाद स्पष्ट हो सकता है. रिश्तेदार bradycard का एक संक्षिप्त (सेकंड) अवधिआइए कभी कभी मायोकार्डियम में इंजेक्शन के साथ उल्लेख किया और जल्दी निराकरण करता है.
- Injectate प्रशासित किया गया है, तुरंत इंजेक्शन नियंत्रण घुंडी की वामावर्त रोटेशन से सुई वापस ले लें. माउस संरक्षित निलय समारोह और कोई postprocedural जटिलताओं पुष्टि करने के लिए एचोकर्दिओग्रफिक अवलोकन के कई मिनट के लिए संज्ञाहरण के तहत रखा जाना चाहिए. संकेत हैं, मायोकार्डियम के कई क्षेत्रों क्रमानुसार पशु मंच का समायोजन करके दृष्टिकोण की सुई के कोण के repositioning द्वारा इंजेक्शन जा सकता है. Intramyocardial इंजेक्शन के बाद, माउस अपने आप ही एक पिंजरे में रखा गया है और निगरानी में संज्ञाहरण से उबरने के लिए अनुमति दी है.
- यह sternal अवलंबन बनाए रखने के लिए पर्याप्त होश आ गया है जब तक पहुंच के बाहर एक जानवर मत छोड़ो. पूरी तरह से ठीक है जब तक अन्य जानवरों की कंपनी को intramyocardial इंजेक्शन आया है कि एक जानवर वापस नहीं करते. पिंजरे के साथ पुन: एक thermoregulated पैड पर रखा जाना चाहिएपानी और माउस आहार की ady प्रावधान. Postprocedural असुविधा होने की उम्मीद है और उचित रूप से शीघ्र ही हस्तक्षेप के बाद सामान्य व्यवहार को फिर से शुरू करने के लिए विफलता एक संभावित जटिलता (चर्चा देखें) से पता चलता नहीं है.
- ध्यान intramyocardial इंजेक्शन के पूरा ऑपरेटर या पास खड़े थे तेजधार चोट के जोखिम को कम करने के तुरंत बाद सुई त्यागें. एक सुई पुनर्प्रयोग यह अधिक चुनौतीपूर्ण मायोकार्डियम पियर्स बनाने टिप के blunting और जटिलता के एक उच्च जोखिम में जिसके परिणामस्वरूप में परिणाम कर सकते हैं.
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Representative Results
नीले रंग या फ्लोरोसेंट microspheres साथ murine Intramyocardial इंजेक्शन
इवान नीले डाई इंजेक्शन प्रशिक्षण प्रयोजनों के लिए उपयोगी है. इसके तुरंत इंजेक्शन के बाद, मध्य इल्लों से भरा हुआ मांसपेशियों के स्तर पर मायोकार्डियम घुसपैठ नीले रंग के साथ, माउस euthanize और इंजेक्शन नीले रंग के स्थान कल्पना करने के लिए दिल को हटा दें. 5 चित्रा एक सफल इंजेक्शन का एक उदाहरण दिखाता है (चित्रा 5 ए, क्षेत्र संलग्न ) बिंदीदार रेखा द्वारा. इवांस नीले डाई कुछ ही घंटों के भीतर ऊतक से बाहर धोना होगा. इंजेक्शन साइट का अंकन अधिक स्थायी के लिए, इंजेक्शन स्थल पर अनिश्चित काल के लिए रहना कि फ्लोरोसेंट microspheres इस्तेमाल किया जा सकता है. आंकड़े 5C-5F पूर्वकाल और कूल्हों बाएं निलय की दीवारों में कई इंजेक्शन लक्ष्यों को दिखाता है.
मायोकार्डियम में Adenovirus इंजेक्शन
अल्ट्रासाउंड गाइड द्वारा मायोकार्डियम को adenovirus का वितरण कल्पना करने के लिएडी इंजेक्शन, हम स्तनधारी की cardiomyocyte विशिष्ट चूहे ट्रोपोनिन टी प्रमोटर 10 ड्राइव अभिव्यक्ति Cre 11 कोडोन अनुकूलित जिसमें एक adenovirus इंजेक्शन. Cre की मध्यस्थता पुनर्संयोजन के डोमेन Cre पुनर्संयोजन लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) बंद हो जाती है और हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) पर बदल जाता है, जिसमें Rosa26 mTmG चूहों, का उपयोग निर्धारित किया गया था. 50 μl वायरस (2.8 x 10 9 संक्रामक इकाइयों / एमएल) की एक इंजेक्शन क्षेत्रीय इंजेक्शन के 7 दिनों (चित्रा 6) के भीतर GFP अभिव्यक्ति सक्रिय. इंजेक्शन की प्रारंभिक साइट परे ऊतक विमानों के साथ कुछ क्षेत्रीय दौरे घुसपैठ sectioned छवियों में सराहना की है.
चित्रा 1 अल्ट्रासाउंड निर्देशित इंजेक्शन सेटअप. एकीकृत रेल प्रणाली के एक) अवलोकन, परमिट जोइंजेक्शन सिरिंज और अल्ट्रासाउंड स्कैन सिर. बी) अल्ट्रासाउंड स्कैन सिर नियंत्रण के संरेखण. स्कैन सिर इंजेक्शन सिरिंज के लिए गठबंधन किया, स्थिति में बंद है. देखने के क्षेत्र जानवर मंच. सी) इंजेक्शन सिरिंज नियंत्रण को ले जाकर निकाला जाता है.
अल्ट्रासाउंड निर्देशित सुई इंजेक्शन के लिए पशु मंच पर माउस के 2 इष्टतम स्थिति चित्रा. कम अक्ष इमेजिंग विमान. बी) यह वक्ष गुहा में गुजरता के रूप में अल्ट्रासाउंड जेल के एक उदार राशि के माध्यम से देखने के ट्रांसड्यूसर के क्षेत्र के तहत सुई के पथ की. Closeup से intramyocardial इंजेक्शन के लिए पशु मंच, सुई और ट्रांसड्यूसर की ए) अभिविन्यास . सी) intramyocardial inje के लिए पशु मंच, सुई की दिशा और ट्रांसड्यूसरparasternal लंबे अक्ष इमेजिंग विमान में ction.
Parasternal कम धुरी और लंबे अक्ष विमानों में लक्षित करने के लिए मायोकार्डियम के 3 प्रतिनिधि अल्ट्रासाउंड छवियों चित्रा. एसी) इल्लों से भरा हुआ मांसपेशियों के नीचे मध्य इल्लों से भरा हुआ मांसपेशियों (ए) के स्तर पर बाएं वेंट्रिकल की लघु अक्ष छवियों, (बी) और दिल के शीर्ष पूर्वकाल बाएं निलय की दीवार में intramyocardial इंजेक्शन का प्रदर्शन (सी). डी) लंबे अक्ष छवि. तीर सुई शाफ्ट की स्थिति पर प्रकाश डाला.
4. प्रतिनिधि 2D इकोकार्डियोग्राफी छवियों चित्रा. ए) सी) इंजेक्ट मायोकार्डियम साथ गठबंधन अपने लंबे अक्ष. बी) सुई गाइड उपरिशायी समारोह की लंबाई के साथ सुई को प्रदर्शित करता है पूर्वकाल दौरे दीवार के भीतर दफन सुई का उठाव साथ.
इवान नीले डाई या फ्लोरोसेंट microspheres के साथ इंजेक्शन साइट चिह्नित चित्रा 5. पूर्वकाल दौरे दीवार में नीले रंग के Intramyocardial इंजेक्शन. ए) midpapillary मांसपेशियों के स्तर पर दिल की अनुप्रस्थ अनुभाग, डाई 30 मिनट की घुसपैठ के बाद प्रदर्शन को intramyocardial वितरणबाएं वेंट्रिकल. बी) मायोकार्डियम के बाएँ पार्श्व सतह. सी, डी) Murine मायोकार्डियम 7 दिनों पूर्वकाल और कूल्हों बाएं निलय दीवारों. ई, एफ) वाम में अलग intramyocardial इंजेक्शन के बाद लाल फ्लोरोसेंट microbeads प्रदर्शन पर सुई से दृष्टिगोचर पंचर साइट लाल फ्लोरोसेंट microbeads की दिल का प्रदर्शन बयान की अनुप्रस्थ विमान में मध्य इल्लों से भरा हुआ मांसपेशियों में sectioned निलय मायोकार्डियम. कटौती की सतह भर में फैले microbeads के दौरान और एक चाकू ब्लेड के साथ दिल को काटने के बाद बफर में फैलाव की वजह से थे.
चित्रा 6 एक टीएनटी-iCre की एकल intramyocardial इंजेक्शन के बाद एक Rosa26 mTmG दिल के पूर्वकाल दौरे दीवार की फ्लोरोसेंट लेबलिंगAdenovirus. ए) एक murine पूरे दिल के पूर्वकाल दीवार की लाइट माइक्रोस्कोपी एक adenoviral वेक्टर. सी, डी) में अनुप्रस्थ अनुभाग द्वारा सफल प्रसव और दौरे पारगमन का प्रदर्शन एक ही दिल में क्षेत्रीय adenoviral इंजेक्शन. बी) फ्लोरोसेंट छवि (EGFP) के बाद 7 दिन मध्य इल्लों से भरा हुआ मांसपेशियों स्तर, (2.8 x 10 9 संक्रामक इकाइयों / मिलीलीटर की 50 μl) adenovirus की एक एकल intramyocardial इंजेक्शन से क्षेत्रीय अभिकर्मक की हद तक का प्रदर्शन है.
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Discussion
बायोलॉजिक्स खून के माध्यम से प्रत्यक्ष intramyocardial इंजेक्शन, intrapericardial इंजेक्शन, या अप्रत्यक्ष प्रशासन द्वारा मायोकार्डियम के लिए दिया जा सकता है. रोधगलन मॉडल में हाल ही में सेल आधारित चिकित्सा परीक्षणों injectate 12-14 के वितरण के लिए एक खुला thoracotomy दृष्टिकोण का वर्णन किया है. एक दौरे चिकित्सकीय हस्तक्षेप की सफलता में एक महत्वपूर्ण कारक वितरण मार्ग के चुनाव पर टिका है. जीवविज्ञान के उच्चतम स्थानीय खुराक intramyocardial वितरण 15,16 द्वारा हासिल की है. प्रत्यक्ष दृश्य के तहत Intramyocardial इंजेक्शन सबसे सरल विधि है और मायोकार्डियम 17 के भीतर लक्षित प्रशासन के लिए अनुमति देता है. यह लक्ष्य मायोकार्डियम 18 बेनकाब करने के लिए छाती गुहा और पेरीकार्डियम के उद्घाटन की आवश्यकता के रूप में हालांकि, इस विधि भी सबसे आक्रामक है. इस तरह अपने पृष्ठीय सतह के रूप में दिल का अंश, आसानी से कल्पना और इस पद्धति का उपयोग इंजेक्शन नहीं कर रहे हैं. proced के invasivenessure भी संभावित चिकित्सीय खुराक कार्यक्रम constrains. यहाँ, हम रुग्णता और शल्य thoracotomy जोखिम की बाधाओं के बिना, percutaneous intramyocardial इंजेक्शन द्वारा सुरक्षित रूप से अल्ट्रासाउंड मार्गदर्शन में बायोलॉजिक्स या दवाएं वितरित करने के लिए एक तकनीकी तौर पर, सीधा विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक का वर्णन. प्रारंभिक तकनीकी योग्यता प्राप्त किया गया था के बाद कम से कम चार दौरे साइटों किसी एक समय में निशाना बनाया गया जब तिथि को इंजेक्शन 150 से अधिक चूहों में, हमारे periprocedural मृत्यु दर 5% नीचे था. 200 μl की कुल injectate मात्रा में आश्चर्यजनक रूप से अच्छी तरह से murine दिल से बर्दाश्त कर रहे थे. पूर्वकाल मायोकार्डियम सुई अधिक सुरक्षित रूप से हृदय की मांसपेशी में रहने की इजाजत दी, सुई की लंबी अक्ष के मायोकार्डियम के इस क्षेत्र के समानांतर अभिविन्यास दिया, इंजेक्शन के लिए एक लक्ष्य के रूप में अच्छी तरह से उधार देता है. यह इस inje का पूरा वितरण सुनिश्चित रूप में ऑपरेटर, इंजेक्शन के लिए पहले मायोकार्डियम में पूरे beveled टिप कल्पना महत्वपूर्ण है किआसपास के ऊतकों में रिसाव के बिना ctate. मायोकार्डियम भी सफल दौरे इंजेक्शन के लिए महत्वपूर्ण है के भीतर सुई टिप हमेशा दिखाई रहता है यह सुनिश्चित करने के लिए परवाह है. इवान नीले रंग के साथ अभ्यास करते हैं, निलय चेंबर में अनजाने इंजेक्शन माउस तेजी depilated त्वचा में दिखाई सबसे स्पष्ट रूप से एक नीले रंग के विकास में परिणाम होगा. यह भी छाती दीवार के माध्यम से कि सुई प्रविष्टि ध्यान देने योग्य इच्छित लक्ष्य मायोकार्डियम की और न माउस की किसी भी सतह संरचनात्मक स्थलों द्वारा प्रदर्शित अल्ट्रासाउंड छवि से पूरी तरह से निर्धारित किया जाता है. एक अनुभवी echocardiographer के लिए, intramyocardial इंजेक्शन में योग्यता यथोचित 4-5 प्रयासों पर अभ्यास के बाद प्राप्त किया जा सकता है.
सुई छाती दीवार के माध्यम से गुजरता है, यह पसलियों के बीच अंतरिक्ष के माध्यम से गुजरना होगा. यह देखने के भीतर स्पष्ट रूप से beveled टिप रखने के लिए एक बार पसलियों के बीच अंतरिक्ष के माध्यम से इमेजिंग विमान को मामूली समायोजन करना है के लिए असामान्य नहीं है. गुआमतौर पर पशु मंच या इंजेक्शन सिरिंज नियंत्रण की मामूली समायोजन के माध्यम से पूरा किया जाता है. मामूली संशोधनों सुई रिब पिंजरे के माध्यम से एक बार किया जाना चाहिए लेकिन यह मायोकार्डियम में पारित कर दिया गया है इससे पहले दोहराया सुई टिप हेरफेर से दौरे पंगु बनाना और आघात को रोकने के लिए. Hemopericardium के जोखिम को कम करने के लिए, उद्देश्य injectate का वितरण पूरा करने के लिए आवश्यक हैं के रूप में कई बार के रूप में दिल में प्रवेश करने के लिए होना चाहिए. वर्णित तकनीक दिल से कम अक्ष विमान में intramyocardial इंजेक्शन के लिए है, यह इस विमान (चित्रा -2) और पुनः निर्देशित साथ संरेखित करने के लिए पशु मंच के सरल समायोजन के माध्यम से दिल की parasternal लंबे अक्ष विमान में डालने के लिए समान रूप से संभव है सुई मायोकार्डियम का इरादा लक्ष्य (चित्रा 3 डी) में प्रवेश के लिए.
एक संकेतक का उपयोग कर पुष्टि की जा सकती सफल intramyocardial इंजेक्शन तत्काल रोग परीक्षाओं द्वारा पीछा डाईइंजेक्शन माउस दिल के आयन. फ्लोरोसेंट microspheres की एक निलंबन इंजेक्शन इंजेक्शन स्थल पर अनिश्चित काल रहेगा और लक्षित क्षेत्र चिह्नित करने के लिए एक और एजेंट के साथ समन्वित रूप से प्रशासित किया जा सकता है. माउस संस्थागत पशु निपटने प्रोटोकॉल के अनुसार प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा साँस कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग euthanized है. दिल की सतह की परीक्षा इंजेक्शन क्षेत्र खोलेगा, और एक दिल मैट्रिक्स के साथ दिल टुकड़ा करने की क्रिया इंजेक्शन क्षेत्र का प्रदर्शन होगा कि पार वर्गों निकलेगा. उसी दौरे क्षेत्र के दोहराया इंजेक्शन और / या इमेजिंग समय के साथ वांछित है, यह मानक इमेजिंग विमानों का उपयोग करने के लिए और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संरचनात्मक स्थलों को लक्ष्य के लिए फायदेमंद है. उदाहरण के लिए, यह midpapillary पेशी स्तर (चित्रा 3A) पर बाएं वेंट्रिकल लक्षित करने के लिए कम अक्ष इमेजिंग विमान का उपयोग करने के लिए सुविधाजनक है. सबसे गंभीर संभावित जटिलता दौरे पंगु बनाना / टूटना और फलस्वरूप नकसीर और / या hemopericardium है. वें का खतराचूहों (15 ग्राम से कम) दोहराया मायोकार्डियम के माध्यम से सुई (चार या अधिक) का गुजरता, द्रव सांस का तेजी से इंजेक्शन, एक पा सुई टिप पुन: उपयोग, और छोटे चूहों के उपयोग के साथ जटिलता बढ़ जाती है. मायोकार्डियम के भीतर कई लक्ष्यों को क्रमानुसार (पूर्वकाल दीवार, पार्श्व दीवार या अवर दीवार) इंजेक्ट कर रहे हैं, तो यह प्रक्रियागत जटिलताओं के जोखिम को कम करने के लिए मायोकार्डियम के माध्यम से तीन गुजरता है या सुई का भी कम समय में इस लक्ष्य को हासिल करने के इष्टतम है. बाएं निलय मायोकार्डियम के पार्श्व दीवारों छाती दीवार के माध्यम से सुई का एक पास (आंकड़े 5E और 5F) के साथ समवर्ती इंजेक्शन जा सकता है कि वे एक दूसरे लेकिन करने के लिए समानांतर संरेखित के रूप में के माध्यम से सुई की फिर से प्रविष्टि की आवश्यकता होगी किसी अन्य दौरे दीवार लक्ष्य सुई कोण समायोजन निम्नलिखित छाती दीवार. (प्रति मिनट 400 धड़कता के तहत) अंत डायस्टोलिक मात्रा बढ़ाने के लिए और काफी दौरे दीवार मोटाई कम कर सकते हैं माउस मंदनाड़ी रूप oversedated नहीं किया जाना चाहिए. हमारीचूहों तेजी से प्रक्रिया से उबरने के लिए और संज्ञाहरण से वसूली के मिनट के भीतर अपने पिंजरों में ambulate करने के लिए अनुभव है. वे पैदा करते हैं जब जटिलताओं,, आकस्मिक हैं और हस्तक्षेप के समय पर होते हैं.
इस प्रोटोकॉल intramyocardial इंजेक्शन के लिए लिखा जाता है, अंतिम सुई टिप स्थिति का एक मामूली संशोधन ऑपरेटर एक एजेंट के प्रणालीगत धमनी वितरण के लिए बाएं निलय गुहा के खून में इंजेक्शन को लक्षित करने की अनुमति देता है. बेवल टिप बाएं निलय कक्ष में है (ऑक्सीजन युक्त रक्त aspirated) या दौरे मांसपेशियों में चाहे पुष्टि कर सकते हैं वापस सिरिंज सवार पर खींच रहा है. आज अत्यधिक कुशल और अंग विशेष वायरल वैक्टर, एक हृदय विशिष्ट प्रमोटर के साथ विशेष रूप से एक एडिनो से जुड़े वायरस सीरोटाइप 9 वेक्टर के साथ, एक अन्वेषक रेट्रो कक्षीय करने या पूंछ नस इंजेक्शन एक उच्च का सुरक्षित प्रसव को प्राप्त करने के लिए एक विकल्प के रूप में इस तकनीक का अनुकूलन कर सकते हैं कोरोनरी में वायरल लोडजिगर द्वारा कम पहले पास अवशोषण के साथ परिसंचरण,. पुरानी postinfarct murine मॉडल में, जख्म और fibrotic मायोकार्डियम ऑपरेटर में सुई टिप को दफनाने के लिए किया है उसके एवज में पतली दीवारों लक्ष्य दिया intramyocardial इंजेक्शन के लिए अच्छी तरह से खुद को उधार नहीं हो सकता है. हालांकि, मायोकार्डियम के सीमावर्ती क्षेत्र क्षेत्रों intramyocardial इंजेक्शन और करने के लिए उत्तरदायी होना चाहिए thoracotomy के बाद ध्वनिक Windows सफल अल्ट्रासाउंड मार्गदर्शन के लिए पर्याप्त से अधिक कर रहे हैं.
पशु मॉडल में intramyocardial इंजेक्शन मायोकार्डियम को प्रसव जैविक एजेंटों के लिए एक अच्छी तरह सहन, कुशल, कम आक्रामक, और तकनीकी रूप से सरल विधि का प्रतिनिधित्व करता है, अल्ट्रासाउंड निर्देशित. इस तकनीक को आसानी से पहले खुला thoracotomy प्रक्रियाओं के बाद सहित, एक murine मॉडल में किसी भी प्रयोगात्मक समय बिंदु पर जीन वैक्टर या सेल आधारित चिकित्सा के सफल प्रसव के लिए नियोजित किया जा सकता. उपकरण और इंजेक्शन की प्रक्रिया के साथ परिचित और क्षमता होगी हासिल करनाप्रयोगात्मक मॉडल में बाद सफलता सुनिश्चित करते हैं.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo 2100 ultrasound imaging system | Visualsonics | ||
| Vevo Integrated Rail System III | Visualsonics | ||
| Microscan MS400 transducer | Visualsonics | ||
| Microscan MS550D transducer | Visualsonics | ||
| PrecisionGlide needles | BD | 305128 | 30 G x 1 in/2.5 cm |
| 1 cc slip tip syringe | Exel International | 26048 | or equivalent |
| Gastight 50 μl glass syringes | Hamilton | 1705 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250 | or equivalent |
| Isoflurane | Baxter | AHN3640 | or equivalent |
| Aquasonic 100 | Parker Laboratories | (01-08) | or equivalent |
| Polystyrene microspheres (red fluorescent) | Life Technologies | F-8842 | or equivalent |
References
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