Summary
Ekokardiyografi perkü- intramiyokardiyal enjeksiyon sıçangil kalp gen transfer ajanları veya hücre verilmesi için etkili, güvenilir ve hedeflenebilir yaklaşımı olmaktadır. Bu protokolde belirtilen adımları izleyerek, operatör hızla bu çok yönlü, minimal invaziv teknikle yetkin olabilir.
Abstract
Kardiyovasküler hastalığı olan kemirgen modelleri patofizyolojik mekanizmaları araştıran ve olası rejeneratif tedaviler keşfetmek için önemlidir. Miyokard enjeksiyonunu içeren deneyler henüz torakotomi ile doğrudan cerrahi erişim tarafından yapılmaktadır. Koroner arter ligasyonu gibi başka bir deneysel manipülasyon sırasında yapıldığında uygun iken, intramiyokardiyal teslimat için invaziv bir işlem için ihtiyaç potansiyel deneysel tasarımlar sınırlar. Hiç ultrason çözünürlük ve gelişmiş girişimsel olmayan görüntüleme yöntemleri geliştirerek, rutin ultrason kılavuzluğunda perkütan intramiyokardiyal enjeksiyon yapmak artık mümkündür. Bu yöntem verimli ve güvenilir bir miyokard hedeflenen bölgeye ajanlar sunar. Bu tekniğin avantajları cerrahi morbidite kaçınma, seçici ultrason rehberliğinde miyokardiyumun bölgeleri hedef odası ve myocardiu için Enjektat teslim fırsatı bulunmaktadırBirden fazla, önceden belirlenmiş zaman aralıklarında m. Uygulanan teknikle, intramiyokardiyal enjeksiyon komplikasyonlar nadirdir ve farenin çabuk anestezik kurtarma normal aktiviteye dönüş. Bu protokolde belirtilen adımları izleyerek, temel ekokardiyografi deneyimi ile operatöre hızlı bu çok yönlü, minimal invaziv teknikle yetkin olabilir.
Introduction
Kalp hastalığı yılda 600.000 ölüm 1 için muhasebe, Amerika Birleşik Devletleri'nde hem de erkek ve kadınlar için önde gelen ölüm nedenidir. Kardiyovasküler hastalığı olan kemirgen modelleri patofizyolojik mekanizmaları araştırmak için ve potansiyel tedavileri keşfetmek için kritik önem taşımaktadır. Gen tedavisi vektörleri miyokardial teslim hücreler, modifiye edilmiş RNA ve kalp hastalığı 2-7 onların tedavi edici potansiyelinin bir diğer terapötik maddeler izin soruşturma kaynaklanıyor. Şu anda, fare modellerinde 6 terapötik ajanların miyokard teslimat için sınırlı seçenekler vardır. Direkt görüş altında intramiyokardiyal enjeksiyon yaygın olarak kullanılır, ama bir ya da sternotomi torakotomi gerektirir ve kalp, açıkta kalan bölümün sınırlıdır edilir. Böyle LAD ligasyonu gibi başka bir deneysel manipülasyon sırasında yapıldığında uygun iken, intramiyokardiyal teslimat için invaziv bir işlem için ihtiyaç potansiyel deneysel tasarımlar sınırlar ve bir tanıttıprosedüründen dditional etkileri (örneğin, torakotomi nedeniyle fibrozis). Viral vektörlerin perkütan perikardiyal dağıtım bildirilmiştir, ancak site ve terapötik maddenin dağılımı homojen değildir ve kontrol 8 zordur. Enjekte edilen malzemenin, ama verimli ve tekrarlanabilir koroner teslimat daha homojen dağılımı perkütan koroner enjeksiyon sonuçları sıçan modellerinde meydan okuyor.
Burada, biz ultrason rehberliğinde terapötik ajanların minimal invaziv, operatör kontrollü hedefleme sağlayan bir kapalı göğüs intramiyokardiyal enjeksiyon tekniği açıklar. Tekniği, öğrenmesi kolay, torakotomi ya da sternotomi ve bunların görevlisi deneysel komplikasyon ihtiyacını ortadan kaldırır ve zamanlama ve intramiyokardiyal enjeksiyon sitelerinde daha fazla esneklik sağlar. Bu nedenle, ekokardiyografi destekli enjeksiyon intramiyokardiyal manipüle bir teknik olarak basit ve son derece etkili bir metodu temsil ederfare deneysel modellerde myokarddaki.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm açıklanan adımlar Boston Çocuk Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokoller altında gerçekleştirildi.
1. Hazırlık
- Intramiyokardiyal enjeksiyon için optimal sabit dönüştürücü pozisyon anatomi ve fonksiyonunun değerlendirilmesi tanımlanmasına yönelik en uygun standart görüşlerini vermeyebilece¤ini gibi, önce enjeksiyon protokolü başlamadan ekokardiyografi ile temel kardiyak anatomik ve fonksiyonel değerlendirme yapın.
- Enjeksiyon kurulum Şekil 1A-1C gösterilmiştir. Kılıflı bir iğne ile boş bir şırınga, konik yukarı dönük, şırınga kelepçede (Şekil 1C) ve tarama kafası kıskacına ultrason transdüktörünün probu olarak güvenceye (Şekil 1B'ye bakınız). Tarama kafası kelepçe kilidi bilyalı mafsalı (Şekil 1B) gevşetin ve iğnenin eksenine paralel olacak şekilde bir dönüştürücü yönelimi işlemek. Taramaya Fixtarama kafası kelepçe top kilit eklemini sıkarak baş pozisyonu.
Not: Yetişkin farelerde, enjeksiyon için bir 1 / 2,5 cm uzunluğa sahip olan bir 30 G iğne en uygunudur. Bir gaz geçirmez şırınga küçük hacimlerde daha hassas bir şekilde kontrol (5-10 ul) için kullanılabilir ise 1 ml şırınga içinde, daha büyük miktarlar için kullanılabilir. - Bütünüyle boyunca başını örtmek için bir spatula ile dönüştürücü ucu bolca ultrason jeli uygulayın. Dikkatlice iğne kınından ve iğne direk transdüser altında ve görselleştirme için ultrason jel içinde iğneyi ilerletmek için denetimlerini montaj kullanın. İğne ultrason görüntüsünün üzerinde uzunluğu boyunca açık bir şekilde görünür hale getirilir, böylece iğne kontrol parçasını kullanarak küçük ayarlamalar yapın. Dönüştürücü uygun Adım 1.4 iğne paralel doğrultuda ise, gelişmiş ve enjeksiyon kontrol düğmesi (Şekil 1C) ile çekilir, sonra iğne görüntü düzlemi içinde kalmalıdır.
- Daha sonraki adımlarda, ihtiyacı rahatsız etmeyecekyatay eksende ya hareket ederek le / dönüştürücü yatay hizalama. Bunun yerine, iğnenin düşey eksende (y-ekseni) monte pozisyonu değiştirerek ve hayvan hareketli platformu enjeksiyon için kalbin alan hedeflenecek.
- Hayvan platforma anestezi fare sonraki yerleştirilmesine olanak sağlamak üzere tarama yükseklik kontrolü (Şekil 1B) kullanılarak hayvan platformdan süperiorda dönüştürücüyü hareket ettirin. Bu iğnenin uzun eksenine transdüktörün x ekseni hizalama bozmayacak.
- Şırınga kelepçe gelen hizalama için kullanılan ve dikkatle atın edildi şırınga çıkarın. Yeni bir iğne takın ve şırınga ucu ölü alan için izin, nihai hedef hacme enjekte edilecek ile şırınga. Hava kabarcıklarını çıkarmak için dikkatli olun. X ekseni hizalamasını ayarlayarak olmadan şırınga kelepçe içine şırınga yerleştirin. Tamamen enjeksiyon kontrolü kullanarak şırınga geri çekin.
NOT: İlk eğitim amaçları için, Evan mavisi kullanımıboyası (% 1), Tripan mavi boya (% 0.4) ya da mikro-enjekte edilecek malzeme gibi floresan bir süspansiyonu yetkinliği ve hedeflenen enjeksiyon başarısını teyit operatöre yardımcı olabilir.
2. Enjeksiyon
- Isıtma platformunun entegre sıcak açın ve 37 ° C için ayarlayın. Operatöre en yakın hayvanın anestezi hortum kelepçesi ve kafa ile, normal görüntüleme doğrultusundan hayvan platformunu 180 ° yerleştirin. Bu (göğsün sol tarafında) kalp şırınga kelepçe ve iğne ipsilateral olmasını sağlar. Not: Hayvan platforma ek küçük ayarlamalar dönme yönünde enjeksiyonu (Şekil 2A) için kullanılacak Parasternal kısa eksen görüntü düzlemi için doğru şekilde yönlendirmek için kalp gerekli olabilir.
- Daha önce 9 bildirildiği gibi ekokardiyografi için fareler hazırlamak. % 2 izofluran ile indüksiyon odasında fare anestezisi. Epilasyon kremi An ile göğüs tüylerdensklera kurumasını önlemek için her iki göze jel yağlama uygulanır d.
- Tarama kafası yükseklik kontrolü (Şekil 1B) ile dönüştürücüye kaldırın. % 1-3 izofluran (Şekil 2A-2B) teslim bir burun konisi içinde burnu ile ısıtılan hayvan platformun üstünde anestezi fare sırtüstü yerleştirin. Yavaşça bir rektal prob takın ve elektrik kontağı için elektrot jeli uygulayarak, EKG elektrotları için dört pençeleri bantlayın.
NOT: anestezi uygun seviyede bir hayvanın insani tedavisi için sağlanmalıdır. Kalp hızında herhangi bir değişiklik ve göğüs duvarından iğnenin yerleştirilmesi için hiçbir yanıt olmalıdır. Hipotermi göreceli bradikardi, ventriküler dilatasyon ve olası rahatsızlıklara neden olacak gibi hayvan platformunun entegre homeostatik sıcaklık kontrolleri, normotermi (37 ± 0.5 ° C) muhafaza için kullanılmalıdır. - Fare hayvan platformu üzerinde sabitlendikten sonra, depila üzerine dönüştürücüyü düşürmektarama kafası yükseklik kontrolü (Şekil 1B) kullanarak ted göğüs. Kalp standart ekokardiyografik tekniği gereği, parasternal kısa eksen yönelim görselleştirilebileceğini için enjeksiyon için en uygun ultrason kurulum. Kısa eksen görüntü düzlemi (Şekil 2A-2B) enjeksiyon için uygun bir akustik pencere elde etmek için hayvan platformunu 20-30 ° saat yönünde döndürür. Not: Alternatif olarak, enjeksiyon, hayvan platformun (Şekil 2C) içinde saat yönünün tersine döner bir Parasternal uzun eksen yönünde de yapılabilir.
- Görüş alanını ayarlamak ve sol ventrikül miyokard içinde istenilen enjeksiyon siteyi hedef hayvan platformu ayar denetimlerini kullanın. Sol ventrikül myokard (Şekil 3A-3C) istenen enjeksiyon yerini hedef kalp tabanına apeks geri ve ileri-Pan. Not: midpapillary parasternal kısa eksen görüntüde (Şekil 3A) reproducibl sunuyorenjeksiyon yerinde takip görüntüleme izin e görülecek. Not: Alternatif olarak, Parasternal uzun eksen, önceden tanımlanmış bir enjeksiyon bölgesine (Şekil 3D) hedeflemek için kullanılabilir.
- Tamamen geri çekilmiş şırınga kıskacına şırınga ile başlayarak, yavaş yavaş enjeksiyon kontrol saat yönünde (Şekil 4A) döndürülmesi ile hayvanın göğsüne doğru şırınga ilerletin. O göğüs yaklaştıkça kalp ve iğne ucu hem açık ultrason görüntülenmesine izin verecek, göğsün sol tarafında üzerinde ultrason jeli bol kullanın ve ekokardiyografi kontrolleri bakış geniş bir alanı ayarlayarak akustik pencere optimize. Enjeksiyon için hedef bölgede odak noktası / dilimini ayarlayın. Iğne küçük ayarlamalar kontrolleri kendi uzunluğu boyunca iğne görüntüsünü optimize edebilirsiniz montaj.
Not: bazı ultrason makinesi dijital hedef miyokarda aracılığıyla iğnenin uzun ekseni boyunca uzanan bir çizgi için bir iğne kılavuz işlevi vardır yazılım(Şekil 4B). Böyle bir yazılım aracı yararlı olabilir, ancak gerekli değildir yapabilirsiniz. - Hayvan uygun sedasyon ile dikkatlice tüm eğimli iğne ucu konumunu gözlemleyerek, fare göğüs duvarından ve miyokard içine iğne ilerlemek (% 1-3 izofluran 0.5-0.8 L / dk% 100 oksijen ile karıştırılır) kez. Iğne ucu hedef kadardır (Şekil 4C) içinde olduğunda ilerleyen durdurun. Bütün Eğimli ucu perikard boşluğuna Enjektat sızıntısı önlemek için, güvenli miyokard içinde olmalıdır.
- Uç istenen konumda olduğunda, şırınga pistonu iterek nolu enjekte edilecek malzeme sağlar. 5-30 sn içinde yavaş yavaş Enjektat sunun (hacmine bağlı olarak teslim ediliyor). Enjekte edilecek 50 kadar ul ventrikül fonksiyonunu bozmadan teslim edilebilir. Enjekte miyokard bölgeye geçici bir echobright görünüm başarılı bir enjeksiyon sonrasında belirgin olabilir. Göreceli bradycard kısa (saniye) dönemiia bazen miyokard içine enjeksiyonu ile kaydetti ve hızlı bir şekilde giderir edilir.
- Enjektat uygulanan edildikten sonra, derhal enjeksiyon kontrol düğmesinin saat yönünün tersine dönme tarafından iğneyi çıkartın. Fare korunmuş ventrikül fonksiyonu ve hiçbir girişim sonrası komplikasyonlar onaylamak için ekokardiyografik gözlem birkaç dakika boyunca anestezi altında tutulmalıdır. Gerektiğinde, miyokardın daha çok sayıda bölgeleri seri hayvan platformun ayarlanması ile yaklaşımı iğne açısının konumunu yeniden enjekte edilebilir. Intramiyokardiyal enjeksiyonundan sonra, fare kendi başına bir kafes içine yerleştirildi ve gözlem altında anesteziden bırakılır.
- O sternum yatma korumak için yeterli bilince kavuşana kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayın. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete intramiyokardiyal enjeksiyon geçirmiş bir hayvanı iade etmeyin. Kafes re ile bir termoregülasyonlu pad üzerinde konulmalıdırsu ve fare diyet ADY sağlanması. İşlem sonrası rahatsızlık beklenen ve uygun kısa bir süre müdahale sonrası normal davranışını devam etmek için başarısızlık potansiyel bir komplikasyon (Tartışma) göstermektedir değildir.
- Dikkatle intramiyokardiyal enjeksiyon tamamlanması operatörü ya da çevredekilere diyez yaralanma riskini en aza indirmek için hemen sonra iğne atın. Bir iğne tekrar kullanımı daha zorlu miyokardiyumu delmek için yapım ucu köreltme ve komplikasyon riski daha yüksektir sonuçlanan neden olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mavi Dye veya Floresan Mikrokürelerin sahip fare intramiyokardiyal Enjeksiyon
Evan mavisi Enjeksiyon eğitim amaçlı yararlıdır. Kısa bir süre enjeksiyonundan sonra, orta papiller kas seviyesinde miyokardı infiltre mavi boya ile, fare euthanize ve enjekte edilen mavi boya konumunu görselleştirmek için kalp çıkarın. Şekil 5 başarılı bir enjeksiyon bir örneğini göstermektedir (Şekil 5A, kapalı bölge ) noktalı çizgi ile. Evans mavisi birkaç saat içinde doku yıkayın olacaktır. Enjeksiyon yerinde işaretleme daha kalıcı olması için, enjeksiyon yerinde süresiz kalması floresan mikroküreler kullanılabilir. Şekil 5C-5F anterior ve posterior sol ventrikül duvarlarında çoklu enjeksiyon hedefleri göstermektedir.
Miyokard içine Adenovirüs Enjeksiyon
Ultrason eşliğinde miyokardiyuma adenovirüs teslim görselleştirmek içind enjeksiyon, biz memeli bir kardiyomyosit spesifik sıçan troponin T promotör 10 sürücüler ifade Cre 11 kodon-optimize edilmiş olan bir adenovirüs enjekte. Kre-aracılı rekombinasyon Cre yeniden birleştirme alanı kırmızı flöresanlı proteinin (RFP) kapatır ve yeşil flüoresan proteini (GFP) üzerine kapandığı Rosa26 mTmG fareler kullanılarak belirlenmiştir. 50 ul virüs (2.8 x 10 9 enfeksiyöz birim / ml), tek bir enjeksiyonu bölgesel enjeksiyon 7 gün (Şekil 6) içinde, GFP ifade aktif. Enjeksiyon ilk site dışına doku düzlemlerinde bazı bölgesel miyokard infiltrasyonu kesitlendirihniş görüntüleri takdir edilmektedir.
Şekil 1. Ultrason eşliğinde enjeksiyon kurulum. Entegre raylı sistemin A) Bakış, izinEnjeksiyon şırınga ve ultrason tarama kafası. B) Ultrason tarama kafası kontrollerin uyumu. Tarama kafası enjeksiyon şırıngaya hizalanmış konumda kilitlenir. Görüş alanı hayvan platformu. ° C) Enjeksiyon şırınga hareket kontrol ayarlanır.
Ultrason rehberliğinde iğne enjeksiyonu için hayvan platformda fare 2. Optimal konumlandırma Şekil. Kısa eksen görüntüleme düzlemi. B) göğüs boşluğuna geçerken ultrason jeli bol miktarda yoluyla bakış transdüserin alanının altındaki iğne yolu. Closeup gelen intramiyokardiyal enjeksiyon için hayvan platformu, iğne ve transdüser A) Oryantasyon C). intramiyokardiyal enjeksiyonundan için hayvan platformu, iğne Oryantasyon ve dönüştürücüparasternal uzun eksen görüntüleme düzleminde avranış.
Parasternal kısa eksen ve uzun eksen düzlemlerde hedefleme için miyokardın 3. Temsilcisi ultrason görüntüleri Şekil. Ac) papiller kas altına orta papiller kas (A) seviyesinde sol ventrikül Kısa eksen görsel (B) ve kalbin apeksi Ön sol ventrikül duvarında intramiyokardiyal enjeksiyon gösteren (° C). D) Uzun eksen görüntüsü. Oklar iğne milinin konumunu vurgulamak.
4. Temsilcisi 2D ekokardiyografi görüntüleri Şekil. A), C) Döküm myokard boyunca hizalanmış uzun ekseni. B) İğne kılavuzu bindirme fonksiyonu uzunluğu boyunca iğne görüntüler anterior miyokard duvar içinde gömülü iğne konik.
Evan mavisi veya floresan mikrosferler ile enjeksiyon yerinde işaretleme Şekil 5.. Ön duvar duvar mavisi intramiyokardiyal enjeksiyonu. A) midpapillary kasların seviyesinde kalp enine kesit, boya, 30 dakika sonra gösteren infiltrasyonunu için intramiyokardiyal teslimsol ventrikül. B) miyokardın sol yanal yüzeyi. C, D) Kemirgen myokarddaki 7 gün anterior ve posterior sol ventrikül duvarları. E, F) Sol ayrı intramiyokardiyal enjeksiyondan sonra kırmızı floresan mikrobilyeleri gösterişlere iğneden Görünür delinme sitesi kırmızı flöresanlı mikroboncuk kalp gösteren depolanma enine düzlemde orta papiller kas kesitler ventriküler miyokardın. Kesim yüzeyinin dağılmış mikroboncukları sırasında ve bir bıçakla kestikten sonra kalp tampon içine, dağılım nedeniyle.
Şekil 6. TNT-icre tek intramiyokardiyal enjeksiyonundan sonra bir Rosa26 mTmG kalbin anterior miyokard duvar Floresan etiketlemeAdenovirüs. A) bir fare bütün kalbin ön duvarının Işık mikroskobu bir adenoviral vektör. C, D) en Enine kesit başarılı teslimat ve miyokard iletimini gösteren aynı kalbinde bölgesel adenovıral enjeksiyon. B) Floresan görüntü (EGFP) 7 gün sonra orta papiller kas seviyesi (2.8 cm x 10 9 enfeksiyöz birim / ml, 50 ul) adenovirüsün tek bir enjeksiyon intramiyokardiyal bölgesel transfeksiyon ölçüde ortaya çıkarmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biyolojik, kan akışı yoluyla doğrudan enjeksiyon intramiyokardiyal, intraperikardiyal enjeksiyon veya dolaylı olarak uygulanması ile miyokard teslim edilebilir. Miyokard infarktüsü modellerde Yeni hücre tabanlı tedavi denemeleri enjekte edilecek 12-14 teslim açık bir torakotomi yaklaşımı tarif var. Miyokard terapötik müdahalenin başarısında önemli bir faktör teslim rota seçimine bağlı. Biyolojik en yüksek lokal doz intramiyokardiyal dağıtım 15,16 ile elde edilir. Direkt görüş altında intramiyokardiyal enjeksiyon en basit yöntemdir ve miyokardın 17 içinde hedeflenen yönetim sağlar. Bu hedef miyokard 18 açığa çıkarmak için göğüs boşluğu ve perikard açılmasını gerektirir Bununla birlikte, bu yöntem, aynı zamanda en saldırgan. Böyle dorsal yüzeyi gibi kalbin bölümleri, kolayca görülebilir ve bu yöntemi kullanarak enjekte edilmez. Proced bir invazivliğiure da potansiyel tedavi programları dozaj kısıtlar. Burada, biz morbidite ve cerrahi torakotomi maruz kısıtlamalar olmaksızın, perkütan intramiyokardiyal enjeksiyon yoluyla güvenli bir şekilde ultrason-eşliğinde biyolojikler veya ilaçları teslim etmek, teknik, basit, güvenilir ve tekrarlanabilir tekniği açıklar. Ilk teknik yetkinlik elde edildikten sonra en az dört miyokard sitelerine herhangi bir zamanda hedeflenen zaman bugüne kadar enjekte 150'den fazla farelerde, bizim Periprosedürel ölüm oranı% 5'in altında oldu. 200 ul Toplam Enjektat hacimleri şaşırtıcı derecede iyi kemirgen kalp tarafından tolere edildi. Anterior miyokard iğne daha güvenli bir şekilde kalp kasında kalmasını sağlayan, iğnenin uzun eksenine miyokardın bu bölgenin paralel bir yönü göz önüne alındığında, enjeksiyon için bir hedef olarak kendini iyi verir. Bu enjeksiyonundan tam bir şekilde temin edilebilir olarak operatör, enjeksiyondan önce miyokard içinde bütün kesik ucu görselleştirmek önemlidirçevredeki dokuya sızıntı olmadan ctate. Miyokardiyumun de başarılı miyokard enjeksiyon için kritik olan iğne ucu her zaman görünür kalmasını sağlamak için bakım. Evan mavisi ile uygulanırken, ventriküler odasına yersiz enjeksiyon fare hızlı bir tüy dökücü krem uygulanmış deride görünen en açık mavi bir tona dönüşme ile sonuçlanacaktır. Ayrıca göğüs duvarından o iğnenin girişini fazlalaştı amaçlanan hedef miyokardın değil fare herhangi bir yüzey anatomik noktalara tarafından görüntülenen ultrason görüntüsünde yalnızca tarafından tayin edilir. Deneyimli bir echocardiographer için intramiyokardiyal enjeksiyon yeterlik makul 4-5 girişimleri pratikte sonra elde edilebilir.
İğne göğüs duvarı boyunca geçerken, kaburgalar arası alandan geçmesi gerekir. Bu görünümü içinde açıkça kesik ucunu tutmak için bir kez interkostal uzayda görüntüleme düzlemine küçük ayarlamalar yapmak zorunda nadir değildir. Thgenellikle hayvan platform ya şırınga kontrollerin küçük ayarlamalar ile gerçekleştirilir edilir. Küçük değişiklikler iğne göğüs kafesine aracılığıyla bir kez yapılmalıdır ancak miyokard içine geçmeden önce tekrarlanan iğne ucu manipülasyon miyokard yırtılma ve travma önlemek için. Hemoperikardiyum riskini en aza indirmek için, amaç, enjekte edilecek bir teslimi tamamlamak için gerekli olan birkaç kez olarak kalp girmek olmalıdır. Tarif edilen teknik kalbin kısa eksen düzleminde intramiyokardiyal enjeksiyon için olmasına rağmen, bu düzlem (Şekil 2C) ve yeniden yönlendirme ile hizalamak için hayvan platformun basit bir ayarlama yoluyla kalbin Parasternal uzun eksen düzleminde enjekte eşit bir şekilde mümkündür İğne miyokardın amaçlanan hedef (Şekil 3D) geçilir.
Bir göstergesi kullanılarak başarılı bir şekilde kontrol edilebilir intramiyokardiyal enjeksiyon anında patolojik examinat ardından dyeenjekte edilen fare kalp iyonu temsil etmektedir. Floresan mikrosferlerin bir süspansiyon enjeksiyon enjeksiyon yerinde kalacak ve süresiz hedeflenen alanı işaretlemek için başka bir ajan ile eş zamanlı olarak uygulanabilir. Fare kurumsal hayvan taşıma protokolleri başına eğitimli personel tarafından solunan karbondioksit kullanarak ötenazi. Kalp yüzeyin incelenmesi enjekte bölgeyi gösterecek ve kalp matrisi ile kalp dilimleme enjekte bölgeyi gösterecektir kesitleri verecektir. Aynı miyokardiyal bölge tekrarlanan enjeksiyonu ve / veya görüntüleme zaman içinde arzu edildiği zaman, standart uçak görüntüleme kullanımı ve yeniden üretilebilir bir anatomik noktaları hedef avantajlıdır. Örneğin, kas midpapillary seviyesinde (Şekil 3A), sol ventrikül hedef kısa eksen görüntüleme uçak kullanmak için uygundur. En ciddi potansiyel komplikasyonu miyokard laserasyon / rüptür ve buna bağlı kanama ve / veya hemoperikardiyum olduğunu. Th riskifareler (15 g altında) tekrar miyokardiyum boyunca iğne (dört ya da daha fazla) bir geçiş, akışkan haznesinin hızlı enjeksiyonu, kör iğne ucu yeniden, ve daha küçük farelerin kullanımı ile komplikasyon artar. Miyokard içinde birden fazla hedefleri seri (ön duvarı, yan duvar veya alt duvarını) enjekte edilir, bu usul komplikasyon riskini en aza indirmek için miyokardın içinden üç geçiş veya iğne daha az bunu başarmak için en uygunudur. Sol ventriküler miyokardın yan duvarları, göğüs duvarı boyunca iğnenin bir geçişi (Şekil 5E ve 5F) ile eş zamanlı olarak enjekte edilebilir, ancak bunlar birbirine paralel olarak aynı hizaya aracılığıyla iğnenin yeniden sokulmasını gerektirecektir başka bir hedefi, miyokart duvarının iğne açısı ayarı aşağıdaki göğüs duvarı. (Dakika başına 400 atış altında) diyastol sonu hacmini arttırmak ve önemli ölçüde miyokardiyal duvar kalınlığını azaltır fare bradikardi olarak oversedated olmamalıdır. Bizimfarenin hızla prosedüre kurtarmak ve derlenme dakika içinde kendi kafeslerine yürümelerine için deneyim. Onlar ortaya ne zaman komplikasyonlar, ani ve müdahale anda ortaya.
Bu protokol intramiyokardiyal enjeksiyon için yazılmıştır, ancak, nihai pozisyonda iğne ucu hafif bir değişiklik operatörün bir maddenin sistemik arteryel verilmesi için sol ventrikül boşluğun kan akışına enjeksiyon hedef sağlar. Konik uç sol ventrikül odasında olduğu (oksijen açısından zengin kan aspire) veya miyokard kas kütlesinin olmadığını teyit edebilir şırınga pistonu geri çekerek. Günümüzün yüksek verimli ve organa özgü viral vektörler, kardiyak bir özel promoter ile spesifik bir adeno-bağlantılı virüs serotipi 9 vektörü ile, bir araştırmacı, retro-orbital veya kuyruk damarından enjeksiyon yüksek güvenli verilmesinin sağlanması için bir alternatif olarak tekniğin adapte koroner viral yükkaraciğer tarafından düşürülen ilk geçiş emilimi ile dolaşım,. Kronik enfarktüs sıçan modelinde, yaralı ve fibrotik miyokard operatör iğne ucu gömmek için olan elde edilen ince duvarlı hedef verilen intramiyokardiyal enjeksiyon için iyi bir aday olabilir. Bununla birlikte, miyokard sınır bölge bölümleri intramiyokardiyal enjeksiyon ve açık olmalıdır torakotomi sonrası akustik camlar başarılı ultrason rehberliğinde için yeterli fazla.
Hayvan modellerinde intramiyokardiyal enjeksiyon miyokardiyuma teslim biyolojik ajanlara iyi tolere, verimli minimal invaziv ve teknik basit bir yöntem temsil, Ultrason eşliğinde. Bu teknik, hali hazırda daha önce açık torakotomi prosedürlerinden sonra da dahil olmak üzere, bir fare modelinde hiçbir deneysel bir zaman noktasında gen vektör veya hücre bazlı terapilerin başarılı bir şekilde verilmesi için kullanılabilir. Ekipman ve enjeksiyon prosedürü ile aşinalık ve yetkinlik olacak KazanılmasıDeneysel modellerde sonraki başarı sağlamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo 2100 ultrasound imaging system | Visualsonics | ||
| Vevo Integrated Rail System III | Visualsonics | ||
| Microscan MS400 transducer | Visualsonics | ||
| Microscan MS550D transducer | Visualsonics | ||
| PrecisionGlide needles | BD | 305128 | 30 G x 1 in/2.5 cm |
| 1 cc slip tip syringe | Exel International | 26048 | or equivalent |
| Gastight 50 μl glass syringes | Hamilton | 1705 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250 | or equivalent |
| Isoflurane | Baxter | AHN3640 | or equivalent |
| Aquasonic 100 | Parker Laboratories | (01-08) | or equivalent |
| Polystyrene microspheres (red fluorescent) | Life Technologies | F-8842 | or equivalent |
References
- Kochanek, K. D., et al. Deaths: final data for 2009. Natl Vital Stat Rep. 60 (3), 1-117 Forthcoming.
- Strauer, B. E., Steinhoff, G. 10 years of intracoronary and intramyocardial bone marrow stem cell therapy of the heart: from the methodological origin to clinical practice. J Am Coll Cardiol. 58, 1095-1104 (2011).
- Cheng, K., et al. Intramyocardial autologous cell engraftment in patients with ischaemic heart failure: a meta-analysis of randomised controlled trials. Heart Lung Circ. 22 (11), 887-894 (2013).
- Fischer-Rasokat, U., et al. A pilot trial to assess potential effects of selective intracoronary bone marrow-derived progenitor cell infusion in patients with nonischemic dilated cardiomyopathy: final 1-year results of the transplantation of progenitor cells and functional regeneration enhancement pilot trial in patients with nonischemic dilated cardiomyopathy. Circ Heart Fail. 2, 417-423 (2009).
- Seth, S., et al. Percutaneous intracoronary cellular cardiomyoplasty for nonischemic cardiomyopathy: clinical and histopathological results: the first-in-man ABCD (autologous bone marrow cells in dilated cardiomyopathy) trial. J Am Coll Cardiol. 48, 2350-2351 (2006).
- Ladage, D., et al. Percutaneous methods of vector delivery in preclinical models. Gene Ther. 19, 637-641 (2012).
- Zangi, L., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nat Biotechnol. 31, 898-907 (2013).
- Laakmann, S., et al. Minimally invasive closed-chest ultrasound-guided substance delivery into the pericardial space in mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 386 (3), 227-238 (2013).
- Respress, J. L., Wehrens, X. H.
- Wang, G., et al. Characterization of cis-regulating elements and trans-activating factors of the rat cardiac troponin T gene. J Biol Chem. 269, 30595-30603 (1994).
- Shimshek, D. R., et al. Codon-improved Cre recombinase (iCre) expression in the mouse. Genesis. 32, 19-26 (2002).
- Lichtenauer, M., et al. Intravenous and intramyocardial injection of apoptotic white blood cell suspensions prevents ventricular remodelling by increasing elastin expression in cardiac scar tissue after myocardial infarction. Basic Res Cardiol. 106 (4), 645-655 (2011).
- Herrmann, J. L., et al. Postinfarct intramyocardial injection of mesenchymal stem cells pretreated with TGF-alpha improves acute myocardial function. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 299 (1), 371-378 (2010).
- Zhou, Y., et al. Direct injection of autologous mesenchymal stromal cells improves myocardial function. Biochem Biophys Res Commun. 390 (3), 902-907 (2009).
- Campbell, N. G., Suzuki, K. Cell delivery routes for stem cell therapy to the heart: current and future approaches. J Cardiovasc Transl Res. 5 (5), 713-726 (2012).
- Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112, Suppl 9. 150-156 (2005).
- Dib, N., et al. Recommendations for successful training on methods of delivery of biologics for cardiac regeneration: a report of the International Society for Cardiovascular Translational Research). JACC Cardiovasc Interv. 3 (3), 265-275 (2010).
- Dib, N., et al. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 177-181 (2011).
