Summary
Echokardiographie geführten perkutanen intramyokardiale Injektion stellt einen effizienten, zuverlässigen und anzielbare Modalität für die Lieferung von Gentransfermittel oder Zellen in die Maus-Herz. Nach der Schritte in diesem Protokoll dargelegt, kann der Bediener schnell kompetente werden in diesem vielseitigen, minimal-invasive Technik.
Abstract
Mausmodellen für kardiovaskuläre Erkrankungen sind wichtig für die Untersuchung von pathophysiologischen Mechanismen und lotet mögliche regenerative Therapien. Experimente mit myokardialen Injektion werden derzeit von direkten chirurgischen Zugang durch eine Thorakotomie durchgeführt. Während praktisch, wenn zu der Zeit eines anderen experimentellen Manipulation wie Koronararterienligatur geführt, die Notwendigkeit für eine invasive Prozedur für intramyokardialer Lieferungsgrenzen Potential experimentellen Designs. Mit immer Ultraschall-Auflösung und erweiterte nicht-invasive bildgebende Verfahren zu verbessern, ist es jetzt möglich, Ultraschall-geführte perkutane Injektion intramyokardiale routinemäßig durchzuführen. Diese Modalität effizient und zuverlässig liefert Agenten zu einer Zielregion des Herzmuskels. Vorteile dieser Technik sind die Vermeidung von chirurgischen Morbidität, die Möglichkeit, Regionen des Herzmuskels selektiv unter Ultraschallkontrolle gerichtet sind, und die Möglichkeit, an der Injektionsmittel myocardiu liefernm an mehreren, vorbestimmten Zeitintervallen. Mit geübter Technik, sind Komplikationen von intramyokardiale Injektion selten, und Mäuse schnell zu normalen Aktivitäten zurückkehren auf die Genesung von Betäubungsmittel. Nach der Schritte in diesem Protokoll dargelegt, kann der Bediener mit einfachen Echokardiographie Erfahrung schnell kompetente werden in diesem vielseitigen, minimal-invasive Technik.
Introduction
Herzkrankheiten sind die häufigste Todesursache für Männer und Frauen in den Vereinigten Staaten, auf die 600.000 Todesfälle pro Jahr 1. Mausmodellen von kardiovaskulären Erkrankungen sind für die Untersuchung von pathophysiologischen Mechanismen für die Erkundung und mögliche Therapien von entscheidender Bedeutung. Myokardiale Lieferung Gentherapievektoren, Stammzellen, modifizierte RNAs und anderen therapeutischen Mitteln ermöglicht Untersuchung ihrer therapeutischen Potenzials für Herzerkrankungen 2-7. Derzeit gibt es nur beschränkte Möglichkeiten für myokardiale Lieferung von Therapeutika in Maus-Modellen 6. Intramyokardiale Injektion unter direkter Visualisierung wird häufig verwendet, erfordert aber eine Sternotomie oder Thorakotomie und auf dem freigelegten Bereich des Herzens beschränkt. Während praktisch, wenn zu der Zeit eines anderen experimentellen Manipulation wie LAD-Ligation durchgeführt wird, die Notwendigkeit für eine invasive Prozedur für intramyokardialer Lieferungsgrenzen Potential experimentellen Designs und führt eineW eitere Effekte aus dem Verfahren (zB Fibrose durch Thorakotomie). Perkutane perikardialen Lieferung von viralen Vektoren wurde berichtet, aber die Stelle und Verteilung des therapeutischen Mittels ist nicht homogen und ist schwierig zu steuern 8. Perkutanen koronaren Injektion Ergebnisse in homogener Verteilung der injizierten Materials, aber effiziente und reproduzierbare koronare Lieferung ist eine Herausforderung in Mausmodellen.
Hier beschreiben wir eine geschlossene Brust intramyokardiale Injektionstechnik, die minimal-invasive, bedienergesteuerte Targeting von Therapeutika unter Ultraschallkontrolle ermöglicht. Die Technik ist einfach zu erlernen, macht die Notwendigkeit für Thorakotomie oder Sternotomie und den damit verbundenen experimentellen Komplikationen und eine größere Flexibilität bei der Zeitsteuerung und die Stellen der intramyokardiale Injektion. So, Echokardiographie-unterstützten intramyokardiale Injektion stellt eine technisch einfache und sehr effektive Methode der Manipulation derMyokard in murinen experimentellen Modellen.
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Protocol
Alle beschriebenen Schritte wurden unter Protokolle von der Institutional Animal Care und Use Committee von Boston Kinderkrankenhaus durchgeführt genehmigt.
1. Vorbereitung
- Führen Basisherz anatomische und funktionelle Beurteilung durch Echokardiographie vor Beginn der Injektionsprotokoll, wie die optimale Festwandlerposition für intramyokardiale Injektion kann nicht die optimalen Standardansichten für die Abgrenzung und Bewertung der Anatomie Funktion ergeben.
- Die Einspritzanordnung ist in den Figuren 1A-1C dargestellt. Stellen Sie eine leere Spritze mit einer Nadel ummantelten, Kegel nach oben gerichtet, in der Spritzenklemme (siehe Abbildung 1c) und sichern die Ultraschallwandler-Sonde in der Scan-Kopf-Bügel (siehe Abbildung 1B). Lösen Sie den Scan-Kopf-Klemmkugelsperrgelenk (Abbildung 1B) und zu manipulieren, den Wandler Orientierung, so dass sie parallel zur Achse der Nadel ausgerichtet. Befestigen Sie den ScanKopfposition durch Anziehen der Scan-Kopf-Klemmkugelsperrgelenk.
HINWEIS: Für die Injektion in erwachsenen Mäusen, ist eine 30 G-Nadel mit einer 1 in / 2,5 cm Länge optimal. Eine 1 ml-Spritze für größere Mengen verwendet werden, während eine gasdichte Spritze kann für eine genauere Steuerung der kleineren Volumina (5-10 ul) verwendet werden. - Gelten Ultraschall-Gel großzügig auf den Wandler Spitze mit einem Spatel, um den Kopf entlang seiner Gesamtheit abdecken. Sorgfältig Scheide ziehen die Nadel und verwenden die Nadelhalterung Kontrollen, um die Nadel direkt unter dem Sensor und in der Ultraschall-Gel für die Visualisierung zu fördern. Geringfügige Änderungen mit der Nadelhalterung Steuerung, so dass die Nadel deutlich entlang seiner Länge auf dem Ultraschallbild sichtbar gemacht. Wenn der Wandler ordnungsgemäß parallel zu der Nadel in Schritt 1.4 ausgerichtet ist, dann sollte die Nadel in der Bildebene bleibt, wie sie ist, vorgeschoben und mit dem Injektionsknopf (1C) zurückgezogen.
- In nachfolgenden Schritten nicht stören die Notwendigkeitle / Wandler horizontale Ausrichtung durch Bewegen sowohl in der horizontalen Achse. Vielmehr gezielt bestimmte Bereiche des Herzens zur Injektion durch Ändern der vertikalen (y-Achse), Position der Nadelhalterung und durch Bewegen des Tieres Plattform.
- Bewegen des Wandlers kranial vom Tier-Plattform unter Verwendung der Scan-Höhensteuerung (1B), um nachfolgende Platzierung der anästhesierten Maus auf das Tier Plattform ermöglichen. Dies wird nicht die x-Achsen-Ausrichtung des Wandlers unterbrechen, um die lange Achse der Nadel.
- Entfernen Sie die Spritze, die für die Ausrichtung von der Spritzenklemme verwendet wurde, und entsorgen Sie sorgfältig. Laden Sie die neue Nadel und Spritze mit der Injektionsmittels auf die endgültige Zielvolumen, so dass für toten Raum in der Spitze der Spritze. Seien Sie vorsichtig, um Luftblasen zu entfernen. Legen Sie die Spritze in die Spritzenklemme ohne Anpassung ihrer x-Achse ausgerichtet. Vollständig einfahren die Spritze mit der Einspritzsteuerung.
HINWEIS: Für die erste Trainingszwecke ist die Verwendung von Evans-BlauFarbstoff (1%), kann Trypanblau-Färbung (0,4%) oder eine Suspension von fluoreszierenden Mikrosphären als Injektats den Bediener bei der Bestätigung Kompetenz und Erfolg von gezielten Injektion zu unterstützen.
2. Injektion
- Schalten Sie den integrierten wärmer der Heizungs Plattform und stellen Sie sie für 37 ° C. Legen Sie das Tier Plattform 180 ° von der üblichen bildgebenden Orientierung, mit der Anästhesie Schlauchschelle und Kopf des Tieres am nächsten an den Betreiber. Dies ermöglicht das Herz (in der linken Seite der Brust) ipsilateral zur Spritzenklemme und Nadel sein. Hinweis: Weitere kleinere Uhrzeigersinn Dreh Anpassungen der Tier Plattform kann notwendig sein, um das Herz richtig für die parasternalen kurzen Achse Abbildungsebene, die zur Injektion (2A) verwendet wird, zu orientieren.
- Vorbereitung Mäuse für Echokardiographie, wie zuvor berichtet 9. Betäuben die Maus in eine Induktionskammer mit 2% Isofluran. Brusthaare entfernen mit Enthaarungscreme einD Schmier Gel für beide Augen, um das Trocknen der Lederhaut zu verhindern.
- Heben Sie den Wandler mit der Scan-Kopf Höhenkontrolle (Abbildung 1B). Legen Sie den narkotisierten Maus in Rückenlage oben auf der beheizten Tier Plattform mit der Schnauze in einem Nasenkonus liefert 1-3% Isofluran (2A-2B). Sie vorsichtig mit einem rektalen Sonde und kleben Sie die vier Pfoten auf den EKG-Elektroden, Elektroden-Gel für die Anwendung elektrischer Kontakt.
HINWEIS: Eine angemessene Betäubung muss für die humane Behandlung der Tiere gewährleistet werden. Es sollte keine Veränderung der Herzfrequenz und keine Reaktion auf die Platzierung der Nadel durch die Brustwand sein. Integrierte homöostatischen Temperaturkontrollen des Tieres Plattform sollte verwendet werden, um Normothermie (37 ± 0,5 ° C) zu erhalten, wie Hypothermie wird in relativer Bradykardie, ventrikuläre Dilatation und mögliche Beschwerden führen. - Sobald der Mauszeiger auf dem Tier-Plattform sicher, senken den Wandler auf die depilaTed Brust mit Hilfe der Scankopf Höhenkontrolle (Abbildung 1B). Die optimale Ultraschall-Setup für die Injektion ist für das Herz in der parasternalen kurzen Achse Orientierung visualisiert werden, wie pro Standard-Echokardiographie-Technik. Dreht das Tier Plattform 20-30 ° im Uhrzeigersinn, um die optimale Schallfenster zur Injektion in der kurzen Achse Bildebene (2A-2B) zu erhalten. Hinweis: Alternativ Injektion können aus einer parasternalen langen Achse Orientierung durch Drehung im Gegenuhrzeigersinn des Tieres Plattform (2C) durchgeführt werden.
- Verwenden Sie die Tier-Plattform-Anpassungssteuerung auf das Sichtfeld anzupassen und jede gewünschte Injektionsstelle in der linksventrikulären Myokard Ziel. Pfanne hin und her von der Spitze zur Basis des Herzens, um die gewünschte Einspritzstelle in der linken ventrikulären Myokards (3A-3C) zu erzielen. Hinweis: Die midpapillary parasternalen Kurzachsenansicht (3A) bietet reproducible Wahrzeichen, die Follow-Bildgebung von der Injektionsstelle zu ermöglichen. Anmerkung: Alternativ kann der parasternalen Längsachsenansicht verwendet, um eine vorgegebene Injektionsstelle (3D) zu zielen.
- Beginnend mit der Spritze in der vollständig zurückgezogenen Spritzenklemme, langsam voran die Spritze gegen den Brustkorb des Tieres durch Drehen des Einspritzsteuerung im Uhrzeigersinn (4A). Um es klar Ultraschall Visualisierung sowohl der Herz-und der Nadelspitze zu ermöglichen, wie es die Brust nähert, verwenden viele Ultraschall-Gel über der linken Brustseite und Optimierung der Schallfenster, indem Sie ein breites Sichtfeld auf die Echokardiographie Kontrollen. Gesetzt den Brennpunkt / Zone an der Zielstelle für die Injektion. Kleinere Anpassungen an der Nadelhalterung steuert das Bild der Nadel entlang ihrer Länge zu optimieren.
HINWEIS: Einige Ultraschall-Maschinen haben einen Nadelführung Software-Funktion, um digital zu erweitern eine Linie entlang der langen Achse der Nadel bis zur Zielherzmuskel(4B). Solch ein Software-Werkzeug kann hilfreich sein, ist aber nicht wesentlich. - Mit dem Tier entsprechend sediert, vorab die Nadel durch die Brustwand von der Maus und in den Herzmuskel, sorgfältig beobachten die Position der Nadelspitze abgeschrägt haupt (1-3% Isofluran mit 0,5-0,8 l / min 100% Sauerstoff gemischt) Zeiten. Stoppen Sie voran, wenn die Nadelspitze in der Zielherzmuskels (4C). Die ganze abgeschrägten Spitze sollte sicher innerhalb des Herzmuskels sein, Injektats Leck in den Herzraum zu vermeiden.
- Wenn die Spitze in die gewünschte Position, liefern die Injektats durch Druck auf den Spritzenkolben. Liefern die Injektats langsam, über 5-30 sec (abhängig vom Volumen der Auslieferung). Bis zu 50 ul Injektats können, ohne Kompromisse Herzfunktion geliefert werden. Eine vorübergehende echobright Aussehen der injizierten Herzmuskelbereich kann offensichtlich nach erfolgreicher Injektion sein. Eine kurze (Sekunden) Zeit relativer bradycardia ist gelegentlich mit der Injektion in den Herzmuskel festgestellt und schnell löst.
- Sobald die Injektats verabreicht wurde, zeitnah ziehen Sie die Nadel durch Drehung gegen den Uhrzeigersinn des Einspritzsteuerknopf. Die Maus sollte unter Narkose für einige Minuten von echokardiographischen Beobachtung zu erhalten ventrikuläre Funktion und keine Komplikationen postprocedural bestätigen gehalten werden. Wenn angegeben, kann mehrere Regionen des Herzmuskels seriell durch Neupositionierung der Böschungswinkel der Nadel durch die Einstellung der Tier Plattform eingespritzt werden. Nach intramyokardiale Injektion wird die Maus in einen Käfig von sich gegeben und sich von der Anästhesie unter Beobachtung zu gewinnen.
- Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis er das Bewusstsein wiedererlangt, um ausreichend Brustlage zu halten. Sie ein Tier, das intramyokardiale Injektion, um der Gesellschaft von anderen Tieren unterzogen wurde, bis vollständig erholt nicht zurück. Der Käfig sollte auf einem thermoregulierten Pad mit Wieder platziert werdenAdy Bereitstellung von Wasser und Maus Diät. Postprocedural Beschwerden ist nicht zu erwarten und die Nicht normales Verhalten kurz nach der Intervention entsprechend wieder schlägt eine mögliche Komplikation (siehe Diskussion).
- Sorgfältig entsorgen Sie die Nadel unmittelbar nach Abschluss der intramyokardiale Injektion, um das Risiko von Kleie Verletzungen des Bedieners oder Dritter zu minimieren. Wiederverwendung einer Nadel in Abstumpfen der Spitze macht es schwieriger, den Herzmuskel zu durchdringen und zu einem höheren Risiko von Komplikationen führen.
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Representative Results
Murine intramyokardiale Injection mit blauer Farbe oder Leuchtstoff-Mikrokügelchen
Injektion von Evans-Blau-Farbstoff ist nützlich für Schulungszwecke. Bald nach der Injektion, einschläfern die Maus und entfernen Sie das Herz, um den Standort des injizierten blauen Farbstoff zu visualisieren. Abbildung 5 zeigt ein Beispiel einer erfolgreichen Injektion, mit blauen Farbstoff Infiltration des Herzmuskels in der Mitte Papillarmuskel Ebene (5A, Region eingeschlossen durch die gestrichelte Linie). Evans-Blau-Farbstoff wird aus dem Gewebe innerhalb weniger Stunden zu waschen. Für weitere dauerhafte Kennzeichnung der Injektionsstelle können fluoreszierende Mikrosphären, die auf unbestimmte Zeit an der Injektionsstelle bleiben werden. 5C-5F zeigt Mehrfacheinspritzung Ziele in den vorderen und hinteren Wände des linken Ventrikels.
Adenovirus Injektion in Herzmuskel
Um die Lieferung von Adenovirus Myokard durch Ultraschall Führungs visualisierend Injektion injiziert wir ein Adenovirus, in dem der Kardiomyozyten spezifische Ratte Troponin T Promotor 10 steuert die Expression von Säuger codonoptimierten Cre 11. Die Domäne der Cre-vermittelte Rekombination unter Verwendung Rosa26 mTmG Mäusen, wobei Cre die Rekombination ausgeschaltet wird rot fluoreszierendes Protein (RFP) und schaltet auf grün fluoreszierendes Protein (GFP) bestimmt. Eine einzige Injektion von 50 ul Virus (2,8 x 10 9 infektiöse Einheiten / ml) GFP-Expression innerhalb von 7 Tagen nach der Injektion (Figur 6) bereichsweise aktiviert. Einige regionale myokardiale Infiltration von Gewebeschichten über den ursprünglichen Ort der Injektion ist in der Schnittbilder geschätzt.
Abbildung 1. Ultraschall-gesteuerte Injektion Setup. A) Übersicht über die integrierten Eisenbahnsystem, die es erlaubens Ausrichtung der Injektionsspritze und Ultraschall Kopf. B) Ultraschall Scan-Kopf Kontrollen. Der Abtastkopf wird in Position verriegelt ist, um die Injektionsspritze ausgerichtet. Das Sichtfeld wird durch Bewegen der Tier-Plattform. C) Injektionsspritze Kontrollen eingestellt.
Abbildung 2. Optimale Positionierung der Maus auf das Tier-Plattform für Ultraschall-geführte Nadelinjektion. A) Ausrichtung des Tieres Plattform, Nadel und Wandler für intramyokardiale Injektion aus der kurzen Achse Abbildungsebene. B). Nahaufnahme der Weg der Nadel unter Sichtfeld des Wandlers durch eine großzügige Menge an Ultraschall-Gel, wie es in die Brusthöhle gelangt . C) Ausrichtung des Tieres Plattform, Nadel und Wandler zum intramyokardialer injection in der parasternalen langen Achse Abbildungsebene.
Abbildung 3. Repräsentative Ultraschallbilder des Herzmuskels für die Ausrichtung in den parasternalen kurzen Achse und langen Achse Flugzeuge. AC) Kurzachsen der linken Herzkammer auf der Ebene der Mitte der Papillarmuskeln (A), unter den Papillarmuskeln (B) und der Spitze des Herzens (C). D) langBildAchse zeigt intramyokardiale Injektion in die vordere linke Ventrikelwand. Pfeile markieren die Position der Nadelschaft.
Abbildung 4. Repräsentative 2D-Echokardiographie Bilder. A) B) Nadelführung Overlay-Funktion entlang der langen Achse der Nadel und die Vorhersage einen Kurs (grün gestrichelte Linie) durch die vordere Myokard. C) Spritzguss Myokard ausgerichtet mit Fase der Nadel in der Vorderwandwand begraben.
Abbildung 5. Kennzeichnung der Injektionsstelle mit Evans-Blau-Farbstoff oder Fluoreszenzmikrokügelchen. Intramyokardiale Injektion von blauem Farbstoff in die vordere Herzmuskelwand. A) Querschnitt des Herzens auf der Ebene der midpapillary Muskeln, was die Infiltration des Farbstoffs 30 min nach intramyokardiale Lieferung an dielinken Ventrikels. B) Visible Einstichstelle von der Nadel auf der linken Seitenfläche des Herzmuskels. C, D) Murine Myokard zeigt rot fluoreszierenden Mikroperlen 7 Tage nach separaten intramyokardiale Injektion in den vorderen und hinteren Wände des linken Ventrikels. E, F) Linke Myokard in der Mitte Papillarmuskel in der Querebene des Herzens zeigen Abscheidung von roten fluoreszierenden Mikroperlen geschnitten. Mikrokügelchen verstreut über die Schnittfläche war wegen während und nach dem Schneiden des Herzens mit einem Messer in den Pufferdispersion.
Abbildung 6. Fluoreszenzmarkierung der Vorderwandwand einer Rosa26 mTmG Herzens nach Einzel intramyokardiale Injektion eines TNT-ICREAdenovirus. A) Die Lichtmikroskopie der vorderen Wand eines murinen ganze Herz 7 Tage nach regionalen adenoviralen Injektion. B) Fluoreszenzbild (EGFP) in der gleichen Herz zeigt erfolgreiche Zustellung und myokardiale Transduktion von einem adenoviralen Vektor. C, D) Querschnitt an der Mitte Papillarmuskel Niveau, was die Ausdehnung der regionalen Transfektion von einem einzigen intramyokardiale Injektion von Adenovirus (50 ul von 2,8 x 10 9 infektiöse Einheiten / ml).
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Discussion
Biologics können, um den Herzmuskel durch direkte Injektion intramyokardiale, intraperikardiale Injektion oder indirekte Verwaltung über die Blutbahn abgegeben werden. Neueste zellbasierten Therapiestudien bei Myokardinfarkt-Modelle haben eine offene Thorakotomie Ansatz für die Lieferung von Injektats 12-14 beschrieben. Ein wichtiger Faktor für den Erfolg einer Herzmuskel therapeutische Intervention hängt von der Wahl der Lieferroute. Die höchste lokale Dosis von biologischen wird durch intramyokardiale Lieferung 15,16 erreicht. Intramyokardiale Injektion unter die direkte Visualisierung ist die einfachste Methode und erlaubt den gezielten Verwaltung im Myokard 17. Jedoch ist dieses Verfahren auch die invasive, wie es Eröffnung der Brusthöhle und Herzbeutel, um die Zielherzmuskels 18 freizulegen erfordert. Abschnitte des Herzens, wie beispielsweise seiner Rückenfläche nicht leicht sichtbar gemacht und unter Verwendung dieses Verfahrens injiziert. Die Invasivität der ProcedUre schränkt auch potentielle therapeutische Behandlungszeitpläne. Hier beschreiben wir eine technisch einfache, zuverlässige und reproduzierbare Technik, Biologika oder Drogen unter Ultraschall-Führung sicher durch perkutane Injektion intramyokardiale liefern, ohne die Morbidität und Zwänge der chirurgischen Thorakotomie Exposition. In mehr als 150 Mäuse bisher eingespritzt wird, nach anfänglichen technischen Kompetenz erhalten wurde, war unser periprozeduralen Sterblichkeitsrate unter 5%, wenn weniger als vier myokardialen Seiten wurden zu einem Zeitpunkt ausgerichtet. Gesamt Injektats Volumen von bis zu 200 ul wurden überraschend gut von der murinen Herzen toleriert. Die vordere Myokard eignet sich gut als Ziel für die Injektion, da die parallele Ausrichtung dieser Region des Herzmuskels zu der Längsachse der Nadel, so dass die Nadel in den Muskel des Herzens mehr sicher bleiben. Es ist wichtig, dass der Bediener sichtbar die gesamte abgeschrägte Spitze im Myokard vor der Injektion, da dies gewährleistet die volle Abgabe des injectate ohne Leckage in die umliegenden Gewebe. Darauf zu achten, die Nadelspitze immer sichtbar bleibt innerhalb der Herzmuskel ist auch entscheidend für eine erfolgreiche myokardialen Injektion. Beim Üben mit Evans-Blau-Farbstoff, wird eine versehentliche Injektion in die Herzkammer in die Maus schnell die Entwicklung eines blauen Farbton sichtbar am deutlichsten in der enthaarte Haut führen. Es ist auch erwähnenswert, dass Nadeleinführung durch die Brustwand wird allein durch die Ultraschall-Bild von der beabsichtigten Zielherzmuskels und nicht durch Oberflächen anatomischen Landmarken der Maus angezeigt bestimmt. Für einen erfahrenen echocardiographer, Kompetenz in intramyokardiale Injektion kann vernünftigerweise nach dem Training auf 4-5 Versuche erreicht werden.
Wenn die Nadel durch die Brustwand durchläuft, muss es durch die Zwischenrippenraum passieren. Es ist nicht ungewöhnlich zu haben, um kleinere Anpassungen an der Bildebene einmal durch die Zwischenrippenraum zu machen, um die abgeschrägte Spitze klar im Blick zu halten. Thwird in der Regel durch kleinere Anpassungen des Tieres Plattform oder die Injektionsspritze Kontrollen durchgeführt. Die geringfügige Modifikationen sollten erfolgen, wenn die Nadel durch den Brustkorb, aber bevor es in das Myokard durchlaufen hat, um myokardiale Wunde und Trauma aus wiederholten Nadelspitze Manipulation zu verhindern. Um das Risiko von Hämoperikard zu minimieren, sollte das Ziel sein, das Herz als einige Male geben wie nötig, um Lieferung von Injektats vollständig sind. Obwohl die beschriebene Technik ist für intramyokardiale Injektion in der kurzen Achse Ebene des Herzens, ist es ebenso möglich, in der parasternalen langen Achse Ebene des Herzens durch einfache Anpassung des Tieres Plattform zu injizieren, um mit dieser Ebene (2C) und Umleiten ausrichten die Nadel, um die beabsichtigte Ziel des Herzmuskels (3D) eingeben.
Erfolgreiche intramyokardiale Injektion kann durch einen Indikator bestätigt Farbstoff sofort pathologischen Prüfung an der anschließendIonen der injizierten Maus Herz. Injektion einer Suspension von fluoreszierenden Mikrokugeln, auf unbestimmte Zeit an der Injektionsstelle verbleiben und kann gleichzeitig mit einem anderen Mittel verabreicht werden, um das Zielgebiet zu kennzeichnen. Die Maus wird mit inhalativen Kohlendioxid durch geschultes Personal pro institutionellen Umgang mit Tieren Protokolle eingeschläfert. Die Untersuchung der Herzoberfläche wird die injizierte Region zu offenbaren, und schneiden das Herz mit einem Herz Matrix Querschnitte, die die Region zu demonstrieren injiziert wird ergeben. Vorteilhaft, wenn wiederholte Injektion und / oder Abbildung des gleichen Herzmuskelbereichs über die Zeit gewünscht wird, ist sie auf die Standardbildebenen zu verwenden und reproduzierbare anatomische Orientierungs Ziel. Beispielsweise ist es bequem, die Kurzachse Abbildungsebene zu verwenden, um den linken Ventrikel bei der midpapillary Muskelebene (3A) zu erzielen. Die schwerste Komplikation ist Potenzial myokardialen Platzwunde / Bruch und damit Blutungen und / oder Hämoperikard. Das Risiko von thist Komplikationen steigt mit wiederholten Durchläufen der Nadel (vier oder mehr) durch das Myokard, schnellen Injektion der Flüssigkeit Bolus Wiederverwendung eines stumpfen Nadelspitze und die Verwendung von kleineren Mäusen (unter 15 g) Mäusen. Wenn mehrere Ziele im Myokard injiziert werden seriell (Vorderwand, Seitenwand oder untere Wand), ist es optimal, dass in drei Durchgängen oder weniger der Nadel durch Myokard zu erreichen, um das Risiko von Verfahrenskomplikationen minimieren. Die Seitenwände der linken ventrikulären Myokards kann gleichzeitig mit einem Durchgang der Nadel durch die Brustwand (5E und 5F) injiziert werden, da sie parallel zueinander ausgerichtet, aber andere Myokardwand Ziel wird erneut Einführen der Nadel durch das erforderlich Brustwand folgende Nadel Winkelverstellung. Die Maus sollte nicht als Bradykardie oversedated (unter 400 Schläge pro Minute) können die enddiastolische Volumen zu erhöhen und eine deutliche Verringerung der myokardialen Wanddicke. UnsereErfahrung ist für Mäuse, um von dem Verfahren schnell zu erholen und in ihren Käfigen innerhalb von Minuten nach Erwachen aus der Narkose ambulate. Komplikationen, wenn sie auftreten, sind abrupt und treten bei der Intervention.
Obwohl dieses Protokoll für die intramyokardiale Injektion geschrieben, eine leichte Modifizierung der endgültigen Nadelspitzenposition kann der Bediener die Injektion in den Blutstrom des linksventrikulären für systemische arterielle Abgabe eines Mittels Ziel. Zurückziehen auf dem Spritzenkolben kann bestätigen, ob die Kegelspitze in der linken Herzkammer (sauerstoffreiche Blut abgesaugt) oder in der Herzmuskelmuskelmasse. Bei den heutigen hocheffiziente und organspezifische virale Vektoren, insbesondere eines Adeno-assoziierten Virus-Serotyp 9-Vektor mit einem herzspezifischen Promotor kann ein Forscher diese Technik als eine Alternative zu retro-orbitale oder Schwanzvenen-Injektion, um eine sichere Verabreichung einer hoch erzielen anzupassen Viruslast in den koronarenKreislauf mit reduzierten ersten Durchgang Absorption durch die Leber. In der chronischen Postinfarktmausmodell, das vernarbte und fibrotische Herzmuskel kann sich nicht gut eignen, um intramyokardiale Injektion die resultierende dünnwandigen Ziel der Betreiber, um die Nadelspitze in begraben. Allerdings sollten Grenzzone Regionen des Herzmuskels zugänglich intramyokardiale Injektion und sein akustische Fenster nach Thorakotomie sind mehr als ausreichend für eine erfolgreiche Ultraschall-Führung.
Ultraschall-gesteuerte, intramyokardiale Injektion in Tiermodellen eine gut verträgliche, effiziente, minimal-invasive und technisch einfache Methode, um biologische Arbeitsstoffe Lieferung an den Herzmuskel. Diese Technik kann ohne weiteres für die erfolgreiche Lieferung von Gen-Vektoren oder zellbasierte Therapien in einem Mausmodell eingesetzt werden zu jeder experimentellen Zeitpunkt, auch nach vorangegangenen offenen Thorakotomie Verfahren. Erwerb von Vertrautheit und Kompetenz mit der Ausrüstung und der Einspritzvorgang wirdsicherzustellen späteren Erfolg in experimentellen Modellen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo 2100 ultrasound imaging system | Visualsonics | ||
| Vevo Integrated Rail System III | Visualsonics | ||
| Microscan MS400 transducer | Visualsonics | ||
| Microscan MS550D transducer | Visualsonics | ||
| PrecisionGlide needles | BD | 305128 | 30 G x 1 in/2.5 cm |
| 1 cc slip tip syringe | Exel International | 26048 | or equivalent |
| Gastight 50 μl glass syringes | Hamilton | 1705 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250 | or equivalent |
| Isoflurane | Baxter | AHN3640 | or equivalent |
| Aquasonic 100 | Parker Laboratories | (01-08) | or equivalent |
| Polystyrene microspheres (red fluorescent) | Life Technologies | F-8842 | or equivalent |
References
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