Summary
心エコーガイド下経皮的心筋内注入は、マウスの心臓への遺伝子導入剤又は細胞の送達のための、効率的で信頼性が高く、標的可能なモダリティを表しています。このプロトコルで説明されている手順に続いて、オペレータは、すぐにこの汎用性、低侵襲性技術で有能になることができます。
Abstract
心血管疾患のマウスモデルは、病態生理学的メカニズムを調査し、潜在的な再生治療を探索するのに重要である。心筋の注入を含む実験は、現在、開胸を通じて直接外科的アクセスによって実行されます。そのような冠動脈結紮などの別の実験操作時に行う際に便利な一方で、心筋内送達のための侵襲的処置の必要性が潜在的な実験デザインを制限します。これまでの超音波の解像度と、高度な非侵襲イメージングモダリティを改善すると、それは日常的に超音波ガイド下、経皮的心筋内注射を行うことが今や可能である。この様式は、効率的かつ確実に心筋の標的領域にエージェントを提供します。この技術の利点は、外科的罹患率の回避、選択的に超音波ガイド下心筋の領域を標的とする機能、およびmyocardiuに注入液を送達する機会を含む複数、所定の時間間隔でmである。練習技術では、心筋内注射による合併症はまれであり、マウスはすぐに麻酔からの回復に通常の活動に戻る。このプロトコルで説明されている手順に続いて、基本的な心エコー検査の経験を持つオペレータは、すぐにこの汎用性、低侵襲性技術で有能になることができます。
Introduction
心臓病は、毎年60万死者1を占め、米国の男性と女性の両方のための主要な死亡原因である。心血管疾患のマウスモデルは、病態生理学的メカニズムを調査するため、潜在的な治療法を探索するのに非常に重要である。遺伝子治療ベクターの心筋送達、幹細胞は、修飾RNA、および他の治療剤は、心臓病2-7に対するそれらの治療可能性の調査を可能にする。現在、マウスモデル6における治療薬の心筋の送達のための限られた選択肢があります。直接可視化の下で心筋注射が一般的に使用されますが、胸骨切開または開胸術を必要とし、心臓の露出領域に限定されているされている。そのようなLAD結紮などの別の実験操作時に行う際に便利な一方で、心筋内送達のための侵襲的処置の必要性が潜在的な実験デザインを制限し、紹介する手順（開胸術によるもので、 例えば線維症）からdditional効果。ウイルスベクターの経皮的心膜送達が報告されているが、サイトおよび治療 剤の分布は均一ではなく、コントロール8に困難である。注入された材料のより均一な分布における経皮的冠動脈注入の結果が、効率的で再現性の冠動脈配信マウスモデルにおいて困難である。
ここでは、超音波ガイド下の治療薬の低侵襲性、オペレータ制御されたターゲティングを可能にする、閉じた胸の心筋内注入技術について説明します。技術は習得が容易で、開胸や胸骨切開とそれらに付随する実験的な合併症を不要、タイミングや心筋内注射部位に大きな柔軟性を提供します。このように、心エコー検査補助心筋内注入は、操作する技術的に簡単かつ非常に効果的な方法を示し、マウス実験モデルにおいて心筋。
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Protocol
すべての説明する手順は、ボストン小児病院の施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルの下で実施した。
の調製
- 心筋内注射のための最適な固定トランスデューサ位置が解剖学と機能の評価の輪郭を描くための最適な標準のビューを得られない可能性がある、以前の注入プロトコルを開始する心エコー検査によるベースライン心臓解剖学的および機能評価を行います。
- 注入のセットアップは、 図1A〜1Cに示されている。シリンジクランプで、ベベル指向上向き、シース針を空のシリンジを置きます（ 図1Cを参照）、（ 図1Bを参照）スキャンヘッドクランプに超音波トランスデューサ·プローブを固定します。スキャンヘッドクランプボールロックジョイント（ 図1B）をゆるめ、それが針の軸に平行に位置合わせされるように、変換器の向きを操作する。スキャを修正スキャンヘッドクランプボールロックジョイントを締めてヘッド位置。
注：成体マウスでの注射のために、1 / 2.5cmの長さが30のGの針が最適である。気密シリンジより少量（5〜10μl）をより正確に制御するために使用することができながら、1mlシリンジは、より大きな体積のために使用することができる。 - その全てに沿って頭をカバーするためにスパチュラでトランスデューサ先端に自由に超音波ゲルを適用します。慎重に針を鞘から抜くと針を直接変換器の下と可視化のための超音波ゲル内に針を前進させるためにコントロールをマウントしてください。針、針が超音波画像上でその長さに沿って明確に可視化されるように制御をマウントを使用して微調整を行います。トランスデューサが適切にステップ1.4において、針に平行に整列された場合は、前進及び噴射制御ノブ（ 図1C）に引き出されるように、次いで、針は、撮像面内にとどまるべきである。
- その後の工程では、必要性を乱すことがありません横軸のいずれかに移動させることにより、LE /トランスデューサ水平方向の配置。むしろ、マウント針の垂直（y軸）の位置を変更することにより、動物のプラットフォームを移動させることにより、注射用心臓の特定の領域を標的とする。
- 動物プラットフォームに、麻酔したマウスのその後の配置を可能にするためにスキャン高さ制御（ 図1B）を用いて動物プラットフォームから上方にトランスデューサを移動します。これは、針の長軸にトランスデューサのx軸の位置合わせは中断されません。
- シリンジクランプから位置合わせに使用した注射器を取り外し、慎重に捨てる。シリンジチップにデッドスペースを可能にし、最終的なターゲットボリュームへの注入物を使用して新しい針と注射器をロードします。気泡を除去するように注意してください。そのx軸アライメントを調整することなく、シリンジクランプに注射器を置きます。完全噴射制御を使用して注射器を後退させる。
注：初期トレーニングのために、エバンスブルーの使用染料（1％）、トリパンブルー染色（0.4％）、または注入液のような蛍光マイクロスフェアの懸濁液をコンピテンシーと目標と注射の成功を確認したオペレータを支援することができます。
2インジェクション
- 加熱プラットフォームの統合ウォーマーの電源を入れ、37℃のためにそれを設定してください。麻酔ホースクランプ、オペレータに最も近い動物の頭で、通常の画像形成の向きから、動物のプラットホームを180°に配置します。これは（胸の左側にある）の心は、シリンジクランプと針と同側にすることができます。注：動物プラットフォームに追加のマイナー時計回りの回転調整は注射（ 図2A）のために使用される胸骨傍短軸像面に対して正しく心を配向する必要があるかもしれない。
- 以前に9を報告したように心エコー検査のためにマウスを準備します。 2％のイソフルランで誘導チャンバ内でマウスを麻酔。脱毛クリームのANと胸毛を削除する強膜の乾燥を防ぐために両眼にゲルを適用する潤滑dは。
- スキャンヘッド高さ制御（ 図1B）を使用して、変換器を持ち上げます。 1〜3％イソフルラン（ 図2A-2B）を配信ノーズコーン内の鼻で加熱動物プラットフォームの上に、麻酔したマウスの仰臥位を置きます。ゆっくりと直腸プローブを挿入し、電気的に接触するための電極ゲルを適用し、ECG電極に4本の足をテープで固定します。
注：麻酔の適切なレベルは、動物の人道的な扱いのために確保されなければならない。心拍数に変化し、胸壁を通して針の配置に無応答でなければなりません。低体温症は相対徐脈、心室拡張、および可能な不快感になりますように、動物のプラットフォームの統合された恒常性、温度コントロールは、正常体温（37±0.5℃）を維持するために使用されるべきである。 - マウスは、動物のプラットフォーム上で安全であると、depila上にトランスデューサを下げるテッド胸部スキャンヘッド高さ制御（ 図1B）を使用して。心臓が標準の心エコー手法に従って、胸骨傍短軸方向で可視化されるために、注射のための最適な超音波のセットアップがある。を20-30°動物プラットフォームを回転させるには短軸像面内の注入のための最適な音響窓（ 図2A-2B）を得るために時計回り。注：あるいは、注入は、動物のプラットフォーム（ 図2C）の反時計回りの回転によって胸骨傍長軸の向きから行うことができる。
- 視野を調整するために、左心室の心筋内の任意の所望の注射部位を標的とする動物プラットフォーム調整コントロールを使用する。左心室の心筋（ 図3A-3C）内の所望の噴射位置を標的とするために、心臓のベース頂部から前後パン。注：midpapillary胸骨傍短軸（ 図3A）が reproduciblを提供しています注射部位のフォローイメージングを可能にする電子ランドマーク。注意：代替的に、胸骨傍長軸ビューは、事前定義された注入部位（ 図3D）を標的化するために使用することができる。
- 完全に後退したシリンジクランプで注射器から始めて、ゆっくりと噴射制御を時計回り（ 図4A）を回して、動物の胸に向けて注射器を前進させる。それは胸に近づくにつれて、心臓と針の先端の両方の明確な超音波可視化を可能にするには、胸の左側の上に超音波ゲルをたっぷり使用し、心エコーコントロールで広い視野を設定することで、音響窓を最適化します。注射のための標的部位での焦点/ゾーンを設定します。針の微調整は、コントロールは、その長さに沿って針の画像を最適化することができますマウント。
注：一部の超音波装置は、デジタルターゲット心筋へ通る針の長軸に沿った線を延長するニードルガイドソフトウェア機能を有している（ 図4B）。このようなソフトウェアツールが役立ちますが、必須ではないことができます。 - 動物は適切に鎮静させて、慎重に全くベベル針の先端の位置を観察し、マウスの胸壁を通って心筋に針を前進させる（1〜3％イソフルラン0.5〜0.8 L /分で100％酸素と混合）回。針の先端がターゲット心筋（ 図4C）内にあるときに前進を停止する。全体ベベル先端が心膜腔に注入液漏れを避けるために、しっかりと心筋内になければならない。
- 先端が目的の位置にあるとき、シリンジプランジャを押すことにより、注入物をお届けします。 5-30秒かけて、ゆっくりと注入液を配信（音量に応じて配信されている）。注入液を50μlまでの心室機能を損なうことなく送達することができる。注入された心筋領域への過渡echobright外観が成功し、注射後明らかであろう。相対bradycardの簡単な（秒）の期間iaが時折心筋への注入に留意し、迅速に解決されている。
- 注入液を投与された後、速やかに噴射制御ノブの反時計回りの回転によって針を引き抜く。マウスは保存心室機能なしpostprocedural合併症を確認するために、心エコー観察の数分間麻酔下で維持されるべきである。示された場合は、心筋の複数の領域を連続動物プラットフォームの調整によってアプローチの針の角度の再配置によって注入することができる。心筋内注射後、マウスは、それ自身のケージに入れ、観察下に麻酔から回復させる。
- それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまでは無人の動物を放置しないでください。完全に回復するまで、他の動物の会社に心筋内注射を受けた動物を返さないでください。ケージは、再を恒温パッド上に配置する必要があります水とマウスの食事のADY規定。 Postprocedural不快感が期待されておらず、障害が適切に（説明を参照）介入は潜在的な合併症を示唆した直後に通常の動作を再開すること。
- 慎重に作業者や近くに鋭利器材損傷のリスクを最小限に抑えるために、すぐに心筋内注入が完了した後に針を捨てる。針を再利用することをより困難な心筋を貫通するようになっ先端の鈍化や合併症のリスクが高い、その結果をもたらす可能性がある。
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Representative Results
青色染料または蛍光マイクロスフェアとマウス心筋内注射
エバンスブルー色素の注入は、トレーニング目的のために有用である。すぐに注射した後、注入された青色色素の位置を可視化するために、マウスを安楽死させると心臓を取り外します。 図5は、青色色素半ば乳頭筋レベル（ 図5A、囲まれた領域での心筋浸潤して、成功した注入の例を示してい）点線による。エバンスブルー色素は、数時間以内に組織から洗い流されます。注射部位のマーキングより恒久的には、注射部位に無期限にとどまる蛍光ミクロスフェアを使用することができる。 図5C〜5Fは、前方および後方左心室壁内の複数の噴射目標を示している。
心筋にアデノウイルス注射
超音波ガイドによって心筋へのアデノウイルスのデリバリーを可視化するためにD注入は、私たちは、哺乳動物のコドン最適化のCre 11のアデノウイルス心筋細胞特異的なラットトロポニンTプロモーターにおける10ドライブ式を注入した。 Cre介在組換えのドメインは、Cre組換えが赤色蛍光タンパク質（RFP）を消灯し、緑色蛍光タンパク質（GFP）をオンにしたRosa26遺伝子mTmGマウスを用いて決定した。 50μlのウイルス（2.8×10 9感染単位/ ml）を単回注射は、地域の注射の7日間（ 図6）内のGFP発現を活性化した。注射の最初の部位を超え組織平面に沿っていくつかの局所心筋浸潤が区分された画像では認識されている。
図1：超音波ガイド下注入のセットアップ。統合された鉄道システムのA）の概要、許可注射器や超音波走査ヘッドのsの整列。B）超音波走査ヘッドを制御します。走査ヘッドは、注射器に合わせ、位置にロックされる。視野は、動物のプラットフォームを移動させることによって調整される。C）注射シリンジを制御する。
超音波ガイド下針注射のための動物のプラットフォーム上でマウスの2最適な位置図。短軸撮像面からの心筋内注射のための動物のプラットフォーム、針と、変換器のA）のオリエンテーション。B）。超音波ゲルの寛大な量を通して見ると、トランスデューサの視野の下に針のパスクローズアップそれは胸腔内に通過する際に。C）心筋内麟蹄のための動物のプラットフォーム、針の向きとトランスデューサ胸骨傍長軸撮像面におけるction。
胸骨傍の短軸と長軸の平面内に標的化するために、心筋の3代表的な超音波画像を図。 AC）乳頭筋の下に中間乳頭筋（A）のレベルでの左心室の短軸像、 （B）及び心尖 前方左心室壁における心筋内注射を示す（C）。D）長軸像。矢印は、針軸の位置を強調表示します。
4。代表的な2D心エコー画像を図。 A） 。B）ニードルガイド·オーバーレイ機能は、針の長軸に沿って整列し、前部心筋を通してコース（緑色の点線）を予測する。C）心筋に注入前方心筋壁内に埋め込ま針のベベルを持つ。
エバンスブルー色素や蛍光マイクロスフェアで注射部位のマーキング図5。前壁壁に青色色素の心筋内注入。A）midpapillary筋肉のレベルでの心臓の横断面、染料30分の浸潤の後を実証に心筋内配信左心室。B）心筋の左側面。C、D）マウス心筋7日前方および後方左心室の壁。E、F）左で別の心筋内注入後の赤色蛍光マイクロビーズを実証する上で針から目に見える穿刺部位赤色蛍光マイクロビーズの心を実証沈着の横断面内に半ば乳頭筋で切片心室筋。切断面に散らばっマイクロビーズの間にナイフの刃で心を切断した後にバッファに分散する予定だった。
図6 TNT-ICREの単一心筋内注射後のRosa26 mTmG心臓の前方心筋壁の蛍光標識アデノウイルス。 7日、地域のアデノウイルス注射後のマウス心臓全体の前壁のA）の光学顕微鏡。B）蛍光画像（EGFP）でのアデノウイルスベクター。C、D）の横断面で落札配信と心筋の形質導入を実証同じ心臓内の半ば乳頭筋レベル、アデノウイルスの単一の心筋内注射（2.8×10 9感染単位/ mlの50μlの）から、地域のトランスフェクションの程度を示す。
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Discussion
生物製剤は、血流を介して、直接心筋内注射、心膜内注射、または間接的な投与により心筋に送達することができる。心筋梗塞モデルにおける最近の細胞ベースの治療試験は、注入物12〜14の配信に開放開胸アプローチを記載している。心筋治療的介入の成功の重要な要因は、配信経路の選択にかかっている。生物学の最も高い局所的投与量は、心筋内デリバリー15,16によって達成される。直接可視化の下で心筋注射が最も簡単な方法であり、心筋17内にターゲットを絞った管理が可能になります。それは、ターゲット心筋18を露出させるために胸腔および心膜の開口を必要とするが、この方法は、また、最も侵襲的である。そのようなその背面などの心臓の部分は、容易に可視化し、この方法を使用して注入されない。 PROCEDの侵襲性UREはまた、潜在的な治療投与スケジュールを抑制します。ここでは、外科的開胸暴露の罹患率や制約なしに、経皮的心筋内注射することにより、安全に超音波の指導の下で生物製剤または薬物を送達することは技術的に、簡単で信頼性と再現技術が記載されている。最初の技術的な能力が得られた後につ以下の心筋部位は、任意の一時点で標的とされたときの日付に注入された150以上のマウスでは、私たちの周術期死亡率は5％以下であった。最大200μlの総注入液量は驚くほどよくネズミの心臓によって許容された。前方心筋は、針がより確実に心臓の筋肉に残すこと、針の長軸に心筋のこの領域の平行配向を考えると、注射のための標的としてよく適している。これは麟蹄の完全な配信を保証するように、オペレータは、注射前に心筋全体面取り先端を視覚化することが重要です周囲の組織への漏れなしでctate。心筋も成功心筋の注射のために重要である内針の先端が常に表示されたまま確実にするためにお手入れ。エバンスブルー染料で実施する場合、心室腔への不注意な注射は、マウスが急速に脱毛肌に見える最も明確に青の色相を開発することになります。これは、胸壁を介して針挿入は、単にマウスのいずれかの表面解剖学的ランドマークによって目的の標的心筋の表示ではなく、超音波画像によって決定されることも注目に値する。経験豊富なechocardiographerのために、心筋内注入におけるコンピテンシーは、合理的に4-5での試みを実践した後に達成することができます。
針が胸壁を通過すると、それは肋間隙を通過しなければならない。これは、ビュー内で明確にベベル先端部を維持するために、一度肋間空間を通して撮像面に微調整を加える必要が珍しくありません。のTh通常、動物のプラットフォームや注射器のコントロールの微調整によって達成されるている。針が胸郭を通して、それが繰り返さ針の先端操作から心筋の裂傷や外傷を防止するために、心筋に経過する前にしたらマイナーな修正が行われる必要があります。心膜血腫の危険性を最小限に抑えるために、その目的は、注入物の配信を完了するために必要なように何回かのように心を入力するようにする必要があります。記載された技術は、心臓の短軸面内の心筋内注射のためであるが、この平面（ 図2C）と方向転換と整列するように、動物のプラットフォームの単純な調整によって、心臓の胸骨傍長軸面内に注入することも同様に可能である針は、心筋の意図したターゲット（ 図3D）を入力します。
成功した心筋内注射は、即時病的examinat続い指示色素を用いて確認することができ注入されたマウスの心臓のイオン。蛍光マイクロスフェアの懸濁液の注射は、注射部位に無期限に残り、対象地域をマークする別の薬剤と同時に投与することができた。マウスを制度的動物取扱プロトコルごとの訓練を受けた者が吸入二酸化炭素を用いて安楽死させている。心臓表面の検査は、注入された地域を明らかにし、心マトリックスと心をスライスすると、注入された地域のデモンストレーションを行います断面を得られます。同じ心筋領域の反復注射および/または画像が時間とともに所望される場合には、標準的な撮像面を使用し、再現可能な解剖学的目印を標的とすることが有利で。例えば、midpapillary筋レベル（ 図3A）における左心室を標的とする短軸撮像面を使用するのが便利である。最も深刻な潜在的な合併症は、心筋裂傷/破裂およびその結果としての出血および/または心膜血腫である。番目の危険性マウス（15グラム以下）を繰り返し心筋を通して針（4以上）の通過する際に、流体ボーラスの急速注入、鈍い針の先端を再利用し、より小さなマウスの使用による合併症が増加している。心筋内の複数のターゲットが（前壁、側壁または下壁）に直列に注入される場合には、処置合併症の危険性を最小限にするために心筋を介して3つのパスまたは針未満でこれを達成するために最適である。それらが互いに平行に整列するように、左心室心筋の側壁は、胸壁を通る針のワンパス（ 図5E及び5F）と同時に噴射することができるが、他の心筋壁ターゲットが通る針の再挿入を必要とする針の角度調整後胸壁。マウスは、拡張末期容積を増大させ、大幅に心筋壁の厚さを減少させることができる（毎分400拍以下）徐脈としてoversedatedべきではありません。私たちのマウスは急速に手順から回復すると麻酔からの回復の数分以内に彼らのケージ内で歩き回るするの経験がある。彼らは、発生する突然のであり、介入の際に発生した合併症、。
このプロトコルは心筋内注射のために書かれていますが、最終的に針の先端位置のわずかな変更は、オペレータが薬剤の全身の動脈送達のための左心室腔の血流に注入をターゲットにすることができます。シリンジプランジャに戻って引っ張るとベベル先端が左心室（吸引、酸素を豊富に含む血液）や心筋の筋肉量にあるかどうかを確認することができます。今日の高度に効率的で臓器特異的ウイルスベクター、心臓特異的プロモーターと特異的アデノ随伴ウイルス血清型9ベクターを使用すると、研究者は後眼窩したり、尾静脈注射を高の確実な送達を達成する代替手段として、この手法を適応することができます冠状動脈へのウイルス負荷肝臓による減少した初回通過吸収の循環。慢性postinfarctマウスモデルでは、瘢痕および線維心筋は、オペレータが内針の先端を埋める必要があり、得られた薄壁のターゲット指定された心筋内注射によく向いていてもよいが、心筋の境界域領域が心筋内注入とに従順であるべき開胸後の音響窓が成功した超音波ガイダンスのために十分すぎるほどである。
動物モデルにおける心筋内注射は、心筋への配達生物剤に忍容性が良好、効率的な低侵襲性、および技術的に簡単な方法を示して、超音波ガイド下。この技術は、容易に先立ってオープン開胸手順の後を含め、マウスモデルにおける実験的な任意の時点で遺伝子ベクターまたは細胞ベースの治療の成功の送達のために使用することができる。機器や注入手順に精通し、能力を獲得します実験モデルにおいて、その後の成功を確実にする。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vevo 2100 ultrasound imaging system | Visualsonics | ||
| Vevo Integrated Rail System III | Visualsonics | ||
| Microscan MS400 transducer | Visualsonics | ||
| Microscan MS550D transducer | Visualsonics | ||
| PrecisionGlide needles | BD | 305128 | 30 G x 1 in/2.5 cm |
| 1 cc slip tip syringe | Exel International | 26048 | or equivalent |
| Gastight 50 μl glass syringes | Hamilton | 1705 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250 | or equivalent |
| Isoflurane | Baxter | AHN3640 | or equivalent |
| Aquasonic 100 | Parker Laboratories | (01-08) | or equivalent |
| Polystyrene microspheres (red fluorescent) | Life Technologies | F-8842 | or equivalent |
References
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