Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Mesure des niveaux Heme synthèse dans des cellules de mammifères

Published: July 9, 2015 doi: 10.3791/51579
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular and Cell Biology, Center for Systems Biology, University of Texas at Dallas

Abstract

Heme sert de groupe prosthétique pour une grande variété de protéines connues comme les hémoprotéines telles que l'hémoglobine, la myoglobine et cytochromes. Elle est impliquée dans divers processus cellulaires et moléculaires, tels que la transcription génique, la traduction, la différenciation cellulaire et la prolifération cellulaire. Les niveaux de la biosynthèse de l'hème varient selon les différents tissus et types de cellules et est altérée dans des conditions pathologiques telles que l'anémie, la neuropathie et le cancer. Cette technique utilise [4- 14 C] de l'acide 5-aminolévulinique ([14 C] 5-ALA), l'un des premiers précurseurs de la voie de biosynthèse de l'hème pour mesurer les niveaux de synthèse de l'hème dans les cellules de mammifères. Ce test implique l'incubation des cellules avec [14 C] 5-ALA suivie d'une extraction de l'hème et de la mesure de la radioactivité incorporée dans l'hème. Cette procédure est précise et rapide. Cette méthode permet de mesurer les niveaux relatifs de biosynthèse de l'hème, plutôt que la teneur totale de l'hème. Pour démontrer l'utilisation de ce technIQUE les niveaux de biosynthèse de l'hème ont été mesurés dans plusieurs lignées de cellules de mammifères.

Introduction

L'hème, un complexe de fer ferreux et la protoporphyrine IX est une molécule central pour le transport et l'utilisation de l'oxygène dans pratiquement tous les organismes vivants 1-3. La structure unique de l'hème lui permet de fonctionner en tant que transporteur de gaz et des électrons diatomiques, ainsi que pour effectuer diverses autres fonctions 1-5. Par exemple, l'hème se lie à l'oxygène de l'hémoglobine et de la myoglobine pour le transfert et le stockage de 6,7 à oxygène. Il fonctionne aussi comme un porteur d'électrons dans les cytochromes pendant la respiration et agit comme un donneur d'électrons pour des réactions catalysées par des enzymes d'oxydo-réduction du cytochrome P450 8,9. L'une des caractéristiques les plus importantes de l'hème est que, il peut jouer un rôle de régulation dans les processus cellulaires et moléculaires, tels que la transcription des gènes, la synthèse des protéines et de micro-ARN biogenèse 4. Par exemple, elle affecte la transcription de nombreux gènes en contrôlant l'activité de répresseur de la transcription de mammifère et la rec Bach1 nucléaire mammifèreeptor Rev-erbα 10-15. L'hème régule l'activation de la protéine activatrice de l'hème (Hap) 1 qui joue un rôle important dans l'activation de gènes impliqués dans la respiration et de contrôle des dommages oxydatifs, en réponse à l'hème ou de l'oxygène 16. Heme réglemente également la transcription des gènes dans les cellules neuronales par le facteur de croissance des nerfs (NGF) de signalisation 3,17-20. Elle régule également la synthèse des protéines dans les cellules érythroïdes de mammifère en modulant l'activité de l'hème-kinase régulée eIF2α (HRI) 21-24. En outre, l'hème affecte l'activité de protéines de signalisation clés tels que la tyrosine kinase Src et Jak2, qui sont essentiels pour le fonctionnement des cellules et 4,20,25 de la croissance cellulaire. On a constaté que dans les cellules HeLa inhibition de l'hème provoque l'arrêt du cycle cellulaire et l'activation des marqueurs associés à la sénescence et l'apoptose 26. Les deux Heme carence ou des niveaux accrus de l'hème sont associés à des effets graves sur la santé chez les humains 27. Une moléculaire récentend études épidémiologiques ont montré une association positive de l'apport élevé en hème et un risque accru de maladies, comme le diabète de type 2, les maladies coronariennes et plusieurs cancers dont le cancer du poumon, le cancer colorectal et le cancer du pancréas 27,28. Utilisation d'une paire appariée de laboratoire cellules pulmonaires normales et cancéreuses auteurs ont constaté que les cellules cancéreuses ont augmenté les niveaux de consommation d'oxygène, la synthèse de l'hème et des protéines impliquées dans l'absorption de l'hème et de l'oxygène 28 utilisation. Chose intéressante, l'inhibition de la synthèse de l'hème diminution de la consommation d'oxygène, la prolifération, la migration et la formation des colonies de cellules 28 cancéreuses. Ainsi, la fluctuation des niveaux d'hème endogène joue un rôle important dans la régulation des processus moléculaires et cellulaires 3,4,28,29.

Chez les mammifères, la biosynthèse de l'hème se produit en huit étapes, faisant intervenir des enzymes situées dans les mitochondries et le cytosol 4 (figure 1). Heme biosynthèse commence dans la matrice de la mitochondrie avec la condensation de glycine et de succinyl-CoA pour former l'acide 5-aminolévulinique (5-ALA), catalysée par ALA synthase (ALAS) 4,31. Ceci est le taux étape de biosynthèse de l'hème dans les cellules nonerythroid limitant. 5-ALA est ensuite exporté vers le cytosol où les quatre étapes suivantes se produisent pour former coproporphyrinogène III (CPgenIII), qui est ensuite importé retour à la mitochondrie, où il est transformé en protoporphyrine IX (PpIX). Enfin, une molécule de fer est incorporé à la protoporphyrine IX (PpIX) pour produire de l'hème, une réaction catalysée par ferrochélatase (FECH) 2,4.

Le niveau de biosynthèse de l'hème dépend principalement sur ​​le niveau de ALAS enzyme qui est étroitement contrôlée par le fer intracellulaire et 4 de l'hème. La biosynthèse de l'hème peut être affectée par des défauts génétiques, la disponibilité de certains minéraux et des vitamines (par exemple, la riboflavine, zinc), l'exposition à des toxines (par exemple, l'aluminium, le plomb), Anoxie, de la fièvre, et des niveaux de certains stéroïdes (par exemple, l'œstrogène) 32-35. Le niveau de synthèse de l'hème est modifié dans diverses conditions pathologiques. Diminution de la biosynthèse de l'hème peut causer l'anémie ainsi que les maladies neurologiques 3,36. En variante, l'augmentation de la biosynthèse de l'hème joue un rôle important dans la progression de certains cancers 28,37. L'hème a été montré pour être critique pour la croissance, la différenciation et la survie du tissu adipeux chez les mammifères, érythroïde et des cellules neuronales 4,38-41. Par exemple, une déficience de l'hème conduit à des lésions des neurites dans des neurones corticaux primaires de souris via l'inhibition de glutamate NMDA (N-méthyl-D-aspartate) 17 récepteur. En outre, l'inhibition de la synthèse de l'hème entraîne la mort cellulaire programmée dans le col épithéliale carcinome des cellules humaines HeLa 26,41. Par conséquent, en mesurant les niveaux de la biosynthèse de l'hème dans diverses cellules dans des conditions différentes est important pour l'étude de l'étiologie et progressisur de nombreuses maladies.

Nous décrivons ici une méthode rapide et sensible pour mesurer le niveau de synthèse de l'hème intracellulaire en utilisant [4- 14 C] acide 5-aminolevulic. Ceci est une méthode alternative à d'autres méthodes utilisant 55 Fe ou 59 Fe. Nous préférons utiliser 14 C parce que son rayonnement est très faible. En revanche, une forte protection est nécessaire pour travailler avec des isotopes Fe. En outre, cette méthode vise à mesurer et comparer la synthèse de l'hème dans des cellules différentes en parallèle d'une manière rapide. Afin de mesurer les niveaux de l'hème absolus, on peut utiliser la méthode précédemment établi impliquant l'utilisation de HPLC 42,43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ATTENTION: Tout en travaillant avec la radioactivité, prendre les précautions nécessaires pour éviter la contamination de l'expérimentateur et les environs. Éliminer tous les déchets hors suivant les directives de sécurité de rayonnement locales.

1. Préparation des cellules

  1. cellules de semences à 3,5 cm plaques telles que la confluence atteint 80% -90% sur le jour de l'analyse.
    1. A noter que pour le semis de confluence des cellules dépend du type de cellules et de leur taux de croissance. Lorsque le traitement des cellules avec un réactif pour un certain nombre de jours, ensemencer les cellules de sorte que la confluence est de 80% à 90% le jour de la mesure de l'hème. Si le nombre de cellules obtenu à partir de 3,5 cm plaques est insuffisante, utiliser des plaques de 6 cm avec même quantité d'ALA radioactif comme dans l'étape suivante.
      Remarque: Utilisez des assiettes individuelles est recommandée car elle est plus facile à manipuler des assiettes individuelles.
  2. Un jour avant la mesure de l'hème, ajouter 0,1-0,3 uCi de [14 C] 5-ALA ALA et froid pour atteindre une finale concentration de 20 um sur un total de ALA à chaque boîte de culture dans un accès de la zone de travail pour travailler avec des matières radioactives et de mettre les plaques de nouveau dans l'incubateur. Idéalement, incuber avec ALA radioactifs pendant 16 heures.
    Note: radiomarqué 5-ALA nécessaire peut varier entre des lignées cellulaires. Un comptage radioactif par minute (cpm) d'au moins 100 est nécessaire pour minimiser l'erreur associée à comptage. Il est conseillé de déterminer une quantité minimale de [14 C] 5-ALA requis pour les lignées de cellules étudiées. Pour la plupart des expériences 0,1-0,3 pCi est suffisante pour obtenir une bonne mesure. Ajout d'ALA froide est facultative.

2. Heme Extraction

  1. Placez les boîtes de culture de cellules sur la glace et les emmener à l'ajustement de la zone pour les travaux de la radioactivité.
    1. Effectuer toute extraction et processus d'évaporation sous une hotte anti-explosion. Parce que l'éther stockée peut exploser, utiliser l'éther dans de petites bouteilles et évaporer les liquides restants, ne pas stocker dans l'étherune bouteille ouverte depuis plus d'un mois. Ne pas utiliser d'acétone à proximité de flammes et de chauffe car il est hautement inflammable. acétone de magasin contenant des réactifs dans des bouteilles en verre comme il se dissout en matière plastique pour culture de tissus.
  2. Aspirer le milieu en utilisant une pipette. Laver les cellules une fois avec 1 ml de PBS 1x froid. Aspirer le PBS.
  3. Ajouter 1 ml de 1 x PBS froid sur les plaques et recueillir les cellules au fond de la plaque en utilisant une spatule en caoutchouc. Transférer les cellules recueillies à partir de chaque plaque à un pré-réfrigérés tube de 2 ml étiqueté. Recueillir toutes les cellules de tubes de 2 ml.
    Remarque: Utilisez une spatule en caoutchouc frais pour chaque plaque pour racler les cellules de chaque plaque. Pour chaque plaque vous auriez besoin de quatre tubes de 2 ml, un tube de 1,5 ml et un flacon de scintillation.
  4. Spin à 15.000 g pendant 1 min à 4 ° C.
  5. Sortez PBS aide d'une pipette, donner un bref essorage et enlever le PBS résiduelle. Resuspendre les cellules dans 100 ul de 1 x PBS. Vortex à remettre en suspension les cellules et de garder sur la glace.
  6. Prenez 10 &# 956; l à partir de l'étape 5 et le transfert à un tube de 1,5 ml et conserver dans la glace pour mesurer la concentration de protéine.
    Remarque: un tampon de lyse cellulaire doit être ajouté aux cellules et conservé sur de la glace pour mesurer la concentration de protéine par la suite.
  7. Faites tourner les 90 pi restants de l'étape 5 à 5000 g pendant 30 secondes à 4 ° C; retirer PBS complètement en utilisant une pointe de pipette 200 pi.
  8. Ajouter 300 pi de tampon d'extraction de l'hème (voir la liste des matériaux) à chaque tube. Puis vortex pendant 15 secondes pour mélanger et mettre sur la glace pendant 1 min, répéter cette 3 fois.
    1. Ajouter tampon d'extraction de l'hème (HEB) et vortex le tube rapidement à remettre le culot, le faire seulement un ou deux tubes à la fois parce que la pastille doit être remis en suspension rapidement sans être laissé dans le HEB pendant trop longtemps. Une fois HEB est ajouté à tous les tubes et le culot est remis en suspension puis suivre le tourbillon de 15 sec et 1 min sur le cycle de la glace comme à l'étape 8. Notez que granulés ne peut pas aller complètement dans la HEB si le culot est laissé dans la mémoire tampon HEB pour un plus longtemps et ne pas remises en suspension rapidement.
  9. Ajouter 1,2 ml d'éther diéthylique à chaque tube et vortexer pendant 30 secondes. Spin à 15.000 g pendant 5 min à 4 ° C.
    Remarque: l'éther de diéthyle est à court de pointes de pipette rapidement. Pour contrôler cela, l'éther diéthylique pipette de haut en bas une fois ou deux fois, faisant aide à maintenir l'éther diéthylique à la pipette. Répétez cette chaque fois une pointe de pipette frais est utilisé.
  10. Top (éther) en phase de transfert avec pipette de 1 ml à un nouveau tube. Ajouter 0,5 ml de HCl, de vortex de mélanger et de spin 2 comme à l'étape 9.
    Remarque: Il est difficile de voir la séparation entre les phases éther et HCl. Par conséquent, ajouter de petites quantités de bleu Trypan en solution de HCl 2N pour être utilisé lors de l'expérience, assez pour lui donner une couleur bleu pâle. Cela vous aidera à distinguer les deux phases. La phase inférieure sera bleu et la phase d'éther supérieure sera incolore. Transférer la phase éther incolore supérieure dans un nouveau tube et jeter le HCl (bleu) phase inférieure.
  11. Répétez l'étape 10 de deuxplusieurs fois pour laver la phase éthérée avec du HCl 2. Transvaser seulement la phase d'éther supérieure dans un nouveau tube lors de chaque répétition et éliminer la phase HCl inférieure.
  12. Après le troisième lavage avec de l'HCl, transférer la phase supérieure avec une pipette ml dans un flacon à scintillation. Sécher les échantillons par evaporation de l'éther de diéthyle en maintenant les échantillons dans la hotte chimique O / N.

3. Mesure de la radioactivité

  1. Le jour suivant, ajouter 5 ml de fluide de scintillation pour les échantillons séchés provenant de l'étape 2.12.
  2. Bien agiter pour mélanger. Mesurer la radioactivité en utilisant un compteur à scintillation.

4. Calculs

  1. Lyse des cellules de l'étape 2.6 en utilisant des quantités égales de tampon CelLytic M (voir list des matériaux) et de spin à 14.000 g pendant 5 min à 4 ° C.
  2. Prélever une partie aliquote du surnageant et mesurer la concentration en protéine en utilisant le kit BCA Protein Assay.
    Quantité totale de protéine en mg (TP) = (90 * pi conc. De protéine dans81; g / ul) / 1000
    niveau de la synthèse de l'hème (radioactivité / TP) = pmol / mg de protéine.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cette méthode a été utilisée pour comparer les niveaux de synthèse de l'hème dans la normale (HBEC30KT) vs. cancer (HCC4017) les cellules pulmonaires. La figure 2 montre un niveau plus élevé de la synthèse de l'hème dans les cellules cancéreuses (de HCC4017) que les cellules pulmonaires normales (HBEC30KT). Le niveau de synthèse de l'hème a également été mesurée dans les cellules normales et cancéreuses en présence de cyanure de carbonyle découpleur 3-chlorophénylhydrazone mitochondrial (CCCP). Les cellules ont été traitées avec 10 uM de CCCP pendant 24 heures avant la mesure des taux de synthèse de l'hème. Comme attendu, les niveaux de synthèse de l'hème (figure 2) a diminué en présence de CCCP dans les cellules normales et cancéreuses. Il a été montré précédemment que la synthèse de l'hème peut être inhibée par succinyl acétone (SA), un inhibiteur puissant et spécifique de la déshydratase de l'acide 5-aminolévulinique (ALAD) qui est la deuxième enzyme hème biosynthétique dans la voie 41. En utilisant cette méthode, les taux de synthèse de l'hème ont été mesurés dans des cellules HeLa en présence et en absrence de 0,5 mM SA. La figure 3 montre que les niveaux de synthèse de l'hème a diminué de plus de 10 plis en présence de SA. Pour démontrer davantage l'utilisation de cette technique, les niveaux de synthèse de l'hème ont été mesurées et comparées à 4 cancer et dans des lignées de cellules HEK293T comme représenté sur la Figure 4.

Figure 1
Figure 1. La voie de biosynthèse de l'hème chez l'homme ALAS, 5-aminolévulinique synthase des acides. 5-ALA, l'acide 5-aminolévulinique; ALAD, ALA déshydratase; PBG, porphobilinogen; HMBS, hydroxyméthylbilane synthase; HMB, hydroxyméthylbilane; UROS, uroporphyrinogène III synthase; UPgenIII, uroporphyrinogène III; UROD, uroporphyrinogène décarboxylase; CPgenIII, coproporphyrinogène III; CPOX, coproporphyrinogène III oxydase; PPgenIX, protoporphyrinogène IX; PPOX, protoporphyrinogène IX oxydase; PPIX, Protoporphyrine IX; FECH, Ferrochélatase. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Les niveaux de biosynthèse de l'hème à la normale (HBEC30KT) et le cancer (HCC4017) lignées cellulaires, en absence et en présence de 10 uM mitochondrial découplant CCCP. Le niveau de fond était similaire au niveau de l'échantillon à blanc (liquide de scintillation seul) et il était inférieure à 2% de la commande. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Niveaux de biosynthèse de l'hème dans les cellules HeLa en absrence et en présence de 0,5 mM de l'inhibiteur de synthèse de l'hème succinyl acétone (SA). Les cellules ont été traitées avec SA pendant 3 jours avant la mesure de l'hème. Le niveau de fond était similaire au niveau de l'échantillon à blanc (liquide de scintillation seul) et elle était inférieure à 2% de la commande. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Comparaison des niveaux de biosynthèse de l'hème dans les quatre lignées de cellules cancéreuses et HEK293T. L'analyse a été effectuée selon le protocole. HCC4017 ont été cultivées dans ACL4 médias, A549 et H1395 dans RPMI 1640 supplémenté avec 5% de FBS, HEK293T et HeLa dans du DMEM supplémenté avec 10% de FBS. Pour l'analyse statistique, les niveaux de synthèse de l'hème dans les cellules cancéreuses et des cellules HEK293T ont été comparées au niveau de la synthèse de l'hème dans HCC4017 cellules, en utilisant Welch 2-échantillon test t. **, P value <0,005. Le niveau de fond était similaire au niveau de l'échantillon à blanc (liquide de scintillation seul) et elle était inférieure à 2% de la commande. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Heme joue un rôle clé dans la génération d'énergie par la respiration cellulaire 26. Altered métabolisme de l'hème est connue pour être associée à diverses maladies y compris le cancer 28,41. L'inhibition de la synthèse de l'hème est connu pour provoquer un arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose dans des cellules Hela 26,41. Il a été démontré que le niveau de synthèse de l'hème élevée est associée à la progression de cellules de cancer du poumon 28. Par conséquent, il serait d'une grande importance pour mesurer les niveaux de biosynthèse de l'hème dans les cellules dans des conditions différentes. Le procédé décrit ici ne pas quantifier la quantité totale d'hème par conséquent, il ne fournit pas la valeur absolue de l'hème présents dans les cellules. Il existe une variété de méthodes et kits colorimétriques disponibles pour mesurer les quantités totales de l'hème dans les cellules. Par exemple, l'hème peut être extrait à partir de cellules et les mitochondries dans un mélange d'acétone et mélangé avec du HCl et 50% (v / v) d'acétonitrile. Ensuite, le mélange peut être appliquésur une colonne C18 Bondclone 3,9 x 300 mm suivie d'une élution de l'hème dans un gradient d'acétonitrile contenant 0,05% (v / v) d'acide trifluoroacétique et l'identification de composés de l'hème à 400 nm 44,45.

Auparavant, pour mesurer les niveaux de biosynthèse de l'hème dans les tissus des mammifères et des extraits cellulaires [14 C] -glycine et de [14 C] 5- ALA ont été utilisés 46,47. Bien que la glycine marquée entre la voie de biosynthèse de l'hème lors de la première étape, mais elle est évacuée par d'autres voies métaboliques conduisant à son incorporation limitée en hème. Glycine est pas un métabolite spécifique pour biosynthèse de l'hème 48. D'autre part, 5-ALA marqué est spécifique de la voie de biosynthèse de l'hème. Cette caractéristique confère un avantage quantitatif de l'utilisation de 5-ALA plus glycine 46,48,49. Par conséquent, l'utilisation des déchets radioactifs 5-ALA est une méthode plus spécifique et précis pour mesurer et comparer les niveaux de biosynthèse de l'hème.

Les plupart des critical étapes pour obtenir des résultats cohérents sont: 1) assurer que la confluence cellulaire ne va pas supérieur à 100% et pas en dessous de 70% dans diverses conditions; 2) la quantité de radioactivité ajoutée par plaque doit être identique parce que cette méthode est très sensible; 3) un tampon d'extraction de l'hème ne doit pas être vieux, il est recommandé de faire frais à chaque fois. Le volume requis de radioactivité par plaque est très faible et il est difficile de maintenir les montants identiques à travers les échantillons. Par conséquent, il est recommandé de faire une solution de travail de titres dans le milieu de culture, si vous utilisez le même support pour tous les échantillons, d'autre PBS (tampon phosphate salin) peut être utilisé. Utilisation solution mère peut être préparée de telle manière que le volume distribué par plaque est en cours de 10 ul. Aussi, pour être plus précis, le milieu des échantillons répétés pour une condition peut être pris dans un tube de 50 ml et les quantités appropriées de la radioactivité peut être ajouté à partir de la solution de travail des stocks, puis distribuer retour eQual montants de support aux plaques. Si le nombre de cellules est limitée, par exemple dans des cultures primaires, les plaques à 12 puits ou à 24 puits peuvent être utilisées pour la culture des cellules et réduire la quantité de radioactivité ajoutée par puits proportionnellement.

Ce protocole est simple, simple, et fournit des mesures précises des niveaux de synthèse de l'hème. Parfois, il peut être difficile de remettre en suspension le culot cellulaire dans du tampon d'extraction de l'hème (étape 2.8) complètement. Pour éviter ce soit rapide à l'étape 2.8, ajouter un tampon d'extraction de l'hème à 1-2 échantillons à la fois, vortex et les mettre sur la glace. Assurez-vous que le tampon d'extraction de l'hème est pas trop vieux. Si l'écart type entre les échantillons répétés est trop élevé, prêter attention aux étapes suivantes: 1) PBS a été complètement supprimé à l'étape 2.7; 2) éviter de renverser l'échantillon lorsqu'il est en phase d'éther de diéthyle, suivez la pointe dans l'étape 2.9; 3) assurer que la radioactivité ajoutée par plaque et la confluence des échantillons répétés étaient les mêmes.

28 dans des conditions normales non maligne (HBEC) vs. cancer (HCC), mis au point des cellules provenant du même patient. La technique décrite ici nécessite l'utilisation de [14 C] 5-ALA, un précurseur en voie de biosynthèse de l'hème (Figure 1), et mesure la radioactivité incorporée dans l'hème. Dans cette technique, y compris les porphyrines, l'hème, ont été extraits à partir des cellules dans un mélange d'acétone, de HCl concentré et de l'eau 50,51. L'hème est séparé de porphyrines en outre par l'extraction dans de l'éther diéthylique et on lave la phase éther avec du HCl 2 N 50,51. Ensuite, la radioactivité incorporée dans l'hème a été déterminée en utilisant un compteur à scintillation. Les résultats peuvent être normalisées par la quantité totale de protéine ou un numéro de cellule. la synthèse de l'hème dans les cellules HeLa a été inhibé à l'aide de succinyl acétone (SA) et une diminution du taux de synthèse de l'hème a été observé comme indiqué préprécédemment 26 (figure 3).

Cette méthode est très utile pour la comparaison des niveaux de synthèse de l'hème, dans des conditions différentes ou entre des lignées cellulaires (figure 4). Il nécessite un petit nombre de cellules et permet la mesure et la comparaison des niveaux de synthèse de l'hème spécifique dans des cellules différentes. Elle ne vise pas à la mesure précise des niveaux absolus de l'hème dans les cellules. Il est surtout utilisé pour comparer les niveaux de synthèse de l'hème dans les cellules ayant des propriétés différentes, telles que les cellules cancéreuses différentes. Étant donné que le cobalt, au lieu de fer, peut être incorporé dans l'hème dans la dernière étape de la synthèse de l'hème et être extraite 51, cette méthode peut ne pas donner comparaison précise de la synthèse de l'hème, si les milieux de culture contiennent des niveaux différents de cobalt ou d'autres ions métalliques. Néanmoins, la voie de synthèse de l'hème à partir d'acide 5-aminolévulinique de porphyrines et l'hème est très spécifique, la mesure des taux de flux de l'ensemble pathway est susceptible d'être plus réfléchissante des activités métaboliques pertinentes à l'hème, quelles que soient les ions métalliques. En revanche, le procédé utilisant 59 Fe détecte uniquement la partie de la voie incorporant l'hème pour former Fe 52. Bien que cela soit plus spécifique, en présence de taux significatifs d'ions métalliques, les niveaux de synthèse de l'hème détectés peuvent ne pas refléter le potentiel métabolique de certaines cellules telles que des cellules cancéreuses. En outre, Fe peut être séquestré dans d'autres endroits cellulaires côté mitochondries faire hème. En gros, nous croyons que l'utilisation de [4- 14 C] 5-ALA est une méthode plus pratique pour mesurer les niveaux de l'hème lorsque l'on compare les différentes cellules avec des propriétés différentes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Nous avons rien à révéler.

Acknowledgments

Les lignées cellulaires HCC4017 et HBEC30KT ont été gracieusement fournis par le laboratoire du Dr John Minna. Ce travail a été soutenu par les fonds Cecil H. et Ida Verts au Dr Li Zhang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma 650501
Diethy ether Sigma 296082
HCl (Hydrochloric acid) Fisher A481-212
Liquid Scintillation cocktail  MP Biomedicals 882470
Trypan blue Gibco 15250
Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid Perkin-Elmer life sciences Store at -80 °C
CelLytic M Sigma C2978 Mammalian cell lysis reagent
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Scientific 23227
Specific reagent Component Dispense
Heme extraction buffer:
Acetone:HCl:Water (25:1.3:5)		 Acetone
Concentrated HCl
Water		 25 ml
1.3 ml
5 ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Furuyama, K., Kaneko, K., Vargas, P. D. Heme as a magnificent molecule with multiple missions: heme determines its own fate and governs cellular homeostasis. Tohoku J Exp Med. 213, 1-16 (2007).
  2. Hamza, I., Dailey, H. A. One ring to rule them all: trafficking of heme and heme synthesis intermediates in the metazoans. Biochim Biophys Acta. 1823, 1617-1632 (2012).
  3. Zhu, Y., Hon, T., Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency interferes with the Ras-mitogen-activated protein kinase signaling pathway and expression of a subset of neuronal genes. Cell Growth Differ. 13, 431-439 (2002).
  4. Zhang, L. HEME BIOLOGY: The Secret Life of Heme in Regulating Diverse Biological Processes. Singapore: World Scientific Publishing Company. , (2011).
  5. Mense, S. M., Zhang, L. Heme: a versatile signaling molecule controlling the activities of diverse regulators ranging from transcription factors to MAP kinases. Cell Res. 16, 681-692 (2006).
  6. Ingram, D. J., Kendrew, J. C. Orientation of the haem group in myoglobin and its relation to the polypeptide chain direction. Nature. 178, 905-906 (1956).
  7. Perutz, M. F. X-ray analysis of hemoglobin. Science. 140, 863-869 (1963).
  8. Chance, B. The nature of electron transfer and energy coupling reactions. FEBS Lett. 23, 3-20 (1972).
  9. Guengerich, F. P., MacDonald, T. L. Mechanisms of cytochrome P-450 catalysis. Faseb J. 4, 2453-2459 (1990).
  10. Igarashi, K., et al. Multivalent DNA binding complex generated by small Maf and Bach1 as a possible biochemical basis for beta-globin locus control region complex. J Biol Chem. 273, 11783-11790 (1998).
  11. Ogawa, K., et al. Heme mediates derepression of Maf recognition element through direct binding to transcription repressor Bach1. Embo J. 20, 2835-2843 (2001).
  12. Oyake, T., et al. Bach proteins belong to a novel family of BTB-basic leucine zipper transcription factors that interact with MafK and regulate transcription through the NF-E2 site. Mol Cell Biol. 16, 6083-6095 (1996).
  13. Snyder, S. H., Jaffrey, S. R., Zakhary, R. Nitric oxide and carbon monoxide: parallel roles as neural messengers. Brain Res Brain Res Rev. 26, 167-175 (1998).
  14. Sun, J., et al. Hemoprotein Bach1 regulates enhancer availability of heme oxygenase-1 gene. Embo J. 21, 5216-5224 (2002).
  15. Zhang, L., Guarente, L. Heme binds to a short sequence that serves a regulatory function in diverse proteins. Embo J. 14, 313-320 (1995).
  16. Hon, T., Lee, H. C., Hu, Z., Iyer, V. R., Zhang, L. The heme activator protein Hap1 represses transcription by a heme-independent mechanism in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 169, 1343-1352 (2005).
  17. Chernova, T., et al. Neurite degeneration induced by heme deficiency mediated via inhibition of NMDA receptor-dependent extracellular signal-regulated kinase 1/2 activation. J Neurosci. 27, 8475-8485 (2007).
  18. Chernova, T., et al. Early failure of N-methyl-D-aspartate receptors and deficient spine formation induced by reduction of regulatory heme in neurons. Mol Pharmacol. 79, 844-854 (2011).
  19. Sengupta, A., Hon, T., Zhang, L. Heme deficiency suppresses the expression of key neuronal genes and causes neuronal cell death. Brain Res Mol Brain Res. 137, 23-30 (2005).
  20. Smith, A. G., Raven, E. L., Chernova, T. The regulatory role of heme in neurons. Metallomics. 3, 955-962 (2011).
  21. Raghuram, S., et al. Identification of heme as the ligand for the orphan nuclear receptors REV-ERBalpha and REV-ERBbeta. Nat Struct Mol Biol. 14, 1207-1213 (2007).
  22. Wu, N., Yin, L., Hanniman, E. A., Joshi, S., Lazar, M. A. Negative feedback maintenance of heme homeostasis by its receptor Rev-erbalpha. Genes Dev. 23, 2201-2209 (2009).
  23. Yin, L., et al. Rev-erbalpha, a heme sensor that coordinates metabolic and circadian pathways. Science. 318, 1786-1789 (2007).
  24. Zhu, Y., Hon, T., Zhang, L. Heme initiates changes in the expression of a wide array of genes during the early erythroid differentiation stage. Biochemical and biophysical research communications. 258, 87-93 (1999).
  25. Yao, X., Balamurugan, P., Arvey, A., Leslie, C., Zhang, L. Heme controls the regulation of protein tyrosine kinases Jak2 and Src. Biochemical and biophysical research communications. 402, 30-35 (2010).
  26. Ye, W., Zhang, L. Heme controls the expression of cell cycle regulators and cell growth in HeLa cells. Biochem and biophys res comm. 315, 546-554 (2004).
  27. Hooda, J., Shah, A., Zhang, L. Heme, an essential nutrient from dietary proteins, critically impacts diverse physiological and pathological processes. Nutrients. 6, 1080-1102 (2014).
  28. Hooda, J., et al. Enhanced heme function and mitochondrial respiration promote the progression of lung cancer cells. PloS one. 8, e63402 (2013).
  29. Atamna, H., Walter, P. B., Ames, B. N. The role of heme and iron-sulfur clusters in mitochondrial biogenesis, maintenance, and decay with age. Arch Biochem Biophys. 397, 345-353 (2002).
  30. Atamna, H., Killilea, D. W., Killilea, A. N., Ames, B. N. Heme deficiency may be a factor in the mitochondrial and neuronal decay of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14807-14812 (2002).
  31. Ponka, P. Cell biology of heme. Am J Med Sci. 318, 241-256 (1999).
  32. Brawer, J. R., Naftolin, F., Martin, J., Sonnenschein, C. Effects of a single injection of estradiol valerate on the hypothalamic arcuate nucleus and on reproductive function in the female rat. Endocrinol. 103, 501-512 (1978).
  33. Daniell, W. E., et al. Environmental chemical exposures and disturbances of heme synthesis. Environ Health Perspect. 105, Suppl 1. 37-53 (1997).
  34. Kihara, T., et al. Hepatic heme metabolism in rats with fever induced by interleukin 1beta. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 104, 115-126 (1999).
  35. Vijayasarathy, C., Damle, S., Prabu, S. K., Otto, C. M., Avadhani, N. G. Adaptive changes in the expression of nuclear and mitochondrial encoded subunits of cytochrome c oxidase and the catalytic activity during hypoxia. Eur J Biochem. 270, 871-879 (2003).
  36. Anderson, K. E. S. S., Bishop, D. F., Desnick, R. J. Disorders of heme biosynthesis: X-linked sideroblastic anemia and the porphyrias. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. , The McGraw-Hill Companies, Inc. New York. 1-53 (2009).
  37. Salvo, M. L., Contestabile, R., Paiardini, A., Maras, B. Glycine consumption and mitochondrial serine hydroxymethyltransferase in cancer cells: the heme connection. Med Hypotheses. 80, 633-636 (2013).
  38. Ishii, D. N., Maniatis, G. M. Haemin promotes rapid neurite outgrowth in cultured mouse neuroblastoma cells. Nature. 274, 372-374 (1978).
  39. Padmanaban, G., Venkateswar, V., Rangarajan, P. N. Haem as a multifunctional regulator. Trends Biochem Sci. 14, 492-496 (1989).
  40. Rutherford, T. R., Clegg, J. B., Weatherall, D. J. K562 human leukaemic cells synthesise embryonic haemoglobin in response to haemin. Nature. 280, 164-165 (1979).
  41. Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency causes apoptosis but does not increase ROS generation in HeLa cells. Biochemical and biophysical research communications. 319, 1065-1071 (2004).
  42. Bonkovsky, H. L., et al. High-performance liquid chromatographic separation and quantitation of tetrapyrroles from biological materials. Anal Biochem. 155, 56-64 (1986).
  43. Sinclair, P. R., Gorman, N., Jacobs, J. M. Measurement of heme concentration. Curr Protoc Toxicol. 8, Unit 8.3 (2001).
  44. Barros, M. H., Carlson, C. G., Glerum, D. M., Tzagoloff, A. Involvement of mitochondrial ferredoxin and Cox15p in hydroxylation of heme O. FEBS Lett. 492, 133-138 (2001).
  45. Shinjyo, N., Kita, K. Up-regulation of heme biosynthesis during differentiation of Neuro2a cells. J Biochem. 139, 373-381 (2006).
  46. Israels, L. G., Yoda, B., Schacter, B. A. Heme binding and its possible significance in heme movement and availability in the cell. Ann N Y Acad Sci. 244, 651-661 (1975).
  47. Yannoni, C. Z., Robinson, S. H. Early-labelled haem in erythroid and hepatic cells. Nature. 258, 330-331 (1975).
  48. Robinson, S. H. Formation of bilirubin from erythroid and nonerythroid sources. Semin Hematol. 9, 43-53 (1972).
  49. Granick, S., Granick, D. Nucleolar necklaces in chick embryo myoblasts formed by lack of arginine. J Cell Biol. 51, 636-642 (1971).
  50. Morell, D. B., Barrett, J., Clezy, P. S. The prosthetic group of cytochrome oxidase. 1. Purification as porphyrin alpha and conversion into haemin alpha. Biochem J. 78, 793-797 (1961).
  51. Sinclair, P., Gibbs, A. H., Sinclair, J. F., de Matteis, F. Formation of cobalt protoporphyrin in the liver of rats. A mechanism for the inhibition of liver haem biosynthesis by inorganic cobalt. Biochem J. 178, 529-538 (1979).
  52. Chung, J., Haile, D. J., Wessling-Resnick, M. Copper-induced ferroportin-1 expression in J774 macrophages is associated with increased iron efflux. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 2700-2705 (2004).

Tags

Biologie Moléculaire Numéro 101 Heme le niveau de synthèse de l'hème des cellules de mammifères [4- le cancer
Mesure des niveaux Heme synthèse dans des cellules de mammifères
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hooda, J., Alam, M., Zhang, L.… More

Hooda, J., Alam, M., Zhang, L. Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (101), e51579, doi:10.3791/51579 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter