Abstract
Häm dient als prosthetische Gruppe für eine große Vielfalt von Proteinen als Hämoproteine, wie Hämoglobin, Myoglobin und Cytochrom bekannt. Es wird in verschiedenen molekularen und zellulären Prozessen wie Gentranskription, Translation, Zelldifferenzierung und Zellproliferation beteiligt. Die Biosynthese von Häm Stufen variieren in verschiedenen Geweben und Zelltypen und in Krankheitszuständen wie Anämie, Neuropathie und Krebs verändert. Diese Technik verwendet [4- 14 C] 5-Aminolävulinsäure ([14 C] 5-ALA), einer der ersten Vorstufen bei der Häm-Biosyntheseweg, das Niveau der Häm-Synthese in Säugetierzellen zu messen. Dieser Assay beinhaltet die Inkubation von Zellen, die mit [14 C] 5-ALA, gefolgt von Extraktion von Häm und die Messung der Radioaktivität in Häm inkorporiert. Diese Vorgehensweise ist präzise und schnell. Bei dieser Methode wird die relative Bedeutung der Häm-Biosynthese und nicht die Gesamt Häm-Gehalt. Um die Verwendung dieser techn demonstriereniQue das Niveau der Häm-Biosynthese wurden in mehreren Säugetierzelllinien gemessen.
Introduction
Häm, ein Komplex von Eisen und Protoporphyrin IX ist ein Zentralmolekül für den Transport und die Verwendung von Sauerstoff in praktisch allen lebenden Organismen 1-3. Die einzigartige Struktur der Häm ermöglicht es, als Träger von zweiatomigen Gase und Elektronen funktioniert, sowie auf verschiedene andere Funktionen 1-5 auszuführen. Bindet beispielsweise Häm zu Sauerstoff im Hämoglobin und Myoglobin für die Übertragung und Speicherung von Sauerstoff 6,7. Es funktioniert auch als Elektronenüberträger in der Cytochrome während der Atmung und wirkt als Elektronendonor für Redox-Reaktionen, die durch Cytochrom P450 Enzyme 8,9 katalysiert. Eines der signifikanten Merkmale des Häm ist, dass sie regulatorische Rolle bei der zellulären und molekularen Prozesse, wie Gen-Transkription, Proteinsynthese und Mikro RNA Biogenese 4 spielt. Beispielsweise wirkt sich die Transkription vieler Gene durch Steuerung der Aktivität von Säuger Transkriptionsrepressor BACH1 und Säugetiernuklear receptor Rev-erbα 10-15. Häm regelt die Aktivierung von Häm-Aktivatorprotein (HAP) 1, die eine wichtige Rolle bei der Aktivierung von Genen, die bei der Atmung und Steuerung oxidative Schädigung beteiligt spielt, in Reaktion auf Häm oder Sauerstoff 16. Häm regelt auch Gentranskription in neuronalen Zellen über den Nervenwachstumsfaktor (NGF) Signalisierungs 3,17-20. Ferner regelt die Proteinsynthese in Säugern erythroiden Zellen durch Modulierung der Aktivität des Häm-regulierten Kinase eIF2a (HRI) 21-24. Darüber hinaus beeinflussen die Aktivität des Häm Schlüsselsignalproteine wie Tyrosinkinase Src Jak2 und, was für die korrekte Zellfunktion und das Zellwachstum 4,20,25 sind. Es wurde festgestellt, dass in HeLa-Zellen Häm-Hemmung bewirkt Zellzyklusarrest und die Aktivierung der Marker mit Seneszenz und Apoptose 26 verbunden. Sowohl Häm-Mangel oder ein höheres Maß an Häm sind mit schweren Auswirkungen auf die Gesundheit des Menschen 27 verbunden. Neueste Molekular einnd epidemiologische Studien haben eine positive Assoziation mit hoher Häm Aufnahme und erhöhten Risiko von Krankheiten wie Typ-2-Diabetes, koronare Herzkrankheit und einige Krebsarten wie Lungenkrebs, Darmkrebs und Bauchspeicheldrüsenkrebs 27,28 gezeigt. Mit Hilfe eines passendes Paar von normalen und Krebslungenzellen Autoren Labor haben gezeigt, dass Krebszellen Ebenen der Sauerstoffverbrauch, Häm-Synthese und Proteine in Häm Aufnahme und Sauerstoffnutzung 28 beteiligten erhöht. Interessanterweise Hemmung der Häm-Synthese verringert den Sauerstoffverbrauch, Proliferation, Migration und Koloniebildung von Krebszellen 28. Somit spielt die Schwankungen der Konzentrationen von endogenem Häm eine wichtige Rolle bei der Regulation der molekularen und zellulären Prozessen 3,4,28,29.
Bei Säugetieren erfolgt die Biosynthese von Häm in acht Stufen unter Einschluss von Enzymen in den Mitochondrien und im Cytosol 4 (Figur 1) befindet. Häm biosynArbeit beginnt in der Matrix der Mitochondrien mit der Kondensation von Glycin und Succinyl-CoA in der 5-Aminolävulinsäure (5-ALA) zu bilden, durch ALA-Synthase (Ach) 4,31 katalysiert. Dies ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in Ham-Biosynthese in nonerythroid Zellen. 5-ALA wird dann in das Cytosol, wo die nächsten vier Schritte werden ausgeführt, um Coproporphyrinogen III (CPgenIII), die dann zurück in den Mitochondrien, wo sie in Protoporphyrin IX (PPIX) umgewandelt importiert bilden exportiert. Schließlich wird ein Molekül Eisen an den Protoporphyrin IX (PPIX) integriert, um Häm, eine Reaktion durch Ferrochelatase (FECH) 2,4 katalysiert zu produzieren.
Die Höhe der Häm-Biosynthese hängt in erster Linie von der Höhe der ALAS-Enzym, die fest durch intrazelluläre Eisen und Häm 4 gesteuert wird. Die Biosynthese von Häm durch genetische Defekte, die Verfügbarkeit von bestimmten Mineralstoffen und Vitaminen (zB Riboflavin, Zink), Exposition gegenüber Toxinen (zB Aluminium, Blei betroffen), Anoxie, Fieber und Konzentration bestimmter Steroide (zB Östrogen) 32-35. Die Höhe der Häm-Synthese ist in verschiedenen krankhaften Zuständen verändert. Verringert Hämbiosynthese kann Anämie sowie neurologischen Erkrankungen 3,36 verursachen. Alternativ spielt erhöht Hämbiosynthese eine wichtige Rolle bei der Progression von bestimmten Krebs 28,37. Häm wurde gezeigt, entscheidend für das Wachstum, die Differenzierung und das Überleben von Säuger Fettgewebe, erythroiden und neuronalen Zellen 4,38-41 sein. Zum Beispiel führt Häm Mangel an Neuriten Schaden in primären kortikalen Neuronen der Maus über die Hemmung der Glutamat-NMDA (N-Methyl-D-Aspartat) -Rezeptor-17. Zusätzlich Hemmung der Häm-Synthese verursacht programmierten Zelltod im menschlichen epithelialen Zervixkarzinom HeLa-Zellen 26,41. Daher ist es wichtig für die Untersuchung Ätiologie und progressi Messung der Häm-Biosynthese Ebenen in verschiedenen Zellen unter verschiedenen Bedingungenauf vieler Krankheiten.
Hier beschreiben wir eine schnelle und empfindliche Methode, um das Niveau der intrazellulären Häm-Synthese unter Verwendung von [4- 14 C] 5-aminolevulic Säure zu messen. Dies ist ein alternatives Verfahren zu anderen Verfahren unter Verwendung von 55 Fe oder 59 Fe. Wir ziehen mit 14 C, da ihre Strahlung ist sehr schwach. Im Gegensatz dazu ist starken Schutz für die Arbeit mit Fe Isotope erforderlich. Weiterhin soll dieses Verfahren zur Messung und zum Vergleich Häm-Synthese in verschiedenen Zellen, die parallel in einer schnellen Weise. Um absolute Häm zu messen, kann man die zuvor festgelegte Verfahren, das die Verwendung von HPLC 42,43 zu verwenden.
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Protocol
ACHTUNG: Während der Arbeit mit Radioaktivität, geeignete Vorkehrungen treffen, um eine Kontamination des Experimentators und die Umgebung zu vermeiden. Entsorgen Sie alle Abfälle folgenden lokalen Strahlenschutz-Richtlinien.
1. Herstellung der Zellen
- Saatgutzellen in 3,5 cm-Platten, so dass die Konfluenz erreicht 80% -90% am Tag des Tests.
- Man beachte, dass der Aussaat Konfluenz für Zellen hängt vom Zelltyp und ihre Wachstumsrate. Bei der Behandlung von Zellen mit einem Reagenz für eine bestimmte Anzahl von Tagen, Samenzellen, so dass die Konfluenz von 80% -90% am Tag des Häm-Messung. Wenn die Anzahl der Zellen, die aus 3,5 cm Platten erhalten nicht ausreicht, ist 6 cm-Platten mit derselben Menge an radioaktivem ALA, wie im nächsten Schritt.
Anmerkung: Die Verwendung von einzelnen Platten wird empfohlen, da es leichter ist, einzelne Platten zu handhaben.
- Man beachte, dass der Aussaat Konfluenz für Zellen hängt vom Zelltyp und ihre Wachstumsrate. Bei der Behandlung von Zellen mit einem Reagenz für eine bestimmte Anzahl von Tagen, Samenzellen, so dass die Konfluenz von 80% -90% am Tag des Häm-Messung. Wenn die Anzahl der Zellen, die aus 3,5 cm Platten erhalten nicht ausreicht, ist 6 cm-Platten mit derselben Menge an radioaktivem ALA, wie im nächsten Schritt.
- Einen Tag vor Häm-Messung, fügen Sie 0,1 bis 0,3 & mgr; Ci [14 C] 5-ALA und kalten ALA, um eine endgültige c erreichenONZENTRATION von 20 & mgr; M der gesamten ALA zu jeder Kulturschale in einem Arbeitsbereich fit für die Arbeit mit radioaktiven Stoffen und stellte die Teller wieder in den Inkubator. Im Idealfall inkubieren mit radioaktiven ALA 16 Stunden.
Anmerkung: Radioaktiv markierte 5-ALA erforderlich kann zwischen Zelllinien variieren. Eine radioaktive Zählung pro Minute (cpm) von mindestens 100 erforderlich ist, um den Fehler mit der Zählung zu minimieren. Empfiehlt es sich, eine minimale Menge an [14 C] 5-ALA für die Zelllinien untersucht erforderlich zu bestimmen. Für die meisten Experimente 0,1-0,3 uCi ist ausreichend, um eine gute Messung zu erhalten. Zugabe von kaltem ALA ist optional.
2. Heme Extraction
- Legen Sie die Zellkulturschalen auf Eis und nehmen sie in den Bereich fit für Radioaktivität Arbeit.
- Führen Sie die gesamte Extraktion und Verdampfungsprozess in einem explosionssicheren Motorhaube. Da die gespeicherte Äther explodieren kann, verwenden Sie den Äther in kleinen Flaschen und verdampfen alle verbleibenden Flüssigkeiten, speichern keine Äther ineine offene Flasche für mehr als einen Monat. Verwenden Sie kein Aceton in der Nähe von offenen Flammen und Öfen, wie sie ist leicht entzündlich. Shop Aceton enthält Reagenzien, die in Glasflaschen, wie sie löst Gewebekultur Kunststoffen.
- Absaugen des Mediums mit einer Pipette. Mit 1 ml kaltem PBS 1x waschen Sie die Zellen einmal. Absaugen PBS.
- 1 ml kaltem PBS 1x zu den Platten und sammelt die Zellen am Boden der Platte mit einem Gummischaber. Übertragen Sie die gesammelten Zellen von jeder Platte mit einer markierten vorgekühlte 2-ml-Tube. Sammeln Sie alle Zellen in 2 ml-Röhrchen.
Hinweis: Verwenden Sie eine frische Gummiwischer für jede Platte zum Abstreifen Zellen von jeder Platte. Für jede Platte würden Sie vier 2-ml-Röhrchen, ein 1,5-ml-Röhrchen und ein Szintillationsfläschchen erfordern. - Schleudern bei 15.000 × g für 1 min bei 4 ° C.
- Nehmen Sie PBS mit einer Pipette, eine kurze Spritztour und nehmen Sie das restliche PBS. Die Zellen in 100 ul 1x PBS. Vortex, um Zellen zu resuspendieren und auf Eis halten.
- Nehmen Sie sich 10 &# 956; l von Schritt 5 und in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und store auf Eis, um die Proteinkonzentration zu messen.
Anmerkung: Zelllysepuffer sollte zu den Zellen gegeben und auf Eis gehalten, um die Proteinkonzentration höher messen. - Dreh die restlichen 90 & mgr; l aus Schritt 5 bei 5.000 xg für 30 sec bei 4 ° C; Entfernen PBS komplett mit einem 200 ul Pipettenspitze.
- Fügen Sie 300 ul Häm-Extraktionspuffer (siehe Materialliste) in jedes Röhrchen. Dann Vortex für 15 Sekunden zu mischen und setzen auf Eis für 1 min, wiederholen Sie diese 3-mal.
- In Häm-Extraktionspuffer (HEB) und das Röhrchen vortexen schnell, um das Pellet zu resuspendieren, tun nur ein oder zwei Röhren in einer Zeit, da das Pellet sollte schnell, ohne in der HEB zu lange suspendiert werden. Sobald HEB wird auf alle Röhrchen gegeben und Pellet wird dann resuspendiert folgen Sie der 15 sec Vortex und 1 min auf Eis-Zyklus, wie in Schritt 8. Hinweis, dass Pellets nicht vollständig in die HEB zu gehen, wenn das Pellet wird in der HEB-Puffer für einen linken längerZeit und nicht schnell resuspendiert.
- Wird mit 1,2 ml Diethylether zugefügt und Vortex für 30 Sekunden. Schleudern bei 15.000 xg für 5 Minuten bei 4 ° C.
Anmerkung: Diethylether abläuft von Pipettenspitzen schnell. Um dies zu, Pipetten Diethylether auf und ab oder zweimal zu kontrollieren, dabei hilft, halten Sie die Diethylether in der Pipette. Wiederholen Sie diesen jedes Mal eine frische Pipettenspitze verwendet wird. - Übertragen Sie oben (ether) Phase mit 1 ml Pipette in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Wie in Schritt 9 Fügen Sie 0,5 ml 2 N HCl, Wirbel zu mischen und Spin.
Anmerkung: Es ist schwierig, die Trennung zwischen Ether und HCl Phasen anzusehen. Daher fügen Sie kleine Mengen von Trypanblau in 2 N HCl-Lösung auf während des Experiments verwendet werden, reicht es eine hellblaue Farbe zu geben. Dies wird Ihnen helfen zu unterscheiden die beiden Phasen. Die untere Phase wird blau und die obere Etherphase wird farblos sein. Übertragen Sie die obere farblos Etherphase in ein neues Röhrchen und entsorgen Sie die untere HCl (blau) Phase. - Wiederholen Sie Schritt 10 zweimehrere Male, um die Ether-Phase mit 2 N HCl waschen. Übertragen Sie nur die obere Etherphase in ein neues Röhrchen bei jeder Wiederholung und entsorgen Sie die untere HCl-Phase.
- Nach dem dritten Waschen mit HCl, übertragen Sie die obere Phase mit 1 ml Pipette in ein Szintillationsfläschchen. Trockne die Proben durch Verdampfen des Diethylether, indem die Proben in der chemischen Haube O / N.
3. Messung der Radioaktivität
- Am nächsten Tag, 5 ml Szintillationsflüssigkeit zu den getrockneten Proben aus Schritt 2.12.
- Gut schütteln um zu mischen. Messung der Radioaktivität unter Verwendung eines Szintillationszählers.
4. Berechnungen
- Lyse der Zellen aus Schritt 2.6 mit gleichen Mengen CelLytic M-Puffer (siehe Materialien List) und Schleudern bei 14.000 xg für 5 Minuten bei 4 ° C.
- Nehmen Sie ein Aliquot des Überstandes und Messung der Proteinkonzentration mit BCA-Protein-Assay-Kits.
Gesamtproteinmenge in mg (TP) = (90 & mgr; l * Konz. Von Protein in81; g / & mgr; l) / 1.000
Hämsynthese Ebene (Radioaktivität / TP) = pmol / mg Protein.
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Representative Results
Dieses Verfahren wurde verwendet, um das Niveau der Häm-Synthese in normal (HBEC30KT) gegen Krebs (HCC4017) Lungenzellen zu vergleichen. 2 zeigt ein höheres Niveau der Häm-Synthese in Krebszellen (HCC4017) als normale Lungenzellen (HBEC30KT). Das Niveau der Häm-Synthese wurde auch in normalen Zellen und Krebszellen in Gegenwart von mitochondrialen Entkoppler Carbonylcyanid 3-chlorphenylhydrazon (CCCP) gemessen. Zellen wurden mit 10 uM CCCP 24 h vor der Messung Hämsynthese Ebenen behandelt. Wie erwartet, die Werte von Häm-Synthese (2) verringerte in Gegenwart von CCCP in normalen und Krebszellen. Es wurde zuvor gezeigt, dass Häm-Synthese kann durch Succinylaceton (SA) gehemmt werden, ein potenter und spezifischer Hemmer der 5-Aminolävulinsäure-Dehydratase (ALAD), die das zweite Enzym Häm-Biosyntheseweg 41 ist. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden die Hämsynthese Ebenen in HeLa-Zellen in Gegenwart und in abs gemessenrung von 0,5 mM SA. 3 zeigt, dass die Pegel der Häm-Synthese durch mehr als 10 Falten in Gegenwart von SA verringert. Um die Verwendung dieser Technik weiter zu demonstrieren, wurden die Niveaus der Häm-Synthese gemessen und in 4 Krebs und in HEK293T-Zelllinien, wie in Abbildung 4 dargestellt.
Abbildung 1. Das Häm-Biosynthesewegs in Menschen ALAS, 5-Aminolävulinsäure-Synthase. 5-ALA, 5-Aminolävulinsäure; ALAD, Dehydratase ALA; PBG, Porphobilinogen; HMBS, hydroxymethylbilane Synthase; HMB, hydroxymethylbilane; UROS, Uroporphyrinogen III-Synthase; UPgenIII, Uroporphyrinogen III; UROD, Uroporphyrinogen Decarboxylase; CPgenIII, Coproporphyrinogen III; CPOX, Coproporphyrinogen III Oxidase; PPgenIX, Protoporphyrinogen-IX; PPOX, Protoporphyrinogen-IX-Oxidase; PPIX, Protoporphyrin IX; FECH, Ferrochelatase. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Die Höhe der Ham-Biosynthese in normal (HBEC30KT) und Krebs (HCC4017) Zelllinien, in Abwesenheit und Anwesenheit von 10 uM mitochondrialen Entkoppler CCCP. Die Hintergrundebene war ähnlich wie die Höhe der Blindprobe (Szintillationsflüssigkeit allein), und es weniger als 2% der Kontroll. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Levels von Häm-Biosynthese in HeLa-Zellen in abssenschaft und Gegenwart von 0,5 mM von Häm-Synthese-Hemmer Succinyl Aceton (SA). Die Zellen wurden mit SA für 3 Tage vor Häm Messung behandelt. Die Hintergrundebene war ähnlich wie die Höhe der Blindprobe (Szintillationsflüssigkeit allein) und es war weniger als 2% der Kontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 4 Vergleich der Niveaus von Häm-Biosynthese in 4 Krebs und HEK293T-Zelllinien. Assay wurde gemäß dem Protokoll durchgeführt. HCC4017 wurden ACL4 Medien, A549 und H1395 in RPMI1640 mit 5% FBS, HEK293T und HeLa in DMEM mit 10% FBS ergänzt war. Für die statistische Analyse wurden die Hämsynthese Niveaus in Krebszellen und HEK293T-Zellen an das Häm-Synthese Ebene HCC40 gegen17-Zellen unter Verwendung von Welch 2-Stichproben-t-Test. **, P-Wert <0,005. Die Hintergrundebene war ähnlich wie die Höhe der Blindprobe (Szintillationsflüssigkeit allein) und es war weniger als 2% der Kontrolle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Häm spielt eine Schlüsselrolle bei der Erzeugung von Zellenergie über die Atmung 26. Verändert Hämstoffwechsel bekanntermaßen mit verschiedenen Krankheiten einschließlich Krebs 28,41 zugeordnet sein. Die Inhibition der Häm-Synthese ist bekannt, Zellzyklusarrest und Apoptose in HeLa-Zellen 26,41 führen. Es hat sich gezeigt, dass hohe Hämsynthese Pegel wird mit dem Fortschreiten der Lungenkrebszellen 28 verbunden. Daher wäre es von großer Bedeutung sein, um die Niveaus von Häm-Biosynthese in den Zellen unter verschiedenen Bedingungen zu messen. Die hier diskutierten nicht den Gesamtbetrag der Häm daher quantifizieren Verfahren, ist es nicht die absolute Wert von Häm in den Zellen vorhanden. Es gibt eine Vielzahl von kolorimetrischen Verfahren und Kits zur Verfügung, um die Gesamtmengen von Häm in den Zellen zu messen. Beispielsweise kann Häm aus Zellen und Mitochondrien in einem Gemisch von Aceton und HCl extrahiert und mit 50% (v / v) Acetonitril gemischt werden. Dann wird die Mischung angewendet werden kannauf eine 3,9 x 300 mm C18-Säule Bondclone gefolgt von der Elution von Häm in einem Gradienten von Acetonitril, enthaltend 0,05% (v / v) Trifluoressigsäure und Identifizieren Häm-Verbindungen bei 400 nm 44,45.
Zuvor, um die Niveaus von Häm-Biosynthese in Säugetiergeweben und Zellextrakten [14 C] -glycin und [14 C] 5- ALA wurden verwendet, 46,47 messen. Obwohl markiertem Glycin in die Häm-Biosynthesewegs im ersten Schritt, aber es wird durch andere Stoffwechselwege, was zu seiner begrenzten Einarbeitung in Häm abgelassen. Glycin ist keine spezifische Metaboliten für Häm-Biosyntheseweg 48. Auf der anderen Seite, beschriftet 5-ALA ist spezifisch für Häm-Biosyntheseweg. Diese Funktion verleiht eine quantitative Vorteil der Verwendung von 5-ALA über Glycin 46,48,49. Daher ist die Verwendung von radioaktivem 5-ALA eine spezifischere und genaues Verfahren zum Messen und Vergleichen der Pegel von Häm-Biosynthese.
Die critische Schritte, um konsistente Ergebnisse zu bekommen sind: 1) sicherstellen, dass die Zellkonfluenz geht nicht höher als 100% und nicht weniger als 70% gegenüber verschiedenen Bedingungen; 2) die Menge an Radioaktivität pro Platte zugegeben sollten identisch sein, da diese Methode sehr empfindlich ist; 3) Häm-Extraktionspuffer sollte nicht alt sein, empfiehlt es sich, jedes Mal frisch zu machen. Das Volumen der Radioaktivität pro Platte erforderlich ist, ist sehr klein und es ist schwierig, die identische Mengen für die Proben zu erhalten. Daher ist es empfehlenswert, eine Arbeitsstammlösung im Kulturmedium bilden, wenn mit dem gleichen Medium für alle Proben können sonst PBS (phosphatgepufferte Salzlösung) verwendet werden. Arbeitsstammlösung kann in der Weise, dass das abgegebene Volumen pro Platte unter 10 & mgr; l, hergestellt werden. Auch, um genauer zu sein, kann das Medium von den Parallelproben für eine Bedingung in einem 50-ml-Röhrchen genommen werden und die entsprechenden Mengen an Radioaktivität kann von der Arbeitsstammlösung hinzugefügt werden, dann verzichten zurück eQual Mengen Medium zu den Platten. Wenn die Anzahl der Zellen begrenzt sind, wie beispielsweise in Primärkulturen können mit 12 Vertiefungen oder 24 Vertiefungen zur Kultur der Zellen verwendet werden, und zur Verringerung der Menge an Radioaktivität pro Well anteilig zugesetzt.
Dieses Protokoll ist unkompliziert, einfach und liefert exakte Messungen der Ebenen der Häm-Synthese. Manchmal kann es schwierig sein, das Zellpellet in der Häm-Extraktionspuffer (Schritt 2.8) vollständig zu resuspendieren. Um dies zu vermeiden schnell in Schritt 2.8, fügen Häm-Extraktionspuffer auf 1-2 Proben zu einem Zeitpunkt, Wirbel und legte sie auf Eis. Stellen Sie sicher, die Häm-Extraktionspuffer ist nicht zu alt. Wenn die Standardabweichung unter den Wiederholungsproben zu hoch ist, achten Sie auf die folgenden Schritte: 1) PBS wurde im Schritt 2.7 entfernt wird; 2) zu verschütten, wenn die Probe in Diethyletherphase, befolgen Sie die Spitze in Schritt 2.9; 3) sicherstellen, dass die Radioaktivität aufgenommen pro Platte und die Konfluenz der Parallelproben waren dieselben.
28 in normalen nicht-malignen (HBEC) vs. Karzinom (HCC) Zellen des gleichen Patienten entwickelt gezeigt verglichen. Die hier beschriebene Technik erfordert die Verwendung von [14 C] 5-ALA, eine Vorstufe in Häm-Biosyntheseweg (Abbildung 1) und misst die Radioaktivität in Häm inkorporiert. Bei dieser Technik, Porphyrine, einschließlich Häm, wurden aus den Zellen in einem Gemisch aus Aceton extrahiert, konzentrierte HCl und Wasser 50,51. Häm wurde weiter von Porphyrinen durch Extraktion in Diethylether und Waschen der Etherphase mit 2 N HCl 50,51 getrennt. Dann wurde die Radioaktivität in Häm eingebaut unter Verwendung eines Szintillationszählers bestimmt. Die Ergebnisse können durch die Gesamtproteinmenge oder Zellenzahl normalisiert werden. Hämsynthese in HeLa-Zellen wurde unter Verwendung von Succinylaceton (SA) und eine Abnahme in der Höhe der Häm-Synthese gehemmt wird, wie gezeigt vorge beobachtetzuvor 26 (Abbildung 3).
Dieses Verfahren ist sehr nützlich für den Vergleich der Pegel der Häm-Synthese unter verschiedenen Bedingungen oder zwischen Zelllinien (Abbildung 4). Es erfordert eine kleine Anzahl von Zellen und stellt spezifische Messung und Vergleich der Mengen von Häm-Synthese in verschiedenen Zellen. Es ist nicht für die genaue Messung der absoluten Häm Pegel in den Zellen bestimmt. Es ist am besten verwendet werden, um das Niveau der Häm-Synthese in Zellen mit unterschiedlichen Eigenschaften, wie verschiedene Krebszellen zu vergleichen. Da Kobalt, anstelle von Eisen kann in Häm in dem letzten Schritt der Häm-Synthese eingebracht werden und 51 extrahiert werden, kann dieses Verfahren nicht nachgeben genauen Vergleich der Häm-Synthese, wenn die Wachstumsmedien enthalten unterschiedliche Mengen an Kobalt- oder anderen Metallionen. Dennoch ist das Häm Syntheseweg aus 5-Aminolävulinsäure, Porphyrine und Häm sehr spezifisch, Messen der Flußpegel des gesamten pathway ist wahrscheinlich stärker reflektierend relevant Häm metabolischen Aktivitäten, unabhängig von den Metallionen. Im Gegensatz dazu ist die Methode mit 59 Fe detektiert nur den Teil des Weges Einbeziehung Fe Häm 52 bilden. Obwohl dies präziser in Gegenwart signifikanter Konzentrationen an Metallionen können die detektierten Hämsynthese Niveaus nicht den Stoffwechsel Potential bestimmter Zellen, wie Krebszellen. Darüber hinaus kann Fe in andere Zellstandorte neben Mitochondrien abgesondert werden, um Häm zu machen. Im großen und ganzen sind wir der Meinung, dass die Verwendung von [4- 14 C] 5-ALA ist ein praktisches Verfahren zum Messen von Häm Ebenen beim Vergleich verschiedener Zellen mit variierenden Eigenschaften.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die HCC4017 und HBEC30KT Zelllinien wurden freundlicherweise von Dr. John Minna Labor zur Verfügung gestellt. Diese Arbeit wurde von der Cecil und Ida H. Grün Mittel Dr. Li Zhang unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma | 650501 | |
| Diethy ether | Sigma | 296082 | |
| HCl (Hydrochloric acid) | Fisher | A481-212 | |
| Liquid Scintillation cocktail | MP Biomedicals | 882470 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250 | |
| Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid | Perkin-Elmer life sciences | Store at -80 °C | |
| CelLytic M | Sigma | C2978 | Mammalian cell lysis reagent |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Specific reagent | Component | Dispense | |
| Heme extraction buffer: Acetone:HCl:Water (25:1.3:5) |
Acetone Concentrated HCl Water |
25 ml 1.3 ml 5 ml |
References
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