Abstract
ヘムは、ヘモグロビン、ミオグロビン、およびチトクロームのようなヘムタンパク質として知られている多種多様なタンパク質のための補欠分子族として機能します。このような遺伝子の転写、翻訳、細胞分化および細胞増殖などの種々の分子との細胞プロセスに関与しています。ヘムの生合成レベルは、異なる組織および細胞型間で異なると、そのような貧血、神経障害および癌などの疾患状態に変更されます。この技術は、[4- 14 C] 5-アミノレブリン酸（[14 C] 5-ALA）、哺乳動物細胞においてヘム合成のレベルを測定するためのヘム生合成経路における早期の前駆体の1つを使用します。このアッセイは、[14 C]ヘムおよびヘムに取り込まれた放射能の測定を抽出した5-ALAとの細胞のインキュベーションを含みます。この手順は、正確かつ迅速です。この方法は、ヘム生合成の相対的レベルではなく、総ヘム含量を測定します。このTECHNの使用を実証するために、ヘム生合成のレベルのiQueいくつかの哺乳動物細胞株において測定しました。
Introduction
ヘム、第一鉄とプロトポルフィリンIXの複合体は、事実上すべての生物1-3の酸素を運搬し、利用するための中心的な分子です。ヘムのユニークな構造は、二原子気体と電子のキャリアとして機能するだけでなく、様々な他の機能1-5を実行することが可能となります。例えば、ヘムは、酸素6,7の転送と記憶のためのヘモグロビンやミオグロビン中の酸素と結合します。また、チトクロームP450酵素により触媒される8,9レドックス反応のための電子供与体として、呼吸および動作中にシトクロムにおける電子キャリアとして機能します。ヘムの最も重要な特徴の一つは、そのような遺伝子転写、タンパク質合成およびマイクロRNAの生合成4などの細胞および分子プロセスにおいて調節の役割を果たし得る、ということです。例えば、哺乳動物の転写リプレッサーBACH1の活性および哺乳類核RECを制御することにより、多くの遺伝子の転写に影響を与えますeptor Rev非ERBα10-15。ヘムは、ヘムまたは酸素16に応答して、呼吸および酸化的損傷の制御に関与する遺伝子の活性化に重要な役割を果たしているヘム活性化タンパク質（HAP）1の活性化を調節します。ヘムも3,17-20シグナリング神経成長因子（NGF）を介して、神経細胞における遺伝子転写を調節します。また、ヘム調節eIF2αキナーゼ（HRI）21-24の活性を調節することによって、哺乳動物の赤血球細胞におけるタンパク質合成を調節します。また、ヘムは、適切な細胞の機能および細胞増殖4,20,25に必須であるようなチロシンキナーゼのJak2およびSrcなどの重要なシグナル伝達タンパク質の活性に影響を与えます。これは、HeLa細胞においてヘム阻害が老化およびアポトーシス26に関連するマーカーの細胞周期停止及び活性化を引き起こすことが見出されました。ヘム欠乏症やヘムのレベルの増加の両方が、ヒト27で深刻な健康への影響に関連しています。最近の分子AND疫学的研究は、高いヘム摂取の正の関連を示し、例えば、2型糖尿病、冠状動脈性心疾患および肺癌、結腸直腸癌および膵臓癌27,28を含むいくつかの癌のような疾患のリスクが増加しています。正常および癌性肺細胞の著者の研究室のペアを使用した癌細胞は、酸素消費量、ヘム合成やヘム取り込みおよび酸素利用率28に関与するタンパク質のレベルが増加していることを見出しました。興味深いことに、ヘム合成の阻害は、癌細胞28の酸素消費、増殖、移動およびコロニー形成を減少させました。したがって、内因性のヘムのレベルの変動は、分子及び細胞プロセス3,4,28,29の調節において重要な役割を果たしています。
哺乳類では、ヘムの生合成は、ミトコンドリア及び細胞質ゾル4（ 図1）内に位置する酵素を含む、8ステップで起こります。ヘムBIOSYN論文は、ALAシンターゼ（ALAS）4,31によって触媒5-アミノレブリン酸（5-ALA）を形成するグリシンとスクシニルCoAとの縮合を用いてミトコンドリアのマトリックスから始まります。これはnonerythroid細胞におけるヘム生合成の律速段階です。 5-ALAは、次の4つのステップが、再びそれはプロトポルフィリンIX（PPIX）に変換され、ミトコンドリアにインポートされるコプロポルフィリノーゲンIII（CPgenIII）を形成するために起こる細胞質ゾルに出てエクスポートされます。最後に、鉄の一分子はヘム、フェロケラターゼ（FECH）2,4によって触媒される反応を生成するためにプロトポルフィリンIX（PPIX）に組み込まれています。
ヘム生合成のレベルは、主にしっかりと細胞内の鉄とヘム4によって制御されるALAS酵素のレベルに依存します。ヘムの生合成は、特定のミネラルやビタミンの利用可能性（ 例えば、リボフラビン、亜鉛）、毒素への曝露（ 例えば、アルミニウム、鉛、遺伝的欠陥によって影響を受ける可能性があります）、無酸素、熱、および特定のステロイドのレベル（ 例えば、エストロゲン）32-35。ヘム合成のレベルは、種々の疾患状態に変更されます。ヘム生合成は、貧血などの神経疾患3,36を引き起こす可能性が減少しました。あるいは、増加したヘム生合成は、特定の癌28,37の進行に重要な役割を果たしています。ヘムは、哺乳動物の脂肪、赤血球および神経細胞4,38-41の増殖、分化および生存のために重要であることが示されています。例えば、ヘムの欠乏はグルタミン酸NMDA（N -メチル-D-アスパラギン酸）受容体17の阻害を介して一次マウス皮質ニューロンにおける神経損傷につながります。さらに、ヘム合成の阻害は、ヒト上皮頸癌HeLa細胞におけるプログラム細胞死26,41を引き起こします。そのため、異なる条件下で種々の細胞におけるヘム生合成のレベルを測定することは病因とprogressiを研究するために重要です多くの疾患の上。
ここでは、[4- 14 C] 5-aminolevulic酸を用いて細胞内のヘム合成のレベルを測定するための迅速かつ高感度な方法を説明します。これは55のFeまたは59のFeを使用して他の方法に代わる方法です。私たちは、その放射線が非常に弱いため、14 Cを使用して好みます。これとは対照的に、強力な保護は、Feの同位体での作業のために必要とされます。さらに、この方法は、迅速な方法で並行して異なるセル内のヘム合成を測定し、比較することを意図しています。絶対ヘム濃度を測定するためには、HPLC 42,43の使用を伴う以前に確立された方法を使用してもよいです。
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Protocol
注意：放射能と協力しながら、実験者や周囲の汚染を避けるために適切な予防措置をとります。局所放射線安全指針以下のすべての廃棄物を捨てて。
細胞の調製
- 密集度は、アッセイの日に80％-90％になるように3.5センチメートルプレートでシード細胞。
- 細胞のための密集度に播種する細胞の種類とその成長速度に依存することに注意してください。密集度は、ヘム測定の日に80％-90％になるよう日、種子細胞の一定数の試薬で細胞を処理します。 3.5センチメートルプレートから得られた細胞の数が不十分な場合、次のステップのように放射性ALA同量の6センチプレートを使用します。
注：それは個々のプレートを処理することが容易であるため、個々のプレートの使用が推奨されます。
- 細胞のための密集度に播種する細胞の種類とその成長速度に依存することに注意してください。密集度は、ヘム測定の日に80％-90％になるよう日、種子細胞の一定数の試薬で細胞を処理します。 3.5センチメートルプレートから得られた細胞の数が不十分な場合、次のステップのように放射性ALA同量の6センチプレートを使用します。
- ヘム測定前日、最終的なCに到達するために0.1〜0.3μCiの[14 C] 5-ALAと冷たいALAを追加放射性物質を扱うとバックインキュベーターにプレートを置くための作業領域フィットの各培養皿に20総ALAのμMのoncentration。理想的には、16時間の放射性ALAでインキュベートします。
注：放射性標識5-ALAは、細胞株の間で変化し得る必要。少なくとも100の毎分放射能のカウント（CPM）は、計数に関連する誤差を最小化するために必要とされます。これは、研究対象の細胞株に必要な[14 C] 5-ALAの最小量を決定することをお勧めします。ほとんどの実験では0.1〜0.3μCiのは、良好な測定を取得するのに十分です。冷たいALAの添加は任意です。
2.ヘムの抽出
- 氷の上で細胞培養皿を置き、放射能ワークのエリアに収まるようにそれらを取ります。
- 防爆フード全体の抽出および蒸発プロセスを実行します。保存されたエーテルは、爆発するおそれがありますので、中にエーテル保管しない、小さなボトル中にエーテルを使用し、残りの液体を蒸発させます1カ月以上のオープンボトル。それは非常に可燃性であるとして、火気、およびヒーターの近くにアセトンを使用しないでください。それは、組織培養プラスチックを溶解するように、ガラスボトル中の試薬を含むストアアセトン。
- ピペットを用いて培地を吸引除去。 1×冷PBS 1mlで細胞を一度洗ってください。 PBSを吸引除去。
- プレートに1×冷PBSを1ml加え、ラバーポリスマンを用いてプレートの底に細胞を収集します。標識された予備冷却の2mlチューブに各プレートから採取した細胞を転送します。 2ミリリットルチューブ内のすべてのセルを収集します。
注：各プレートから細胞を掻き取るために、各プレート新鮮なラバーポリスマンを使用してください。各プレートのためにあなたは、4つの2ミリリットルチューブ、1.5mlチューブとシンチレーションバイアルを必要とするであろう。 - 4℃で1分間、15,000×gでスピン。
- 、ピペットを用いてPBSを取り出し、短いスピンを与え、残留PBSを削除します。 1×100μlのPBSで細胞を再懸濁し。細胞を再懸濁し、氷上に維持するための渦。
- 10＆を取ります＃956; lの氷1.5 mlのマイクロ遠心チューブとストアへのステップ5と転送からは、タンパク質濃度を測定しました。
注意：細胞溶解緩衝液を細胞に添加し、後のタンパク質濃度を測定するために氷の上に維持されるべきです。 - 4℃で30秒間、5,000×gでステップ5からの残り90μlのスピン。完全に200μlのピペットチップを使用してPBSを除去します。
- ヘムの抽出緩衝液300μl加え、各チューブに（材料リストを参照してください）。その後、15秒間渦が混在し、1分間氷上に置く、この3回繰り返します。
- ヘム抽出バッファー（HEB）を追加し、ペレットを再懸濁するために迅速にチューブをボルテックス、ペレットが長すぎるためにHEBに放置されることなく、迅速に再懸濁する必要があるため、一度に1つまたは2つの管を行います。 HEBは、全てのチューブに添加し、ペレットを次に再懸濁した後、ペレットをするためのHEBバッファに残っている場合は、ペレットがHEBに完全に行かないことがステップ8ノートのように15秒の渦と氷のサイクルで1分間に従ってくださいより長いです時間とすぐに再懸濁していません。
- 30秒間各チューブとボルテックスにジエチルエーテル1.2 mlを加え。 4℃で5分間、15,000×gでスピン。
注：ジエチルエーテルを迅速にピペットチップを使い果たしました。 、これを制御ピペットジエチルエーテル上下一度か二度するには、そうすることは、ピペットでジエチルエーテルを保持するのに役立ちます。この新鮮なピペットチップを使用するたびに繰り返します。 - 新しいマイクロチューブに1ミリリットルピペットでトップ（エーテル）相を転送します。ステップ9のように2 N塩酸、混合するための渦とスピンの0.5ミリリットルを追加します。
注：これは、エーテルとHCl相の間の分離を参照してくださいすることは困難です。したがって、淡青色を与えるために十分な実験中に使用される2 N HCl溶液にトリパンブルーを少量加えます。これは、2つのフェーズを区別するのに役立ちます。下相が青色になり、上部のエーテル相が無色になります。新しいチューブに上層無色エーテル相を移し、下のHCl（青）相を廃棄します。 - 手順10を繰り返し2複数回に2 N HClでエーテル相を洗浄します。各繰り返しの間に新しいチューブにのみトップエーテル相を移し、下のHCl相を廃棄します。
- HClで3回目の洗浄後、シンチレーションバイアルに1ミリリットルピペットで上相を転送します。化学フードO / Nでサンプルを維持することによってジエチルエーテルを蒸発させることにより、サンプルを乾燥させます。
放射能の測定3。
- 翌日、ステップ2.12から乾燥試料にシンチレーション液を5ml加えます。
- 混合するためによく振って。シンチレーションカウンターを用いて放射能を測定します。
4.計算
- のCelLytic Mバッファの等量を用いて、ステップ2.6からの溶解は、細胞を4℃で5分間、14,000×gでスピン（材料リストを参照してください）。
- 上清のアリコートを取り、BCAタンパク質アッセイキットを用いてタンパク質濃度を測定します。
総mgの中のタンパク質の量（TP）=（90μlの*濃タンパク質の中81; G /μL）/千
ヘム合成レベル（放射能/ TP）=タンパク質のピコモル/ mgで。
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Representative Results
この方法は、癌（HCC4017）肺細胞対（HBEC30KT）正常でヘム合成のレベルを比較した。 図2は 、正常肺細胞（HBEC30KT）よりも癌細胞（HCC4017）においてヘム合成のより高いレベルを示しています。ヘム合成のレベルはまた、ミトコンドリアの脱共役カルボニルシアニド3-クロロフェニル（CCCP）の存在下で、正常細胞と癌細胞で測定しました。細胞は、ヘム合成のレベルを測定する前に24時間10μMのCCCPで処理しました。予想されるように、ヘム合成のレベル（ 図2）は、正常細胞と癌細胞の両方におけるCCCPの存在下で減少しました。これは、ヘム合成はクシニルアセトン（SA）、ヘム生合成経路41における第二の酵素である5-アミノレブリン酸デヒドラターゼ（ALAD）の強力かつ特異的阻害剤によって阻害され得ることが以前に示されています。この方法を使用して、ヘム合成のレベルが存在し、ABSでHeLa細胞において測定しました。0.5 mMのSAのレンス。 図3は、ヘム合成のレベルはSAの存在下で、10以上の-倍に減少したことを示しています。さらに、この技術の使用を実証するために、ヘム合成のレベルを測定し、 図4に示すように4癌およびHEK293T細胞株で比較しました。
図1.ヒトにおけるヘム生合成経路 ALAS、5-アミノレブリン酸シンターゼ。 5-ALA、5-アミノレブリン酸; ALAD、ALAはデヒドラターゼ; PBG、ポルホビリノゲン。 HMBS、ヒドロキシメチルシンターゼ; HMB、ヒドロキシメチル; UROS、ウロポルフィリノーゲンIIIシンターゼ; UPgenIII、ウロポルフィリノーゲンIII。 UROD、ウロポルフィリノーゲンデカルボキシラーゼ; CPgenIII、コプロポルフィリノーゲンIII。 CPOX、コプロポルフィリノーゲンIIIオキシダーゼ。 PPgenIX、プロトポルフィリノーゲンIX。 PPOX、プロトポルフィリノーゲンIXオキシダーゼ; PPIXは、プロトポルフィリンIX。 FECH、フェロケラターゼ。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
10μMのミトコンドリア脱共役剤のCCCPの非存在下および存在下で、通常でヘム生合成（HBEC30KT）のレベルと癌（HCC4017）細胞株2図は、背景レベルはブランク試料（単独シンチレーション液）のレベルに類似していたし、それ対照の2％未満であった。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
ABSでHeLa細胞におけるヘム生合成の図3レベルヘム合成阻害剤スクシニルアセトン（SA）を0.5 mMにレンスおよびプレゼンス。細胞を、ヘム測定の前に3日間SAで処理しました。バックグラウンドレベルは、ブランク試料（単独シンチレーション液）のレベルと同様であったし、それは、コントロールの2％未満であった。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
4癌及びHEK293T細胞株でのヘム生合成のレベルを図4の比較。アッセイプロトコールに従って実施しました。 HCC4017、5％FBS、10％FBSを補充したDMEM中でHEK293TおよびHeLaを補充したRPMI1640培地中でACL4、A549およびH1395中で増殖させました。統計分析のために、癌細胞およびHEK293T細胞においてヘム合成レベルはHCC40においてヘム合成のレベルと比較しましたウェルチ2標本t検定を用いて、17の細胞。 **、P値<0.005。バックグラウンドレベルは、ブランク試料（単独シンチレーション液）のレベルと同様であったし、それは、コントロールの2％未満であった。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
ヘムは、呼吸26を介して細胞エネルギーの生成に重要な役割を果たしています。変更されたヘム代謝、癌28,41を含む種々の疾患に関連することが知られています。ヘム合成の阻害は、Hela細胞26,41における細胞周期の停止およびアポトーシスを引き起こすことが知られています。これは、高いヘム合成レベルが肺癌細胞28の進行と関連していることが示されています。したがって、異なる条件下で細胞におけるヘム生合成のレベルを測定するために非常に重要であろう。したがって、ヘムの合計量を定量化しないここで説明する方法は、それが細胞内に存在するヘムの絶対値を提供していません。細胞においてヘムの総量を測定するために利用できる比色分析方法およびキットには様々なものがあります。たとえば、ヘムはアセトンと塩酸との混合物中の細胞とミトコンドリアから抽出することができ、50％（v / v）のアセトニトリルと混合しました。次いで、混合物を適用することができますアセトニトリル、0.05％（v / v）のトリフルオロ酢酸を含有する400nmの44,45におけるヘム化合物を同定する勾配ヘムの溶出した3.9×300ミリメートルBondclone C18カラムへ。
以前は、哺乳動物組織および細胞抽出物中のヘム生合成のレベルを測定するために[14 C] -グリシンおよび[14 C] -5- ALAは46,47を使用しました。標識されたが、グリシンは、第1段階のヘム生合成経路に入りますが、ヘムへのその制限された取り込み、その結果、他の代謝経路によって排出されます。グリシンは、ヘム生合成経路48に特異的な代謝産物ではありません。一方、5-ALAは、ヘム生合成経路に特異的である標識されました。この機能は、グリシン46,48,49の上に5-ALAを用いた定量的な利点を与えます。したがって、放射性5-ALAの使用は、測定し、ヘム生合成のレベルを比較するためのより具体的かつ正確な方法です。
ほとんどのC一貫性のある結果を得るためにritical手順は次のとおりです。1）は、細胞集密度は、様々な条件にわたって70％以下を100％よりも高い移動していないていないことを確認してください。この方法は非常に敏感であるため、2）プレート当たりに添加した放射能の量は同一である必要があります。 3）ヘム抽出バッファーが古いであってはならない、それが新鮮なすべての時間を作ることをお勧めします。プレート当たりに必要な放射能の量は非常に小さく、それはサンプルで同じ量を維持することは困難です。したがって、それはすべてのサンプルについて同じ培地を使用する場合、培地中の作業ストック溶液を作製することが推奨され、それ以外のPBS（リン酸緩衝生理食塩水）を用いることができます。ワーキングストック溶液を、プレートあたり分配体積が10μlの下にあるような方法で調製することができます。また、より正確には、ある条件の複製サンプルからの培地を50mlチューブに取り出すことができ、放射能の適切な量は、ワーキングストック溶液から追加することができ、その後、電子バック分配しますプレートへの媒体のクアル量。細胞数は、初代培養と同様に、限られている場合は、12ウェルまたは24ウェルプレートを培養する細胞を使用し、比例して各ウェルに添加した放射能の量を減らすことができます。
このプロトコルは、簡単に簡単であり、ヘム合成のレベルの正確な手段を提供します。時々、それは完全にヘム抽出バッファー（ステップ2.8）で細胞ペレットを再懸濁することが困難な場合があります。これはステップ2.8で速さを避けるために、時間、ボルテックスで1〜2サンプルにヘム抽出緩衝液を追加して、氷の上に置きます。ヘム抽出バッファが古すぎないことを確認します。複製試料間の標準偏差が大きすぎる場合は、次のステップに注意を払う：1）PBS、ステップ2.7で完全に除去しました。 2）ジエチルエーテル相に、ステップ2.9で、先端に従うときにサンプルをこぼさないようにしてください。 3）プレートごとに加え、放射能や複製サンプルの密集度が同じであったことを確認してください。
、28に示すように、放射性5-ALAの方法を使用して、SS = "jove_contentは">、ヘム合成のレベルを比較しました。ここに記載の技術は、[14 C] 5-ALA、ヘム生合成経路における前駆体（ 図1）の使用を必要とし、ヘムに取り込まれた放射能を測定します。この技術では、ヘムを含むポルフィリンは、アセトンの混合物中の細胞から抽出し、HCl及び水50,51を濃縮しました。ヘムは、さらにジエチルエーテルで抽出し、2NのHCl 50,51とエーテル相を洗浄することによりポルフィリンから分離しました。そして、ヘムに取り込まれた放射能をシンチレーションカウンターを用いて測定しました。結果は、タンパク質または細胞数の総量によって正規化することができます。 HeLa細胞においてヘム合成はスクシニルアセトン（SA）を用いて阻害されたと事前示すようヘム合成のレベルの減少が観察されましたviously 26（ 図3）。
この方法は、（ 図4）は、異なる条件の下でまたは細胞株との間のヘム合成のレベルの比較のために非常に有用です。これは、少数の細胞を必要とし、特定の測定と、異なるセルにおけるヘム合成のレベルの比較を提供します。これは、細胞内での絶対的なヘム濃度の正確な測定のために意図されていません。これは、最高のような異なる癌細胞のような異なる特性を有する細胞においてヘム合成のレベルを比較するために使用されます。コバルトので、代わりに鉄の、増殖培地は、コバルト又は他の金属イオンの異なるレベルを含む場合には、この方法は、ヘム合成の正確な比較が得られない場合があり、ヘム合成の最後のステップでヘムに組み込むことができ、51抽出します。それにもかかわらず、ポルフィリンおよびヘムに5-アミノレブリン酸からヘム合成経路は、全体のp磁束レベルを測定する、非常に特異的ですathwayにかかわらず、金属イオンの、ヘムに関連する代謝活性をより反映である可能性があります。対照的に、59鉄を用いる方法は、ヘム52を形成するためのFeを組み込む経路の一部のみを検出します。これはより具体的であるが、金属イオンの有意なレベルの存在下で検出されたヘム合成のレベルは、例えば、癌細胞などの特定の細胞の代謝可能性を反映しないかもしれません。また、鉄は、ヘムを作るために、ミトコンドリアの横に他の細胞の場所に隔離することができます。ことで、大規模な、我々は[4- 14 C] 5-ALAの使用が変化する特性を有する異なるセルを比較する場合ヘムレベルを測定するためのより実用的な方法であると信じています。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
HCC4017とHBEC30KT細胞株は、親切にドクター·ジョンみんなの研究室によって提供されました。この作品は、李博士張にセシルH.とアイダ·グリーンファンドによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma | 650501 | |
| Diethy ether | Sigma | 296082 | |
| HCl (Hydrochloric acid) | Fisher | A481-212 | |
| Liquid Scintillation cocktail | MP Biomedicals | 882470 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250 | |
| Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid | Perkin-Elmer life sciences | Store at -80 °C | |
| CelLytic M | Sigma | C2978 | Mammalian cell lysis reagent |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | |
| Specific reagent | Component | Dispense | |
| Heme extraction buffer: Acetone:HCl:Water (25:1.3:5) |
Acetone Concentrated HCl Water |
25 ml 1.3 ml 5 ml |
References
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