Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Måling av Heme Synthesis Levels i pattedyrceller

Published: July 9, 2015 doi: 10.3791/51579
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular and Cell Biology, Center for Systems Biology, University of Texas at Dallas

Abstract

Heme tjener som protese gruppe for en rekke forskjellige proteiner kjent som hemoproteins, slik som hemoglobin, myoglobin og cytokrom. Det er involvert i ulike molekylære og cellulære prosesser som genet transkripsjon, translasjon, celledifferensiering og celleproliferasjon. Biosyntesen nivåene av heme varierer på tvers av forskjellige vev og celletyper og er endret i syke tilstander som anemi, neuropati og kreft. Denne teknikken bruker [4- 14 C] 5-aminolevulinsyre ([14C] 5-ALA), en av de tidlige forløpere i heme biosyntesebanen å måle nivåene av heme syntese i pattedyrceller. Denne analysen innebærer inkubasjon av cellene med [14C] 5-ALA, etterfulgt av ekstraksjon av heme og måling av radioaktiviteten inkorporert i heme. Denne prosedyren er nøyaktig og rask. Denne fremgangsmåten måler den relative nivåer av heme biosyntese i stedet for den totale heme-innhold. For å demonstrere bruken av dette technik nivåene av heme biosyntese ble målt på flere pattedyrcellelinjer.

Introduction

Heme, et kompleks av toverdig jern og protoporfyrin IX er et sentralt molekyl for transport og anvendelse av oksygen i praktisk talt alle levende organismer 1-3. Den unike strukturen av heme gjør det mulig å virke som en bærer av diatomiske gasser og elektroner, samt for å utføre andre funksjoner 1-5. For eksempel, bindes heme til oksygen i hemoglobin og myoglobin for overføring og lagring av oksygen 6,7. Det fungerer også som en elektronbærer i cytochromes under respirasjon og fungerer som et elektron donor for redoksreaksjoner katalysert av cytokrom P450-enzymer 8,9. En av de mest betydningsfulle trekk ved heme er at den kan spille regulatoriske roller i cellulære og molekylære prosesser som gentranskripsjon, proteinsyntese og mikro-RNA biogenese 4. For eksempel, det påvirker transkripsjonen av mange gener ved å kontrollere aktiviteten av pattedyr transcriptional repressor bach1 og pattedyratom receptor Rev-erbα 10-15. Heme regulerer aktiveringen av heme aktivator protein (Hap) 1, som spiller en viktig rolle i aktivering av gener som er involvert i kontroll av respirasjon og oksidativ skade, i respons til heme eller oksygen 16. Heme også regulerer gentranskripsjon i nerveceller via nervevekstfaktor (NGF) signal 3,17-20. Den regulerer også proteinsyntese i pattedyr erytroide celler ved å modulere aktiviteten av heme-regulert eIF2α kinase (HRI) 21-24. Videre påvirker heme aktiviteten av nøkkelsignaleringsproteiner som tyrosinkinase JAK2 og Src, som er avgjørende for riktig funksjon og celle-cellevekst 4,20,25. Det ble funnet at i HeLa-celler heme inhibering fører til cellesyklus-stans og aktivering av markører assosiert med begynnende alderdom og apoptose 26. Både Heme mangel eller økte nivåer av heme er forbundet med alvorlige helseeffekter hos mennesker 27. Nyere molekylære ennd epidemiologiske studier har vist en positiv sammenheng med høy heme inntak og økt risiko for sykdommer, som type-2 diabetes, hjerte- og karsykdommer og flere krefttyper, inkludert lungekreft, tykktarmskreft og bukspyttkjertelkreft 27,28. Ved hjelp av en matchet par normale og kreftlungeceller forfatternes lab har funnet ut at kreftceller har økt nivå av oksygenforbruk, heme syntese og proteiner involvert i heme opptak og oksygen utnyttelse 28. Interessant, inhibering av heme syntese redusert oksygenforbruk, proliferasjon, migrering og kolonidannelse av kreftceller 28. Dermed blir svingninger i nivåene av endogent heme spiller en viktig rolle i reguleringen av molekylære og cellulære prosesser 3,4,28,29.

I pattedyr, oppstår biosyntesen av heme i åtte trinn, som involverer enzymer lokalisert i mitokondriene og cytosol 4 (figur 1). Heme BiosynOppgaven begynner i matriksen i mitokondriene med kondensering av glycin og suksinyl-CoA til å danne 5-aminolevulinsyre (5-ALA), katalysert av ALA-syntase (akk) 4,31. Dette er det hastighetsbegrensende trinnet i biosyntesen heme i nonerythroid celler. 5-ALA blir deretter eksportert inn i cytosolen hvor de neste fire trinn forekommer for å danne coproporphyrinogen III (CPgenIII), som deretter er importert tilbake til mitokondriene, hvor det omdannes til protoporfyrin IX (PpIX). Til slutt blir et molekyl av jern innlemmet i protoporfyrin IX (PpIX) for å produsere heme, en reaksjon katalysert av ferrochelatase (FECH) 2,4.

Graden av heme biosyntesen avhenger først og fremst av nivået på ALAS enzym som er strengt kontrollert av intracellulære jern og heme 4. Biosyntesen av heme kan påvirkes av genetiske defekter, tilgjengelighet av visse mineraler og vitaminer (for eksempel, riboflavin, sink), eksponering for giftstoffer (for eksempel, aluminium, bly), Anoksi, feber, og nivåer av visse steroider (f.eks østrogen) 32-35. Nivået av heme syntese forandres i ulike tilstander syke. Redusert heme biosyntesen kan føre til anemi samt nevrologiske sykdommer 3,36. Alternativt spiller øket heme biosyntese en viktig rolle i progresjon av visse kreftformer 28,37. Heme har vist seg å være kritisk for vekst, differensiering og overlevelse hos pattedyr adipose, erytroide og nevronale celler 4,38-41. For eksempel fører til heme mangel neurite skader i muse kortikale nevroner via inhibering av glutamat NMDA (N-metyl-D-aspartat) reseptorer 17. I tillegg hemming av heme-syntesen fører til programmert celledød i menneske epithelial cervix carcinoma HeLa-celler 26,41. Derfor måle heme biosyntese-nivåer i forskjellige celler under forskjellige forhold er viktig for å studere etiologi og progressipå av mange sykdommer.

Her beskriver vi en rask og følsom metode for å måle nivået av intracellulær heme syntese ved å bruke [4- 14 C] 5-aminolevulic syre. Dette er en alternativ metode til andre metoder som bruker 55 eller 59 Fe Fe. Vi foretrekker å bruke 14 C fordi dens stråling er meget svak. I kontrast er sterk beskyttelse som kreves for å arbeide med Fe isotoper. Videre er denne fremgangsmåte beregnet til å måle og sammenligne heme syntese i forskjellige celler i parallell på en rask måte. For å måle absolutte heme nivåer, kan man anvende den tidligere etablerte metoden involverer bruk av HPLC 42,43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

FORSIKTIG: Mens han jobbet med radioaktivitet, ta nødvendige forholdsregler for å unngå forurensning av eksperimentator og omgivelsene. Disponere av alt avfall etter lokale retningslinjer strålingssikkerhet.

1. Utarbeidelse av celler

  1. Seed celler i 3,5 cm plater, slik at sammenflytning når 80% -90% på dagen for analysen.
    1. Legg merke til at såing sammenflyting for celler er avhengig av celletype og deres vekst. Ved behandling av cellene med et reagens for et bestemt antall dager, frø celler slik at sammenflytning er 80% -90% på dagen av måling av heme. Dersom antall celler oppnådd fra 3,5 cm plater ikke er tilstrekkelig, brukes 6 cm plater med samme mengde radioaktivt ALA som i det neste trinn.
      Merk: Bruk av individuelle plater er anbefalt, fordi det er lettere å håndtere individuelle plater.
  2. En dag før målingen heme, tilsett 0,1-0,3 uCi [14C] 5-ALA ALA og kaldt for å nå en endelig concentration på 20 mikrometer av total ALA til hver kultur tallerken i et arbeidsområde fit for arbeid med radioaktivt materiale og sette platene tilbake i inkubatoren. Ideelt sett inkuberes med radioaktivt ALA i 16 timer.
    Note: Radiomerket 5-ALA kreves kan variere mellom cellelinjer. En radioaktiv telling per minutt (cpm) på minst 100 er nødvendig for å minimalisere feil i forbindelse med telling. Det er tilrådelig å bestemme en minimumsmengde av [14C] 5-ALA som er nødvendig for cellelinjer som ble studert. For de fleste eksperimenter 0,1-0,3 uCi er tilstrekkelig til å få en god måling. Tilsetting av kaldt ALA er valgfritt.

2. Heme Utvinning

  1. Plasser cellekultur retter på is og ta dem til området passer for radioaktivitet arbeid.
    1. Utfør hele ekstraksjon og fordampning prosessen i en eksplosjon-bevis hette. Fordi den lagrede eter kan eksplodere, bruker eter i små flasker og fordampe eventuelle gjenværende væske, lagrer ikke eter ien åpen flaske i mer enn én måned. Ikke bruk aceton i nærheten av åpen ild eller ovner som det er meget brannfarlig. Butikk aceton inneholder reagenser i glassflasker som det oppløses vevskulturstudier plast.
  2. Aspirer av medium med en pipette. Vask celler en gang med 1 ml kald PBS 1x. Aspirer av PBS.
  3. Tilsett 1 ml kald PBS 1x til platene og samle cellene i bunnen av platen ved hjelp av en gummispatel. Overfør de innsamlede celler fra hver plate til en merket på forhånd avkjølt 2 ml tube. Samle alle celler i 2 ml rør.
    Merk: Bruk en fersk gummi politimann for hver plate for skraping celler fra hver plate. For hver plate ville du kreve fire 2 ml rør, en 1,5 ml tube og en scintillasjonsflaske.
  4. Sentrifugering ved 15 000 xg i 1 min ved 4 ° C.
  5. Ta ut PBS ved hjelp av en pipette, gi en kort sentrifugering og fjerne rest PBS. Resuspender celler i 100 ul av 1 x PBS. Vortex å suspendere celler og holde på is.
  6. Ta 10 &# 956; l fra trinn 5 og overføring til en 1,5 ml mikro rør og butikk på isen for å måle protein konsentrasjon.
    Merk: Cellelyseringsbuffer bør tilsettes til cellene og holdt på is for å måle proteinkonsentrasjon senere.
  7. Spinn de resterende 90 pl fra trinn 5 ved 5000 xg i 30 sek ved 4 ° C; fjerne PBS fullstendig ved en 200 mL pipette tips.
  8. Tilsett 300 ul av heme ekstraksjon buffer (se Materialer List) til hvert rør. Deretter vortex i 15 sek å mikse og lagt på is for 1 min, gjenta dette 3 ganger.
    1. Legg heme ekstraksjonsbuffer (He) og vortex tube raskt å resuspendere pelleten, ikke bare en eller to rør på en gang, fordi pellets skal resuspenderes raskt uten å bli stående i den HEB for lenge. Når HEB tilsettes til alle rørene, og pelleten resuspenderes deretter følger 15 sek vortex og 1 min på is syklus som i trinn 8. Legg merke til at pellet ikke kan gå helt inn i HEB hvis pelleten er igjen i HEB buffer for en lengertid og ikke resuspenderes raskt.
  9. Tilsett 1,2 ml dietyleter til hvert rør og virvle i 30 sek. Sentrifugering ved 15 000 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
    Merk: Diethylether går tom for pipetter raskt. For å kontrollere dette, pipette dietyleter opp og ned en gang eller to, gjør dette hjelper holde dietyleter i pipetten. Gjenta dette hver gang en ny pipettespiss er brukt.
  10. Overføringstopp (eter) fase med 1 ml pipette til et nytt mikrosentrifugerør. Legg 0,5 ml 2 N HCl, vortex å mikse og spinn som i trinn 9.
    Merk: Det er vanskelig å se skillet mellom eter og HCl faser. Derfor tilsette små mengder av Trypan blått i 2 N HCl-løsning som skal brukes i løpet av forsøket, nok til å gi den en svakt blå farge. Dette vil bidra til å skille de to faser. Den nedre fase blir blå og den øvre eterfasen blir fargeløs. Overfør den øvre fargeløse eterfasen til et nytt rør og kast den nedre HCl (blå) fase.
  11. Gjenta trinn 10 toflere ganger for å vaske eterfasen med 2 N HCl. Overfør bare det øverste eterfasen til et nytt rør i løpet av hver repetisjon og kast den nedre HCl fase.
  12. Etter den tredje vasking med HCl, overføre den øverste fase med 1 ml pipette til et scintillasjonsglass. Tørk prøvene ved fordamping av dietyleter ved å holde prøvene i den kjemiske hette O / N.

3. Måling av radioaktivitet

  1. Neste dag, tilsett 5 ml scintillasjonsvæske til de tørkede prøver fra trinnet 2.12.
  2. Rist godt for å blande. Måle radioaktiviteten ved anvendelse av en scintillasjonsteller.

4. Beregninger

  1. Lysere cellene fra trinn 2,6 ved hjelp av like mengder av CelLytic M buffer (se Materialer liste) og sentrifugering ved 14.000 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
  2. Ta en porsjon av supernatanten og måle proteinkonsentrasjonen ved hjelp av BCA-proteinanalysesett.
    Total mengde protein i mg (TP) = (90 ul * kons. Av protein i81; g / il) / 1000
    Heme syntese nivå (radioaktivitet / TP) = pmol / mg protein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne metoden ble anvendt for å sammenligne nivåene av heme-syntese i normal (HBEC30KT) vs. kreft (HCC4017) lungeceller. Figur 2 viser et høyere nivå av heme-syntese i kreftceller (HCC4017) enn normale lungeceller (HBEC30KT). Nivået av heme-syntese ble også målt i normale og kreftceller i nærvær av mitokondriell uncoupler karbonyl cyanid 3-chlorophenylhydrazone (CCCP). Celler ble behandlet med 10 uM CCCP i 24 timer før målingen av heme syntese nivåer. Som forventet, vil nivået av heme-syntese (figur 2) ble redusert i nærvær av CCCP i både normale celler og kreftceller. Det er vist tidligere at heme syntese kan inhiberes av succinyl aceton (SA), en potent og spesifikk inhibitor av 5-aminolevulinsyre-dehydratase (ALAD) som er den andre enzym i heme biosyntetiske rute 41. Ved hjelp av denne metode ble de hemesyntese nivåene målt i HeLa-celler i nærvær og abshet på 0,5 mM SA. Figur 3 viser at nivåene av heme syntese redusert med mer enn 10-folder i nærvær av SA. For ytterligere å demonstrere bruken av denne teknikk, ble nivåene av heme syntese måles og sammenlignes i 4 kreft og i HEK293T cellelinjer som vist i figur 4.

Figur 1
Figur 1. heme biosyntesebanen hos mennesker akk, 5-aminolevulinsyre-syntase.; 5-ALA, 5-aminolevulinsyre; ALAD, ALA dehydratase; PBG, porphobilinogen; HMBS, hydroxymethylbilane syntase; HMB, hydroxymethylbilane; UROS, uroporfyrinogen III syntase; UPgenIII, uroporfyrinogen III; UROD, uroporfyrinogen decarboxylase; CPgenIII, coproporphyrinogen III; CPOX, coproporphyrinogen III oxidase; PPgenIX, protoporfyrinogen IX; PPOX, protoporfyrinogen IX oksidase; PpIX, protoporfyrin IX; FECH, Ferrochelatase. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Nivåene av heme biosyntesen i normal (HBEC30KT) og kreft (HCC4017) cellelinjer, i fravær og nærvær av 10 uM mitokondriell uncoupler CCCP. Bakgrunnsnivået var lik nivået av blindprøve (scintillasjonsvæske alene) og den var mindre enn 2% av kontrollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Nivåer av heme biosyntesen i HeLa celler i abshet og nærvær av 0,5 mM av heme syntese inhibitor succinyl aceton (SA). Celler ble behandlet med SA for 3 dager før måling av heme. Bakgrunnsnivået var lik nivået av blindprøve (scintillasjonsvæske alene), og det var mindre enn 2% av kontrollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. En sammenligning av nivåene av heme biosyntese i 4 kreft og HEK293T cellelinjer. Analysen ble utført i henhold til protokollen. HCC4017 ble dyrket i media ACL4, A549 og H1395 i RPMI1640 supplert med 5% FBS, HEK293T og HeLa i DMEM supplert med 10% FBS. For statistisk analyse ble heme syntese nivåer i kreftceller og HEK293T celler i forhold til heme syntesen nivå i HCC4017 celler, ved hjelp av Welch to-utvalgs t-test. **, P-verdi <0,005. Bakgrunnsnivået var lik nivået av blindprøve (scintillasjonsvæske alene), og det var mindre enn 2% av kontrollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Heme spiller en nøkkelrolle i den generasjonen av mobilnettet energi via respirasjon 26. Altered heme metabolisme er kjent for å være assosiert med ulike sykdommer, inkludert kreft 28,41. Hemming av heme-syntesen er kjent for å forårsake cellesyklus og apoptose i Hela celler 26,41. Det er blitt vist at høy heme syntese nivå er forbundet med progresjon av lungekreftceller 28. Derfor ville det være av stor betydning for å måle nivåene av heme biosyntese i celler under forskjellige forhold. Metoden beskrevet her ikke kvantifisere den totale mengden av heme derfor, gir den ikke den absolutte verdi av heme til stede i cellene. Det finnes en rekke kolorimetriske metoder og sett som er tilgjengelige for å måle den samlede heme i cellene. For eksempel kan hem ekstraheres fra celler og mitokondrier i en blanding av aceton og HCl, og blandet med 50% (v / v) acetonitril. Deretter ble blandingen kan påførestil en 3,9 x 300 mm C18 Bondclone kolonnen, etterfulgt av eluering av heme i en gradient av acetonitril inneholdende 0,05% (v / v) trifluoreddiksyre og identifisering av heme forbindelser ved 400 nm 44,45.

Tidligere, for å måle nivåene av heme biosyntese i pattedyr-vev og celleekstrakter [14C] -glycin og [14C] 5- ALA ble brukt 46,47. Selv om merket glycin entrer heme biosyntesebanen ved det første trinnet, men den tappes av andre metabolske baner som resulterer i den begrensede inkorporering i heme. Glycin er ikke et spesifikt metabolitt for heme biosyntesebanen 48. På den annen side, merket 5-ALA er spesifikk for heme biosyntesebanen. Denne funksjonen overfører en kvantitativ nytte av å bruke 5-ALA i løpet glysin 46,48,49. Derfor er bruk av radioaktivt 5-ALA en mer konkret og nøyaktig metode for å måle og sammenligne nivåer av heme biosyntese.

De fleste critical tiltak for å få konsistente resultater er: 1) sørge for at cellen confluency ikke gå høyere enn 100% og ikke under 70% på tvers av ulike forhold; 2) mengden av radioaktivitet tilsatt per plate bør være identiske, fordi denne metoden er meget følsom; 3) heme utvinning buffer bør ikke være gamle, anbefales det å lage fersk hver gang. Volumet av radioaktivitet som kreves per plate er meget liten, og det er vanskelig å opprettholde de samme mengder over prøvene. Derfor anbefales det å foreta en arbeidsstamløsning i kulturmediet, ved bruk av det samme medium for alle prøvene, kan ellers PBS (fosfatbufret saltvann) benyttes. Arbeider stamløsning kan fremstilles på en slik måte at volumet dispenseres per plate er under 10 pl. Også, for å være mer nøyaktig, kan mediet fra duplikate prøver for en tilstand tas ut i et 50 ml rør, og de passende mengder av radioaktivitet kan tilsettes fra arbeidsstamløsning, deretter dispensere tilbake equal mengder av medium til platene. Dersom antall celler er begrenset, slik som i primære kulturer, kan 12-brønn eller 24-brønners plater bli anvendt for å dyrke cellene, og redusere mengden av radioaktivitet tilsatt per brønn proporsjonalt.

Denne protokollen er grei, enkel og gir nøyaktige målinger av nivåene av heme syntese. Noen ganger kan det være vanskelig å cellepelleten suspenderes i heme ekstraksjonsbuffer (trinn 2.8) fullstendig. For å unngå dette være rask i trinn 2.8, legge heme utvinning buffer til 1-2 prøver på en gang, Vortex og sette dem på is. Kontroller at heme utvinning buffer ikke er for gammel. Hvis standardavviket blant replikere prøvene er for høy, ta hensyn til følgende: 1) PBS ble fjernet helt i trinn 2.7; 2) unngå å søle prøven når i dietyleter fase, følg tipset i trinn 2.9; 3) sørge for at radioaktiviteten lagt per plate og confluency av replikere prøvene var de samme.

28 i normal ikke-ondartet (HBEC) mot kreft (HCC) celler, som er utviklet fra den samme pasient. Teknikken som er beskrevet her krever bruk av [14C] 5-ALA, en forløper i heme biosyntesebanen (figur 1), og måler radioaktiviteten inkorporert i heme. I denne teknikken, porfyriner, inkludert heme, ble ekstrahert fra cellene i en blanding av aceton, konsentrert HCl og vann 50,51. Heme ble ytterligere separert fra porfyriner ved å trekke ut i dietyleter og vasking av eterfasen med 2 N HCl 50,51. Deretter ble radioaktiviteten inkorporert i heme bestemt ved anvendelse av en scintillasjonsteller. Resultatene kan normaliseres ved den totale mengden av protein eller celle nummer. Heme syntese i HeLa-celler ble inhibert ved hjelp av succinyl aceton (SA) og en reduksjon i nivået av heme-syntese ble observert som vist prefra stillingen 26 (figur 3).

Denne fremgangsmåte er meget nyttig for å sammenligne nivåene av heme syntese under forskjellige forhold eller mellom cellelinjer (figur 4). Det krever et lite antall celler, og gir spesifikk måling og sammenligning av nivåene av heme syntese i forskjellige celler. Den er ikke beregnet for nøyaktig måling av absolutte heme nivåer i cellene. Det er best anvendt for å sammenligne nivåene av heme-syntesen i celler med forskjellige egenskaper, for eksempel ulike kreftceller. Fordi kobolt, i stedet for jern, kan innarbeides i heme i det siste trinnet i syntesen heme og ekstraheres 51, kan denne metoden ikke gi nøyaktig sammenligning av heme-syntesen, hvis vekstmedier inneholder forskjellige nivåer av kobolt eller andre metallioner. Ikke desto mindre er heme syntetiske metode fra 5-aminolevulinsyre til porfyriner og heme meget spesifikke, måle fluksen nivåene av hele pathway er sannsynlig å være mer reflekterende av metabolske aktiviteter som er relevante til heme, uavhengig av metallionene. I motsetning til metoden ved hjelp av 59 Fe detekterer kun den del av veien som omfatter Fe heme for å danne 52. Selv om dette er mer spesifikt, i nærvær av signifikante nivåer av metallioner, kan de detekterte hemesyntesenivået ikke nødvendigvis den metabolske potensialet av visse celler, slik som kreftceller. Videre kan Fe fanges og lagres i andre cellulære steder ved siden av mitokondrier å gjøre heme. I det store og vi tror at bruken av [4- 14 C] 5-ALA er en mer praktisk fremgangsmåte for å måle nivå heme ved sammenligning av forskjellige celler med varierende egenskaper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

De HCC4017 og HBEC30KT cellelinjer ble vennlig levert av Dr. John Minna laboratorium. Dette arbeidet ble støttet av Cecil H. og Ida Grønne midler til Dr. Li Zhang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma 650501
Diethy ether Sigma 296082
HCl (Hydrochloric acid) Fisher A481-212
Liquid Scintillation cocktail  MP Biomedicals 882470
Trypan blue Gibco 15250
Radiolabeled 4-14C aminolevulinic acid Perkin-Elmer life sciences Store at -80 °C
CelLytic M Sigma C2978 Mammalian cell lysis reagent
Pierce BCA Protein Assay Kit  Thermo Scientific 23227
Specific reagent Component Dispense
Heme extraction buffer:
Acetone:HCl:Water (25:1.3:5)		 Acetone
Concentrated HCl
Water		 25 ml
1.3 ml
5 ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Furuyama, K., Kaneko, K., Vargas, P. D. Heme as a magnificent molecule with multiple missions: heme determines its own fate and governs cellular homeostasis. Tohoku J Exp Med. 213, 1-16 (2007).
  2. Hamza, I., Dailey, H. A. One ring to rule them all: trafficking of heme and heme synthesis intermediates in the metazoans. Biochim Biophys Acta. 1823, 1617-1632 (2012).
  3. Zhu, Y., Hon, T., Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency interferes with the Ras-mitogen-activated protein kinase signaling pathway and expression of a subset of neuronal genes. Cell Growth Differ. 13, 431-439 (2002).
  4. Zhang, L. HEME BIOLOGY: The Secret Life of Heme in Regulating Diverse Biological Processes. Singapore: World Scientific Publishing Company. , (2011).
  5. Mense, S. M., Zhang, L. Heme: a versatile signaling molecule controlling the activities of diverse regulators ranging from transcription factors to MAP kinases. Cell Res. 16, 681-692 (2006).
  6. Ingram, D. J., Kendrew, J. C. Orientation of the haem group in myoglobin and its relation to the polypeptide chain direction. Nature. 178, 905-906 (1956).
  7. Perutz, M. F. X-ray analysis of hemoglobin. Science. 140, 863-869 (1963).
  8. Chance, B. The nature of electron transfer and energy coupling reactions. FEBS Lett. 23, 3-20 (1972).
  9. Guengerich, F. P., MacDonald, T. L. Mechanisms of cytochrome P-450 catalysis. Faseb J. 4, 2453-2459 (1990).
  10. Igarashi, K., et al. Multivalent DNA binding complex generated by small Maf and Bach1 as a possible biochemical basis for beta-globin locus control region complex. J Biol Chem. 273, 11783-11790 (1998).
  11. Ogawa, K., et al. Heme mediates derepression of Maf recognition element through direct binding to transcription repressor Bach1. Embo J. 20, 2835-2843 (2001).
  12. Oyake, T., et al. Bach proteins belong to a novel family of BTB-basic leucine zipper transcription factors that interact with MafK and regulate transcription through the NF-E2 site. Mol Cell Biol. 16, 6083-6095 (1996).
  13. Snyder, S. H., Jaffrey, S. R., Zakhary, R. Nitric oxide and carbon monoxide: parallel roles as neural messengers. Brain Res Brain Res Rev. 26, 167-175 (1998).
  14. Sun, J., et al. Hemoprotein Bach1 regulates enhancer availability of heme oxygenase-1 gene. Embo J. 21, 5216-5224 (2002).
  15. Zhang, L., Guarente, L. Heme binds to a short sequence that serves a regulatory function in diverse proteins. Embo J. 14, 313-320 (1995).
  16. Hon, T., Lee, H. C., Hu, Z., Iyer, V. R., Zhang, L. The heme activator protein Hap1 represses transcription by a heme-independent mechanism in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 169, 1343-1352 (2005).
  17. Chernova, T., et al. Neurite degeneration induced by heme deficiency mediated via inhibition of NMDA receptor-dependent extracellular signal-regulated kinase 1/2 activation. J Neurosci. 27, 8475-8485 (2007).
  18. Chernova, T., et al. Early failure of N-methyl-D-aspartate receptors and deficient spine formation induced by reduction of regulatory heme in neurons. Mol Pharmacol. 79, 844-854 (2011).
  19. Sengupta, A., Hon, T., Zhang, L. Heme deficiency suppresses the expression of key neuronal genes and causes neuronal cell death. Brain Res Mol Brain Res. 137, 23-30 (2005).
  20. Smith, A. G., Raven, E. L., Chernova, T. The regulatory role of heme in neurons. Metallomics. 3, 955-962 (2011).
  21. Raghuram, S., et al. Identification of heme as the ligand for the orphan nuclear receptors REV-ERBalpha and REV-ERBbeta. Nat Struct Mol Biol. 14, 1207-1213 (2007).
  22. Wu, N., Yin, L., Hanniman, E. A., Joshi, S., Lazar, M. A. Negative feedback maintenance of heme homeostasis by its receptor Rev-erbalpha. Genes Dev. 23, 2201-2209 (2009).
  23. Yin, L., et al. Rev-erbalpha, a heme sensor that coordinates metabolic and circadian pathways. Science. 318, 1786-1789 (2007).
  24. Zhu, Y., Hon, T., Zhang, L. Heme initiates changes in the expression of a wide array of genes during the early erythroid differentiation stage. Biochemical and biophysical research communications. 258, 87-93 (1999).
  25. Yao, X., Balamurugan, P., Arvey, A., Leslie, C., Zhang, L. Heme controls the regulation of protein tyrosine kinases Jak2 and Src. Biochemical and biophysical research communications. 402, 30-35 (2010).
  26. Ye, W., Zhang, L. Heme controls the expression of cell cycle regulators and cell growth in HeLa cells. Biochem and biophys res comm. 315, 546-554 (2004).
  27. Hooda, J., Shah, A., Zhang, L. Heme, an essential nutrient from dietary proteins, critically impacts diverse physiological and pathological processes. Nutrients. 6, 1080-1102 (2014).
  28. Hooda, J., et al. Enhanced heme function and mitochondrial respiration promote the progression of lung cancer cells. PloS one. 8, e63402 (2013).
  29. Atamna, H., Walter, P. B., Ames, B. N. The role of heme and iron-sulfur clusters in mitochondrial biogenesis, maintenance, and decay with age. Arch Biochem Biophys. 397, 345-353 (2002).
  30. Atamna, H., Killilea, D. W., Killilea, A. N., Ames, B. N. Heme deficiency may be a factor in the mitochondrial and neuronal decay of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14807-14812 (2002).
  31. Ponka, P. Cell biology of heme. Am J Med Sci. 318, 241-256 (1999).
  32. Brawer, J. R., Naftolin, F., Martin, J., Sonnenschein, C. Effects of a single injection of estradiol valerate on the hypothalamic arcuate nucleus and on reproductive function in the female rat. Endocrinol. 103, 501-512 (1978).
  33. Daniell, W. E., et al. Environmental chemical exposures and disturbances of heme synthesis. Environ Health Perspect. 105, Suppl 1. 37-53 (1997).
  34. Kihara, T., et al. Hepatic heme metabolism in rats with fever induced by interleukin 1beta. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 104, 115-126 (1999).
  35. Vijayasarathy, C., Damle, S., Prabu, S. K., Otto, C. M., Avadhani, N. G. Adaptive changes in the expression of nuclear and mitochondrial encoded subunits of cytochrome c oxidase and the catalytic activity during hypoxia. Eur J Biochem. 270, 871-879 (2003).
  36. Anderson, K. E. S. S., Bishop, D. F., Desnick, R. J. Disorders of heme biosynthesis: X-linked sideroblastic anemia and the porphyrias. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. , The McGraw-Hill Companies, Inc. New York. 1-53 (2009).
  37. Salvo, M. L., Contestabile, R., Paiardini, A., Maras, B. Glycine consumption and mitochondrial serine hydroxymethyltransferase in cancer cells: the heme connection. Med Hypotheses. 80, 633-636 (2013).
  38. Ishii, D. N., Maniatis, G. M. Haemin promotes rapid neurite outgrowth in cultured mouse neuroblastoma cells. Nature. 274, 372-374 (1978).
  39. Padmanaban, G., Venkateswar, V., Rangarajan, P. N. Haem as a multifunctional regulator. Trends Biochem Sci. 14, 492-496 (1989).
  40. Rutherford, T. R., Clegg, J. B., Weatherall, D. J. K562 human leukaemic cells synthesise embryonic haemoglobin in response to haemin. Nature. 280, 164-165 (1979).
  41. Ye, W., Zhang, L. Heme deficiency causes apoptosis but does not increase ROS generation in HeLa cells. Biochemical and biophysical research communications. 319, 1065-1071 (2004).
  42. Bonkovsky, H. L., et al. High-performance liquid chromatographic separation and quantitation of tetrapyrroles from biological materials. Anal Biochem. 155, 56-64 (1986).
  43. Sinclair, P. R., Gorman, N., Jacobs, J. M. Measurement of heme concentration. Curr Protoc Toxicol. 8, Unit 8.3 (2001).
  44. Barros, M. H., Carlson, C. G., Glerum, D. M., Tzagoloff, A. Involvement of mitochondrial ferredoxin and Cox15p in hydroxylation of heme O. FEBS Lett. 492, 133-138 (2001).
  45. Shinjyo, N., Kita, K. Up-regulation of heme biosynthesis during differentiation of Neuro2a cells. J Biochem. 139, 373-381 (2006).
  46. Israels, L. G., Yoda, B., Schacter, B. A. Heme binding and its possible significance in heme movement and availability in the cell. Ann N Y Acad Sci. 244, 651-661 (1975).
  47. Yannoni, C. Z., Robinson, S. H. Early-labelled haem in erythroid and hepatic cells. Nature. 258, 330-331 (1975).
  48. Robinson, S. H. Formation of bilirubin from erythroid and nonerythroid sources. Semin Hematol. 9, 43-53 (1972).
  49. Granick, S., Granick, D. Nucleolar necklaces in chick embryo myoblasts formed by lack of arginine. J Cell Biol. 51, 636-642 (1971).
  50. Morell, D. B., Barrett, J., Clezy, P. S. The prosthetic group of cytochrome oxidase. 1. Purification as porphyrin alpha and conversion into haemin alpha. Biochem J. 78, 793-797 (1961).
  51. Sinclair, P., Gibbs, A. H., Sinclair, J. F., de Matteis, F. Formation of cobalt protoporphyrin in the liver of rats. A mechanism for the inhibition of liver haem biosynthesis by inorganic cobalt. Biochem J. 178, 529-538 (1979).
  52. Chung, J., Haile, D. J., Wessling-Resnick, M. Copper-induced ferroportin-1 expression in J774 macrophages is associated with increased iron efflux. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 2700-2705 (2004).

Tags

Molecular Biology Heme heme syntese nivå pattedyrceller [4- cancer
Måling av Heme Synthesis Levels i pattedyrceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hooda, J., Alam, M., Zhang, L.… More

Hooda, J., Alam, M., Zhang, L. Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (101), e51579, doi:10.3791/51579 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter