Abstract
العضلات والهيكل العظمي هو نسيج فريد من نوعه بسبب هيكلها وظيفة، الأمر الذي يتطلب بروتوكولات محددة لجمع الأنسجة للحصول على أفضل النتائج من التقييمات الوظيفية، والخلوية والجزيئية والمرضية. نظرا لدقة بعض التشوهات المرضية شهدت اضطرابات في العضلات الخلقي وإمكانية التثبيت لتتداخل مع الاعتراف من هذه الميزات، وتقييم المرضية من العضلات المجمدة هو أفضل من العضلات ثابتة عند تقييم العضلات والهيكل العظمي للمرض في العضلات الخلقي. بالإضافة إلى ذلك، فإن القدرة على إنتاج التحف تجميد شديد في العضلات يتطلب احتياطات معينة عند تجميد العضلات والهيكل العظمي للفحص النسيجي التي لا تستخدم عادة عند تجميد الأنسجة الأخرى. يصف هذا المخطوط بروتوكول للتجميد السريع للعضلات الهيكل العظمي باستخدام نظير البنتان (2-methylbutane) تبريد مع النيتروجين السائل للحفاظ على مورفولوجيا الأمثل العضلات والهيكل العظمي. هذا الإجراء هو أيضا فعالة لوreezing الأنسجة المعدة للدراسات التعبير الجيني أو البروتين. علاوة على ذلك، قمنا بدمج بروتوكول تجميد لدينا في إجراء أوسع يصف أيضا الأساليب المفضلة لفرز المدى القصير من الأنسجة ل(1) الدراسات الفنية واحد من الألياف و(2) زراعة الخلايا myoblast، مع التركيز على الحد الأدنى من الجهد اللازم لجمع الأنسجة ونقلها إلى البحوث أو مرجع مختبرات متخصصة لاستكمال هذه الدراسات. عموما، يوفر هذا المخطوط الخطوط العريضة لكيفية الأنسجة الطازجة يمكن توزيعها على نحو فعال لمجموعة متنوعة من الدراسات المظهري ويوفر إجراءات التشغيل القياسية (إجراءات العمل الموحدة) للدراسات المرضية المتعلقة بأمراض العضلات الخلقي وبالتالي.
Protocol
تسمية حاويات لاستخدامها لتخزين العضلات مع معرفات المناسبة للحيوان والعضلات المقطوع. قبل تبريد أكياس / حاويات وأدوات لمنع تجميد / الذوبان من الأنسجة عند إضافته.
1. دراسة اعتبارات التصميم لمجموعة العضلات الأنسجة
- لنماذج الحيوانات الصغيرة (الفئران) من مرض في العضلات، استخدام العضلات بأكملها للدراسة منذ نماذج حيوانية صغيرة غالبا ما تتطلب تقييم والعضلات بأكملها لتوفير ما يكفي من ليف عضلي أخذ العينات للدراسات المرضية. لالحيوانات الكبيرة (الكلاب) نماذج من مرض في العضلات، واستخدام أجزاء العضلات التي هي على الأقل 0.3 × 0.3 سم أو أكثر في مستعرض بهم (مستعرضة) الجانب.
ملاحظة: يمكن أيضا أن تستخدم الخزعات الأساسية، ولكن قد تكون دون المستوى الأمثل للدراسات توصيف الأولية بسبب قضايا أخذ العينات. - للدراسات التي تنطوي على قسيم عضلي، وقياس التركيبية من طول قسيم عضلي قد تشكل نقطة نهاية حاسمة، وربما REQUغضب المتخصصة المناولة. هذا هو عادة ذات الصلة فقط في الأمراض حيث عناصر العرض قسيم عضلي أطوال غير مناسب، كما هو الحال في بعض أسباب اعتلال عضلي خيطي. بعض المختبرات تفضل إصلاح العضلات في حالتها غير المتعاقد أو تمدد، بدلا من تنفيذ هذه القياسات على العضلات غير المتأزم أو غير امتدت.
- إذا لا تقاس طول قسيم عضلي، وإصلاح الأنسجة العضلية دون شروط مسبقة، وتمتد العضلات عن طريق وضعها مباشرة في تثبيتي EM المطلوب (انظر الكواشف).
- إذا كان سيتم قياس أطوال قسيم عضلي، يمكن استخدام عدة تقنيات إلى ما قبل امتداد العضلات (انظر مناقشة):
- استخدام جهاز لقط لعقد العضلات في التوتر يستريح في حين انها لا تزال في الحيوان، استئصال العضلات في جميع أنحاء خارج المشبك، ووضعه مباشرة في تثبيتي EM المطلوب (انظر الكواشف).
- ويعلقون تمتد العضلات على سطح (مثل قطعة من الفلين) بطول مماثلة لتلك التي لوحظت
2. تقسيم الفرعية العضلات الهيكلية معزولة في شظايا التي هي مناسبة لدراسات المرغوب (الشكل 1)
- لالأنسجة العضلية المجمدة:
- وتشمل أكبر قدر من العضلات نظرا ممكن للحد من التحيز أخذ العينات (انظر الخطوة 1.1)، ولكن ينبغي أن تكون العينات <1.5 سم لتجنب تجميد التحف.
- علاج جميع العضلات من نفس الدراسة على نحو مماثل لمنع الخلافات مصطنعة في حجم الألياف بسبب الاختلافات في التعامل معها.
- لالإلكترون المجهري (EM):
- قطع ~ 0.5 X 0.2 X 0.2 سم شريط من العضلات من العينة، مع المحور الطولي للعينة موازيا للمحور الطولي للعضلة الأصلي.
ملاحظة: سيتم تثبيتي لا تتمكن من اختراق كاف قطعة سمكا من الأنسجة، لذلك الحفاظ على سماكة العينة في 2 مم أو أقل هو أمر حاسم في الحصول على النتائج المناسبة. بالإضافة إلى ذلك،كما توجه مثل شظايا صغيرة من العضلات غالبا ما يكون صعبا، فمن المستحسن استخدام جزء من النسيج الذي يحاكي التوجه الفعلي للعضلة (أي أطول جانب من جوانب العينة الثابتة هو التوجه الطولي للعضلة / myofibers) ل تقليل التعامل والارتباك أثناء معالجة EM.
- قطع ~ 0.5 X 0.2 X 0.2 سم شريط من العضلات من العينة، مع المحور الطولي للعينة موازيا للمحور الطولي للعضلة الأصلي.
- لزراعة الخلايا:
- العائد الخلية المطلوبة قد تؤثر على كمية العضلات اللازمة لإنشاء خلية ثقافة. قد توفر العضلات واحد (أو أجزاء من العضلات) من الحيوانات الصغيرة أرقام الخلية كافية لإنشاء مزارع الخلايا، لذلك إذا لزم الأمر، والأنسجة بركة من عضلات متعددة.
3. تثبيت الأنسجة وتصنيع لالميكروسكوب الالكتروني (EM)
- وضع جزء من العضلات لا يزيد عن 2 ملم في أنحف بعدها مباشرة في تثبيتي EM المطلوب (انظر الكواشف).
- وضع العضلات في EM عازلة تثبيتي (انظر الكواشف) بعد 2-48 ساعة من fixatiعلى. تثبيت لفترات طويلة (لمدة أسابيع أو شهور) يمكن أن يؤدي إلى فقدان التفاصيل التركيبية على دراسات EM.
- إرسال إلى منشأة الأساسية EM للمعالجة.
4. تجميد العضلات لالنسيجي، الكيمياء الحيوية، والدراسات الجزيئية
- إزالة الرطوبة الزائدة في العينة بواسطة النشاف بدقة العينة مع منشفة ورقية حتى الأنسجة الملتصقة قليلا إلى منشفة. والرطوبة الزائدة إنتاج التحف تجميد كبيرة في العضلات.
ملاحظة: يمكن زيادة الأنسجة المجففة من قبل المتداول في بودرة للأطفال. هذه الخطوة هو عموما ليس من الضروري للعضلات إلا أنها كانت في بيئة رطبة بشكل مفرط. - وضع أكتوبر (أو مادة لاصقة مثل العلكة مماثلة الكثيراء) في الجزء السفلي من cryomold الضحلة أو على الفلين، مع ما يكفي فقط أكتوبر لتوفير أساس لعضلة الموجهة (الشكل 2C). وصفها الفلين أو cryomold قبل التجميد قد تكون مفيدة لتتبع عينة.
- Carefوضع مع ully العضلات في القالب في الاتجاه المطلوب، مع الغالبية العظمى من العضلات جاحظ من أكتوبر بحيث العضلات مقطوع ليست على اتصال مع أكتوبر (الشكل 2C).
- إضافة إلى نظير البنتان فنجان المعدن حتى تصل إلى عمق حوالي 3-4 سم.
- وضعت على قفازات السلامة الحرارية وإزالة غطاء ديوار.
- وضع أو الاستمرار على فنجان المعدن في اتصال مع النيتروجين السائل، لذلك أن مستوى النيتروجين السائل على السطح الخارجي للكأس هو فوق مستوى نظير البنتان في الداخل من الكأس. يتم عرض استراتيجيات لترتيب هذه الحاويات في الشكل 2.
- لا تسمح النيتروجين السائل لدخول كأس المعدنية، كما أنها تنتج رغوة محتدما التي يمكن أن تكون مرهقة للعمل مع (وأيضا الباردة كاف لتجميد).
- مراقبة نظير البنتان لتحديد عندما وصلت درجة الحرارة المناسبة. في درجة الحرارة المناسبة (على النحو الأمثل بين -140 إلى -149 درجة مئوية)، لذلكسوف غطاء الحصى البيضاء نظير البنتان المجمدة تشكل (بعد بضع دقائق، وبعد الضباب الأولي قد اختفى فوق نظير البنتان) على الجزء السفلي من الكأس، أو الحل لن رشاقته عموما إلى الاتساق من دبس السكر. سوف تجميد قبل هذه المرحلة تسفر atifacts التجمد.
- إذا كان نظير البنتان تجمد تماما الصلبة، ذوبان الجليد والبرد لانخفاض درجات الحرارة مرة أخرى قبل استخدامها لاحقا.
- باستخدام ملقط قبل المبردة، وانخفاض العينة والفلين / العفن في نظير البنتان لحوالي 10-20 ثانية.
- وضع العينة المجمدة في وعاء تبريد مسبقا.
- الحفاظ على العينات والحاويات على الثلج الجاف في جميع الأوقات حتى نقل إلى -80 ° C الفريزر.
5. إذا قطعة أثرية التجميد هو موجود في الأنسجة المجمدة بالفعل، فمن الممكن لتحسين درجة التجمد قطعة أثرية عن طريق ما يلي "ذوبان الجليد واعادة تجميد" إجراءات
- تتخذ كتل من الثلاجة، في وقت واحد، والاحتفاظ بها على الثلج الجاف. توقيت هذا البروتوكول أمر بالغ الأهمية. ذوبان الجليد فقط واعادة تجميد كتلة واحدة في وقت واحد.
- نقل عينة من الجليد الجاف لRT.
- إذا كان جزءا لا يتجزأ من العينة في أكتوبر، وإزالة أكتوبر المحيطة تماما بقدر الإمكان باستخدام مشرط.
- السماح للعينة لذوبان الجليد في RT إلى النقطة حيث يتم إذابة تماما، ولكن ليس إلى درجة حيث يتم تجفيف.
- همز بلطف العينة مع ملقط لضمان أن العينة يتم إذابة تماما قبل التقدم إلى الخطوة التالية.
- تجميد العضلات كما هو محدد في الخطوات 4،1-4،10.
6. إعداد العضلات لمسلوخ واحدة الألياف اختبار وظيفي
- الإجراء لتخزين العضلات يعتمد على عندما يتم استخدام العضلات / الألياف لإجراء التجارب.
- للاستخدام في غضون أسابيع قليلة، وضع العضلات في حل 50٪ glycerol/50٪ الاسترخاء الحل (انظر الكواشف)، وتخزينها في -20 درجة مئوية.
- للاستخدام في الخلفإيه بضعة أسابيع، وضع العضلات في حل 75٪ glycerol/25٪ الاسترخاء الحل (انظر الكواشف)، وتخزينها في -80 درجة مئوية.
- بدلا من ذلك، دعونا العضلات الجافة، دبوس لالفلين، وتخزينها على حبيبات السيليكا في -80 درجة مئوية. هذه العضلات المجففة يمكن استخدامها لسنوات.
7. إعداد العضلات الطازجة للشحنة الثقافة خلية إلى مختبرات خارج
بروتوكولات لإنشاء مزارع الخلايا وصفت جيدا في أماكن أخرى 4-7.
- ملء 50 مل العقيمة أنبوب مخروطي مع العقيمة وسائط النمو الكامل.
- إضافة إلى الأنسجة العضلية الأنبوب باستخدام ملقط معقم، غمرت تماما الأنسجة في وسائل الإعلام.
- ملء ما تبقى من أنبوب مع وسائل الاعلام لمنع جفاف أثناء الشحن.
- إضافة كمادات الثلج إلى مربع الستايروفوم ووضع أنبوب مخروطي بالقرب من العديد من كمادات الثلج.
- يرجى ملاحظة أنه فقط كمادات الثلج (وليس الثلج الجاف) وينبغي أن تستخدملمنع الأضرار الناجمة عن تجميد السائل والأنسجة.
- الحزم السفينة O / N، ولكن يمكن أن تستمر الأنسجة 2 أيام في ظل هذه الظروف.
Representative Results
لتقديم أمثلة من القطع الأثرية شهدت مع تجميد غير لائق، جمدت عدة عضلات الفخذ الماوس العضلات باستخدام تقنيات مختلفة (الشكل 3) لتكرار الأخطاء شيوعا التي تواجهها. كما هو مبين في الشكل 3A، ويظهر الهيكل العظمي والعضلات المجمدة بشكل مناسب وبدل ضيق من myofibers إلى الأنسجة المحيطة بها (عادة ألياف العضلات الأخرى، ولكن في بعض الأحيان يملأ الفضاء بين endomysial myofibers مع التليف أو خلايا التهابية في مجموعة متنوعة من الأمراض أو العمليات الإصابة) و حجرة حشوية واضحة للعيان. لتحليل المرضية، والقدرة على عرض الفضاء داخل الخلايا غالبا ما يكون أكثر أهمية من مقصورة endomysial، كما هو عادة الحرجة أن تحدد بوضوح وجود التغيرات التنكسية، والتغيرات التجدد، أو النتائج اصم الأخرى (نواة مركزية، الادراج داخل الخلايا) في هذا الفضاء. وبالتالي، فإن وجود بلورات الثلج في حجرة داخل الخلايا يمثل صباحاالمشكلة ajor في تقييم المرضية من العضلات.
تجميد السليم للأنسجة العضلات يتطلب درجات الحرارة الباردة بما فيه الكفاية وسرعة كافية من تجميد لتجنب تكوين بلورات الجليد. حتى عندما يمثل كل من العوامل، فمن الممكن أن يحدث تجميد كبيرة القطع الأثرية بسبب الرطوبة الزائدة داخل الأنسجة العضلية. واجه هذه المشكلة الأكثر شيوعا في الأنسجة العضلية التي كانت مغمورة في المياه المالحة وسبق كاف المجففة أو عندما كانت العضلات في اتصال مباشر مع وسائل الاعلام أكتوبر المتصاعدة في موقع باجتزاء (الشكل 3B، 3E). في حين أن بعض اتصال مع أكتوبر أمر لا مفر منه عادة نتيجة لعملية التركيب، وينبغي بذل كل جهد ممكن لتجنب الاتصال بين المناطق التي سيتم تقييمها تشريحيا وأكتوبر المستخدمة للتركيب. في المقابل، تجمد عينات باستخدام الفريزر -80 درجة مئوية (الشكل 3C) والنيتروجين السائل (الشكل 3D) توفير سبيل المثالق من القطع الأثرية التجميد الذي يتم انتاجه عن طريق الحرارة أو دون المستوى الأمثل سرعة التجميد. عملية التجميد البطيء عن طريق وضع النسيج في الفريزر -80 درجة مئوية واجه تقدم مثالا صارخا على تجميد قطعة أثرية. عند استخدام النيتروجين السائل، والمشكلة الرئيسية هي أن الاتصال بين النيتروجين السائل والأنسجة يؤدي إلى غمد من النيتروجين الغازي لتشكيل واجهة في الأنسجة السائل، وهذه الواجهة الغازية ليس باردا بما فيه الكفاية لإنتاج العضلات السريع تجميد 1. هذا يمكن ان تنتج قطعة أثرية تجميد كبيرة بالقرب من سطح العينة، ولكن هي المناطق الداخلية من العينة أكثر عرضة للفلاش للتجمد في معدل مناسب وربما تكون بمنأى تماما من تجميد قطعة أثرية. في حين أن الانغماس بسيطة من الأنسجة العضلية في النيتروجين السائل هو في أي مكان بالقرب مفيدة مثل عملية تجميد نظير البنتان، يمكن أن يكون مفيدا لتجميد عينات العضلات الكبيرة في الحالات التي يكون فيها نظير البنتان غير متوفر (مثل عينات التشريح السريري في المؤسسات معمختبرات علم الأمراض السريرية العضلات الخروج). النتائج باستخدام هذه الاستراتيجية عادة ما تكون أفضل عند استخدام أجزاء كبيرة من الأنسجة (> 2 سم في عدة أبعاد).
في حين تجنب القطع الأثرية تجميد يوفر نتائج النسيجي الأمثل، كما تم تطوير تقنية (وصفها في هذا التقرير) أن يعكس إلى حد كبير تجميد القطع الأثرية للسماح للتقييم الأنسجة المجمدة بطريقة غير سليمة. الأنسجة التي تم تجميدها بشكل غير صحيح (الشكل 3E) يمكن إذابة وأعيد تجميدها مرة أخرى تحت ظروف محكومة بإحكام (الشكل 3F) للسماح إعادة توزيع المياه داخل الألياف، ودرجة الحفاظ المورفولوجية التي يتم الحصول عليها يمكن أن تكون ممتازة. في تجربتنا، وهذه العملية تحافظ على مورفولوجيا الخلايا من الأنسجة إلى درجة غير عادية، لكنها غالبا ما ينتج الانفصال مصطنعة من الألياف داخل الفضاء endomysial. كما تم العثور على العديد من نقاط النهاية المرضية في الفضاء بين الخلايا وتلك الموجودة فيمساحة endomysial يتم عرضها بشكل أفضل باستخدام البقع خاصة (إما لتسليط الضوء على التليف أو لتحديد أنواع الخلايا الأخرى)، من غير المرجح أن يضعف حقا تقييم المرضية للعضلات هذه التغييرات مصطنعة.
الشكل 1. الفرز من الأنسجة للدراسات الهيكلية والوظيفية، والخلوية من العضلات والهيكل العظمي. بالاعتماد على أنواع من الدراسات المطلوبة، ويمكن معالجة الأنسجة العضلية الهيكلية التي تم جمعها في مجموعة متنوعة من الطرق لتحقيق أفضل النتائج. بروتوكولات المبينة في هذه الورقة تصف أساليب triaging أو تجهيز العينات العضلات والهيكل العظمي للدراسات خارج الموقع لتحسين النتائج التي يمكن الحصول عليها من المرافق الأساسية الخبراء.
الشكل 2 أمثلة من الأجهزة التي تستخدم لتجميد العضلات. كما هو موضح في البروتوكول، تجميد العضلات الأمثل يتطلب غمر الأنسجة العضلية في نظير البنتان التي هي في درجة حرارة التجمد الخاصة به. وسيلة آمنة وفعالة للحصول على نظير البنتان الجليد الباردة ينطوي على استخدام وعاء معدني للنظير البنتان أن يتم تبريده في ديوار المحيطة التي تحتوي على النيتروجين السائل. كما هو الحال في كثير من الأحيان ملائمة لديك كلتا يديه حرة، فإنه من الممكن استخدام هدفين مثل حلقة الوقوف (A) لاجراء الحاوية نظير البنتان في النيتروجين السائل في حين منع الخليط من السوائل اثنين. بدلا من ذلك، يمكن أيضا أن تعقد الحاويات في النيتروجين السائل يدويا (B). في كلتا الحالتين، لا ينبغي أن توضع الأنسجة في نظير البنتان حتى نظير البنتان هو تجميد واضح في الجزء السفلي من الحاوية (عادة الحصى الأبيض مبهمة ع)، ومن ثم يجب أن تكون مغمورة لمدة 10-20 ثانية للسماح للتجميد الكامل. Isopentane في درجة حرارة التجميد تنتج الحد الأدنى من "الضباب"، (أي درجة الحرارة غير كافية إذا الضباب كبيرا موجودا). مرة واحدة يتم تجميد الأنسجة، وضعه مباشرة في الحاويات المبردة قبل (وبعد ذلك مباشرة إلى برودة أو المجمد) لمنع ذوبان الجليد بعد تجميد عرضي. وينبغي أن يكون العضلات المجمدة (C) التي شنت على النحو المناسب، الغالبية العظمى من الأنسجة العضلية جاحظ من قاعدة المجمدة أكتوبر
الشكل 3. أمثلة على تجميد قطعة أثرية، وذوبان فعالة / عن تجميد. صور الممثل من (A) العضلات بشكل مناسب نظير البنتان مجمدة، (ب) تجميد العضلات بشكل مناسب في نظير البنتان، ولكن أثناء وجوده في اتصال مع أكتوبر المتوسطة المتزايدة، (C) في العضلات المجمدة في الفريزر -80 ° C، و (D (B)، والمحتوى السائل عالية من أكتوبر تنتج قطعة أثرية تجميد كبيرة في العضلات التي هي في اتصال معها، لذلك ينبغي أن تستخدم فقط الحد الأدنى من أكتوبر المطلوبة لتركيب، وينبغي أن تكون العضلات لتقييم النسيجية "دائمة خروج "من سطحه. بطء عملية التجميد باستخدام (C) الفريزر -80 درجة مئوية أو (D) النيتروجين السائل (نسبة إلى سرعة تجميد نظير البنتان في الجليد الباردة) يمكن أن يؤدي إلى إنتاج قطعة أثرية تجميد كبيرة. لوحات E و F عرض العضلات من نفس العينة أن (E) في البداية المجمدة الحالات النادرة (بسبب الإفراط في اتصال مع أكتوبر) ثم (F) إذابة وأعيد تجميدها مرة أخرى باستخدام تقنية الموضحة في هذه الوثيقة. في حين يمكن للمرء أن يلاحظ بعض الانفصال مصطنعة بين الألياف في عينة أعيد تجميدها مرة أخرى، وأنا التحسنن مورفولوجيا الخلايا من ألياف العضلات هي بادية للعيان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
العضلات والهيكل العظمي هو نسيج هيكليا وفريدة من نوعها وظيفيا، والتي تكون ضرورية للسماح للتقييم الأمثل للمعلمات الهيكلية والوظيفية إجراءات إعداد المتخصصة. بينما مجموعة متنوعة من الأنسجة يتم تجميد عادة للدراسات باثولوجية في سياقات السريرية والبحثية، وبروتوكولات لتجميد الأنسجة غير العضلات عادة ما تنطوي على الانغماس الكلي للأنسجة في OCT قبل التجميد. كما هو مبين في الشكل (3)، ومثل هذا البروتوكول هو مناسبة لتقييم المرضية من الهيكل العظمي والعضلات وحتى الآن يشبه ما يكفي لبروتوكول الموصوفة هنا أن هذا هو خطأ شيوعا التي تواجهها. الهدف من هذه الورقة هو لتوفير بروتوكول اضحة للتعامل السليم من العضلات لتجنب المشاكل من هذا القبيل. كما تم تجميع المشورة بشأن التعامل السليم مع العضلات لالفسيولوجية خارج الموقع والدراسات الخلوية وذلك في محاولة لتسهيل الحصول على البيانات عالية الجودة من خلال المختبرات الأساسية خارج في حالات عرجإعادة الدراسات في الموقع ليست الأفضل أو ممكن.
كما لوحظ في هذا البروتوكول، والعناصر التي لا غنى عنها على الاطلاق في تجهيز المناسبة من العضلات للدراسات المرضية تشمل تقليل محتوى الماء من الأنسجة، وخفض درجة الحرارة التي يتم تجميد العضلات، وزيادة السرعة التي يتم تحقيق التجميد. والرطوبة الزائدة داخل الأنسجة أو بطء المفرط للعملية التجميد (التي تنتجها درجات الحرارة غير كافية أو عن طريق عدم وجود اتصال مباشر بين وكيل وتجميد الأنسجة، كما واجه مع النيتروجين السائل) يؤدي إلى تجميد الأعمال الفنية التي يمكن أن يضعف التحليل المرضية. كما يوفر أكتوبر مصدرا إضافيا للرطوبة الأنسجة، والعديد من المختبرات استخدام مواد لاصقة أخرى مثل صمغ الكثيراء باعتبارها الركيزة التضمين. حتى في الحالات التي يتم تنفيذ تجميد مناسب، وينبغي الحرص على تجنب العينات في وقت لاحق ذوبان عن طريق الخطأ من خلال الاتصال مع حاويات أو الصكوك RT.وبالتالي، يتطلب عملية تجميد ناجحة درجة من التخطيط الذي يتضمن ما قبل تقشعر لها الأبدان من جميع الصكوك وحاويات لاستخدامها. عندما واجهت تجميد التحف، هناك طريقة وصفها هنا لاستعادة الأنسجة التي هي كافية لمعظم التقييمات المرضية. ومع ذلك، هذه الدورة تجميد / الذوبان لا تقدم الأنسجة والكمال لديه القدرة على يضعف الدراسات الجزيئية أو الأنزيمية أخرى من الأنسجة (بالإضافة إلى الوقت اللازم لإعادة تجميد الأنسجة)، وذلك باستخدام الممارسات التجميد الأولي المناسب هو الأفضل إلى حد كبير . في الحالات التي واجهت تجميد قطعة أثرية على الأنسجة ما قبل المجمدة، ومع ذلك، فإن تقنية الموضحة في هذه الوثيقة يمكن أن تكون مفيدة للغاية.
التثبيت ومعالجة الأنسجة لEM يمكن أن تقدم تحديات تقنية محددة تتطلب التخطيط المسبق لجمع الأنسجة. الخطأ الأكثر شيوعا عند جمع العينات للEM ينطوي على استخدام شظايا الأنسجة التي هي سميكة جدا لglutaraldehydه لاختراق. كما غلوتارالدهيد تخترق فقط حوالي 0.1 سم في الأنسجة العضلية من معين السطح، والرعاية التي ينبغي اتخاذها لضمان أن بعد واحد من العينات EM ليس أكثر سمكا من 0.2 سم. بالإضافة إلى ذلك، كما EM هو وسيلة ممتازة لتقييم مباشر على جهاز مقلص، وضعت بعض المحققين استراتيجيات لمرحلة ما قبل أو ما قبل التوتر تمتد العضلات قبل التثبيت للسماح للقياس عناصر مقلص في التوتر ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. ليس هناك بروتوكول قياسي لمرحلة ما قبل التوتير، ولكن تم وصفها استراتيجيتين لفترة وجيزة في هذا البروتوكول. تجدر الإشارة إلى أن محاولات التوتير قبل العضلات يمكن أن تنتج نتائج غير متوقعة ما لم يتم القيام به بطريقة محددة جدا، وأنه قد يكون من الأفضل لإصلاح العضلات في حالة الركود لمنع التغييرات مصطنعة في طول قسيم عضلي خلال غير القياسية قبل التوتير الداخلي 8،9. للعضلات التي مثل مقاييس محددة ليست ضرورية (بما في ذلك معظم بiopsies يؤديها لأغراض سريرية)، وعموما لا تبذل الجهود إلى ما قبل التوتر في العضلات، والتأثير الرئيسي على التشكل العضلات هو تباعد غير موحدة من sarcomeres في العضلات.
تمثل هذه الورقة الأولى في سلسلة لتوفير إجراءات العمل الموحدة لأداء الاختبارات في مجال أمراض العضلات الخلقية، وأنها تمثل جهود أكثر من 20 خبيرا في مجال الخلقية مرض في العضلات التي تؤدي بشكل روتيني الخلوية والجزيئية والوظيفية والفسيولوجية، و البحث المرضية. وسيتم إجراء مجموعة من إجراءات العمل الموحدة المنشورة المتاحة خلال السنة المقبلة، وتمت مناقشة البروتوكولات اللازمة والصيغ المناسبة لنشر كل في العضلات الخلقي ورشة عمل مرض اتحاد الذي عقد في نيسان من عام 2013 في واشنطن العاصمة والهدف من هذا الجهد هو توفير SOP خارطة طريق لاختبار اللازمة وتحليل العينات في مجال أمراض العضلات الخلقي ل1) توحيد الممارسات والنهاية المستخدمة في مجال عملنا كما ماوك ممكن، و2) توفير التعليم على الممارسات القياسية الجديدة للباحثين في مجال عملنا. ونحن نعتقد أن هذه الموارد سوف تسهيل دخول المحققين جديدة في مجال عملنا تحت المدروسة وبالتالي تحسين نطاق البحوث التي يمكن القيام بها. بالإضافة إلى ذلك، فإن توحيد الممارسات تكون مفيدة للغاية لمقارنة البيانات عبر الدراسات وتحديد نقاط النهاية عند تخطيط وتنفيذ التجارب قبل السريرية والسريرية.
في حين يرتبط المحور الرئيسي لهذه المقالة لتجميد وإعداد الأنسجة المناسبة لمجموعة متنوعة من الدراسات، ناقش مجموعة تعاونية لدينا أيضا نقاط النهاية مفيدة لتحليل العينات المرضية من العضلات. في الوقت الحاضر، لا يوجد إجماع رسمي على النهج التي يجب اتخاذها عند إجراء تحليل المرضية، ويتم تنفيذ مجموعة متنوعة من الدراسات المختلفة لربط الاكتشافات الجديدة إلى المنشورات السابقة لكل مرض منها. وهكذا، كنا نظن أنه سيكون من المفيداقتراح بعض المبادئ التوجيهية العامة لتخطيط النهاية المرضية في العضلات الأمراض التوصيف. قبل قياس علم الأمراض في دراسة، ينبغي وضع الفكر كبيرة في 1) طريقة قياس حجم الألياف، 2) إمكانية تشوهات الألياف من نوع معين أو آثار العلاج، 3) إمكانية تشوهات أو آثار التي يتم تقييد الى العضلات الفردية، و4) استراتيجية لقياس النتائج المرضية التي هي سمة لهذا المرض قيد الدراسة. حجم الألياف هو نقطة النهاية ضرورية لمعظم الدراسات، وللأسف هناك تباين واسعة في كيفية كميا ذلك. تقرير العديد من الدراسات هذه النتائج باستخدام أساليب القياس الكمي الآلي التي تقدمها برامج التصوير الملكية، ولكن العديد من هذه البرامج تأخذ الاختصارات (مثل افتراض أن الألياف هي الدوائر أو الحذف) التي يمكن أن تجعل هذه القياسات الآلية غير دقيقة. فمن الضروري أن نفهم كيف جعل هذه البرامج التي تعمل تلقائيا على قياسات بefore وجود الثقة في القياسات، ونحن نشجع المحققين لإدراج هذه التفاصيل في وسائل الورق. بالإضافة إلى ذلك، فإن قياس محددة تستخدم للدلالة على حجم الألياف هو متغير للغاية، وبعض القياسات هي الأفضل للآخرين 10،11. A القياس المستخدمة عادة من حجم الألياف الألياف هي منطقة مستعرضة (CSA)، وخصوصا بسبب المحققين إجراء دراسات فسيولوجية توحيد نتائجها لقياسات CSA تم الحصول عليها باستخدام أدواتها. للأسف، في حين أن وكالة الفضاء الكندية القياسات يمكن أن تعكس بدقة حجم الألياف في قطاعات عرضية مثالية، فهي تعتمد بشكل مكثف على اتجاه الألياف (إلى حد أن الألياف الطولية أو مقطوع بشكل غير مباشر، وسوف يكون قياسات CSA عالية بشكل مصطنع) والقياسات هي بالتالي ليست مثالية لحجم الألياف. والقياس الأفضل من حجم الألياف التي هي أقل اعتمادا على الألياف منطقة مستعرضة هو الحد الأدنى لقطر في فيريه (MinFeret قطر)، والذي هو قياس اله قطرها طفيفة في الخلية العضلات 12. هذا القياس هو فقط يعتمد قليلا على اتجاه الألياف وبشكل عام، هي السريرية الذهب القياسية لقياس الألياف، ويتم تشجيع المحققين على التحرك نحو استخدام هذه التقنية. يمكن في كثير من الأحيان هذه القياسات يتم باستخدام نفس البرنامج الذي يولد القياسات CSA 13، وتكون أيضا واضحة لقياس يدويا. فيما يتعلق بتقييم البيانات المرضية وفقا لنوع الألياف، محددة من العضلات، وفي سياق النتائج المرضية المتعلقة بأمراض محددة، وهذه هي القضايا التي يجب أن أقل إثارة للجدل فقط أن ينظر أثناء التخطيط للدراسة. نوع من الألياف يمكن تقييمها باستخدام تلطيخ المناعى أو أتباز، ولكن من المفيد أن نعتبر أن عضلات معينة وأنواع الحيوانات لديها خليط من أنواع معينة من الألياف هذه (مما يستلزم توقعات مختلفة واختبار الاستراتيجيات). العضلات المشاركة المرضية محددة أو فعالية العلاجيمكن أن يحدث، ووزن العضلات مجموع مقارنة مع الضوابط يمكن أن تستخدم لتحديد درجة عدم التجانس من المرض قبل البت في العضلات لتقييم مرضي. أخيرا، فمن المعروف جيدا أن العديد من الأمراض العضلات ترتبط مع تشوهات مرضية محددة (مثل قضبان خيطي في اعتلال عضلي خيطي) 14،15، ولذا فمن المفيد أيضا أن ينظر فيما إذا وجدت هذه التشوهات في الألياف من نوع أو العضلات توزيع محددة عند إجراء تحليل 16،17. الكلي، في حين أننا لا نقترح مجموعة مرنة من معايير لتقييم العضلات، ونحن لا نعتقد أن هذه المسائل ينبغي النظر قبل أداء الدراسات المرضية في أي مرض في العضلات والهيكل العظمي.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For tissue freezing | |||
| Liquid nitrogen dewar with a liquid withdrawal device | Custom Biogenic Systems | Lab-5 Series | Any other liquid nitrogen dewar could substitute. |
| Cold-conductive container | Fisher | 02-583A | |
| Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen | Nalgene | 4150-2000 | |
| Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer | Thomas Scientific | 1228Y01 | Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing. |
| For single fiber functional testing | |||
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11 | |
| Sylgard coating | Ellsworth Adhesives | 3-6636 | |
| Dissection stereomicroscope | Harvard Apparatus | 693101 | Any other dissection microscope could substitute. |
| For cell culture | |||
| Sterile laminar flow hood | Thermo Scientific | 51022485 | Any other cell culture hood could substitute. |
| For tissue freezing | |||
| Plastic bags/containers | Nasco | B01009WA | |
| Thermal safety gloves | Denville | G4162 | |
| Face shield | Fisher Scientific | S47640 | |
| Long forceps | Fisher Scientific | 12-460-807 | |
| Marker | Staples | 125328 | |
| For cell culture | |||
| Sterile 50 ml conical tubes | Denville | C1060-P | |
| PES filter unit, 500 ml, 0.22 µm | Denville | F5227 | |
| Sterile forceps | Fisher Scientific | 644320 | |
| Ice packs | Fisher Scientific | NC9909223 | |
| Insulated styrofoam box | Polar Tech | 207F | |
| Packing tape | Staples | 795570 | |
| Tissue freezing | |||
| Liquid nitrogen | Airgas | NI NF160LT350 | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma | M32631-4L | Store Isopentane in a flammable materials cabinet. |
| EM fixative (choose one) | The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM. | ||
| 2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 16537-15 | |
| Karnovsky's fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer) | Electron Microscopy Sciences | 15732-10 | |
| For functional studies (if desired) | |||
| Relaxing solution, containing (in mmol/L) | |||
| 40 BES | Sigma | B9879 | |
| 10 EGTA | Sigma | E4378 | |
| 6.56 MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| 5.88 Na-ATP | Sigma | A3377 | |
| 1.0 DTT | RPI | D11000 | |
| 46.35 K-propionate | Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1 | ||
| 15 creatine phosphate, pH 7.0 | Sigma | P7936 | |
| 0.4 leupeptin | Calbiochem | 10895 | |
| 0.1 PMSF | Sigma | P7676 | |
| Skinning solution, containing | |||
| Relaxing solution (See Above) | |||
| 0.5% Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Indicating silica granules | |||
| Flat pieces of cork (1 x 1 inch) | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| For cell culture (if desired) | |||
| Complete Growth Medium, containing (for 500 ml) | Sterilize by filtering the solution through a 500 ml 0.22 µm PES filter unit. Store at 4°C and use within 1 month. | ||
| 395 ml of high glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D5671 | |
| 100 ml of fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F6178 | |
| 5 ml of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG) | Sigma | G1146 | |
| See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications |
References
- Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. 15, Elsevier. 407-442 (2007).
- Lawlor, M. W., et al. Enzyme replacement therapy rescues weakness and improves muscle pathology in mice with X-linked myotubular myopathy. Hum Mol Genet. 22, 1525-1538 (2013).
- Talmadge, R. J., Roy, R. R. Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms. J Appl Physiol. 75, 2337-2340 (1993).
- Blau, H. M., et al. Differentiation properties of pure populations of human dystrophic muscle cells. Exp Cell Res. 144, 495-503 (1983).
- Lawlor, M. W., et al. Myotubularin-deficient myoblasts display increased apoptosis, delayed proliferation, and poor cell engraftment. Am J Pathol. 181, 961-968 (2012).
- Pavlath, G. K., Gussoni, E. Human myoblasts and muscle-derived SP cells. Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).
- Webster, C., Blau, H. M. Accelerated age-related decline in replicative life-span of Duchenne muscular dystrophy myoblasts: implications for cell and gene therapy. Somat Cell Mol Genet. 16, 557-565 (1990).
- Ottenheijm, C. A., et al. Thin filament length dysregulation contributes to muscle weakness in nemaline myopathy patients with nebulin deficiency. Hum Mol Genet. 18, 2359-2369 (2009).
- Witt, C. C., et al. Nebulin regulates thin filament length, contractility, and Z-disk structure in vivo. EMBO J. 25, 3843-3855 (2006).
- Garton, F., et al. Validation of an automated computational method for skeletal muscle fibre morphometry analysis. Neuromuscul Disord. 20, 540-547 (2010).
- Kim, Y. J., et al. Fully automated segmentation and morphometrical analysis of muscle fiber images. Cytometry A. 71, 8-15 (2007).
- Lawlor, M. W., et al. Inhibition of activin receptor type IIb increases strength and lifespan in myotubularin-deficient mice. Am J Pathol. 178, 784-793 (2011).
- Mula, J., et al. Automated image analysis of skeletal muscle fiber cross-sectional area. J Appl Physiol. 114, 148-155 (2013).
- Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. , Elsevier. 407-442 (2007).
- Nance, J. R., et al.
- Clarke, N. F., et al. Mutations in TPM3 are a common cause of congenital fiber type disproportion. Ann Neurol. 63, 329-337 (2008).
- Lawlor, M. W., et al. Mutations of tropomyosin 3 (TPM3) are common and associated with type 1 myofiber hypotrophy in congenital fiber type disproportion. Hum Mutat. 31, 176-183 (2010).
