Abstract
Skeletspier is een uniek weefsel vanwege zijn structuur en functie, welke specifieke protocollen voor weefselverzameltoestel vereist om optimale resultaten te verkrijgen van functionele, cellulaire, moleculaire en pathologisch evaluaties. Door de subtiele pathologische afwijkingen gezien bij aangeboren spieraandoeningen en het potentieel voor fixatie interfereert met de opname van deze functies, pathologisch onderzoek van bevroren spier voorkeur vaste spier bij de beoordeling skeletspier van aangeboren spierziekte. Bovendien, het potentieel om ernstige bevriezing artefacten in de spieren produceren vereist specifieke voorzorgsmaatregelen bij het invriezen van skeletspieren voor histologisch onderzoek die niet vaak worden gebruikt bij het invriezen van andere weefsels. Dit manuscript beschrijft een protocol voor snel invriezen van de skeletspieren met behulp isopentaan (2-methylbutaan) gekoeld met vloeibare stikstof om optimale skeletspieren morfologie behouden. Deze procedure is ook effectief voor freezing weefsel bedoeld voor genetische of proteïne-expressie studies. Verder hebben we onze invriesprotocol geïntegreerd in een bredere procedure die beschrijft ook de voorkeur methoden voor de korte termijn triage weefsel voor (1) enkele vezel functionele studies en (2) myoblast celkweek, met een focus op de minimale inspanning die nodig is om te verzamelen weefsel en het vervoer naar gespecialiseerd onderzoek of verwijzing labs om deze studies te voltooien. Kortom, dit manuscript geeft een overzicht van hoe vers weefsel effectief kan worden verdeeld voor een verscheidenheid van fenotypische studies, en biedt zo standard operating procedures (SOP's) voor pathologische studies in verband met aangeboren spierziekte.
Protocol
Label de containers te gebruiken spier opslag met adequate identificatiemiddelen voor het dier en spieren geoogst. Pre-koelen de zakken / containers en instrumenten te bevriezen / ontdooien van het weefsel te voorkomen wanneer het wordt toegevoegd.
1. Studie-ontwerp Overwegingen voor Muscle Tissue Collection
- Voor kleine dieren (muizen) modellen van de spierziekte, gebruiken een hele spier voor de studie aangezien kleine diermodellen vereisen vaak evaluatie van een hele spier voldoende myofiber bemonstering voor pathologisch onderzoek. Voor grote dieren (honden) modellen van de spierziekte, gebruiken de spieren porties die ten minste 0,3 x 0,3 cm of groter in hun dwarse (dwarsdoorsnede) aspect zijn.
OPMERKING: Core biopten kan ook gebruikt worden, maar kan suboptimaal voor primaire karakterisering studies te wijten aan bemonstering kwesties. - Voor studies met betrekking tot de sarcomeer, kan de ultrastructurele meting van sarcomeer lengte een kritische eindpunt omvatten en kan require gespecialiseerd hanteren. Dit is meestal alleen relevant in ziekten waarbij elementen van het sarcomeer toon ongepast lengtes, zoals in sommige oorzaken van nemaline myopathie. Sommige laboratoria liever spier vast te stellen in haar niet-gecontracteerde of uitgerekt staat, in plaats van het uitvoeren van deze metingen bij niet-gespannen of niet-uitgerekte spier.
- Als sarcomeer lengte niet zal worden gemeten, stelt het spierweefsel zonder pre-rekken van de spier door direct te plaatsen in de gewenste EM fixeermiddel (zie reagentia).
- Als sarcomeer lengte wordt gemeten, kunnen verschillende technieken om pre-rekken van de spier (zie Overleg) worden gebruikt:
- Gebruik een kleminrichting om de spier te houden op de rustspanning terwijl het nog in het dier te snijden de spieren rond de buitenkant van de klem en plaats het direct in de gewenste EM fixeermiddel (zie reagentia).
- Strek en speld de spier aan een oppervlak (zoals een stukje kurk) bij een lengte vergelijkbaar met dat
2. Sub-verdeel de geïsoleerde Skeletal Muscle in fragmenten die geschikt is voor de gewenste Studies zijn (figuur 1)
- Voor bevroren spier histologie:
- Sluiten zoveel van een bepaalde spier mogelijk bemonstering vertekening te minimaliseren (zie stap 1.1), maar specimens moet <1,5 cm om te voorkomen bevriezing artefacten.
- Behandel alle spieren van hetzelfde onderzoek eveneens artefacten te verschillen in vezelgrootte voorkomen vanwege het verschil in behandeling.
- Voor elektronenmicroscopie (EM):
- Snijd een ~ 0,5 x 0,2 x 0,2 cm strook van spierweefsel het monster, met de lengteas van het monster evenwijdig aan de langsas van de oorspronkelijke spier.
OPMERKING: zal De fixerende onvoldoende doordringen dikkere stukjes weefsel, dus het handhaven monsterdikte op 2 mm of minder is van cruciaal belang bij het verkrijgen van de juiste resultaten. Bovendien,als oriëntatie van dergelijke kleine stukjes spier is vaak moeilijk, is het raadzaam om een fragment van weefsel dat de werkelijke oriëntatie van de spieren (dat wil zeggen de langste kant van het vaste preparaat is de longitudinale richting van de spier / spiervezels) nabootst gebruiken minimaliseren handling en verwarring tijdens EM verwerking.
- Snijd een ~ 0,5 x 0,2 x 0,2 cm strook van spierweefsel het monster, met de lengteas van het monster evenwijdig aan de langsas van de oorspronkelijke spier.
- Voor celcultuur:
- De gewenste cel opbrengst kan de hoeveelheid van de spier nodig is voor celkweek vestiging beïnvloeden. Single spieren (of delen van de spieren) uit kleine dieren kan onvoldoende cel aantallen te celculturen vestigen bieden, zodat indien nodig, zwembad weefsel uit meerdere spieren.
3. Weefsel Fixatie en Verwerking voor elektronenmicroscopie (EM)
- Plaats een fragment van de spier niet groter dan 2 mm in het dunste dimensie direct in de gewenste EM fixeermiddel (zie reagentia).
- Plaats de spier in EM fixatief buffer (zie reagentia) na 2-48 uur van fixatiop. Langdurige fixatie (weken of maanden) kan resulteren in het verlies van ultrastructurele details over EM studies.
- Stuur naar een EM kern faciliteit voor de verwerking.
4. Muscle Bevriezing voor histologische, biochemische en moleculaire studies
- Verwijder overmatig vocht in het monster door grondig deppen het monster met een papieren handdoek, totdat het weefsel is iets aanhanger van de handdoek. Overmatig vocht zullen aanzienlijke bevriezing artefacten produceren in de spier.
OPMERKING: Weefsel kan verder worden gedroogd door te rollen in babypoeder. Deze stap is meestal niet nodig spieren tenzij zij in een te vochtige omgeving zijn. - Plaats Okt (of soortgelijke kleefstof zoals gom tragacanth) in de bodem van een ondiepe cryomold of kurk, slechts genoeg LGO een basis voor de gerichte spier (figuur 2C) te verschaffen. Labelen van de kurk of cryomold voordat bevriezing kan nuttig zijn voor specimen het volgen.
- Carefully plaatst de spier in de mal in de gewenste oriëntatie, met de meerderheid van de spier uitsteekt van het LGO zodat doorgesneden spieren niet raken Okt (figuur 2C).
- Isopentaan toevoegen aan een metalen beker totdat het een diepte van ongeveer 3-4 cm bereikt.
- Doe thermische veiligheidshandschoenen en verwijder het deksel van Dewar.
- Plaats of houd de metalen kom in contact met de vloeibare stikstof, zodat het niveau van vloeibare stikstof aan de buitenzijde van de beker boven het niveau van de isopentaan aan de binnenzijde van de beker. Strategieën om deze containers regelen worden getoond in Figuur 2.
- Niet in vloeibare stikstof om de metalen cup te voeren, als het produceert een borrelend schuim dat omslachtig om mee te werken kan zijn (en is ook niet voldoende koud om in te vriezen).
- Let op de isopentaan te bepalen wanneer het de juiste temperatuur heeft bereikt. Bij de geschikte temperatuur (optimaal tussen -140 tot -149 ° C), zodatdeksel witte kiezels bevroren isopentaan zullen vormen (na een paar minuten, en na de eerste mist boven de isopentaan verdwenen) op de bodem van de beker of de oplossing in het algemeen dikker de consistentie melasse. Invriezen voorafgaand aan deze fase zal bevriezen atifacts opleveren.
- Als de isopentaan volledig bevriest solide, ontdooien en chill het opnieuw vriestemperaturen voor verder gebruik.
- Met behulp van pre-gekoelde pincet, verlagen het specimen en kurk / schimmel in de isopentaan voor ongeveer 10-20 sec.
- Plaats het bevroren monster in een vooraf gekoelde container.
- Houd specimen en container op droog ijs te allen tijde tot overdracht aan een -80 ° C vriezer.
5. Als Invriezen Artifact is aanwezig in al bevroren weefsel, is het mogelijk om de mate van Freezing Artifact Verbeter met de volgende "Thaw en opnieuw invriezen" Procedure
- Neem blokken uit de vriezer, een voor eenEn bewaar ze op droog ijs. De timing van dit protocol is van cruciaal belang. Alleen ontdooien en opnieuw invriezen een blok per keer.
- Verplaats monster van droog ijs tot kamertemperatuur.
- Als het monster werd ingebed in oktober, verwijder de omliggende oktober zo volledig mogelijk met behulp van een scalpel.
- Laat het monster ontdooien bij kamertemperatuur tot het punt waar het volledig ontdooid, maar niet tot het punt waar het uitdroogt.
- Voorzichtig prod het monster met een pincet zodat het monster volledig is ontdooid alvorens aan de volgende stap.
- Bevries de spier zoals gespecificeerd in stappen 4.1-4.10.
6. Voorbereiding van Muscle voor gevilde Single Fiber functioneel testen
- De regeling opslag van de spier hangt af van wanneer de spier / vezel wordt gebruikt voor experimenten.
- Voor gebruik binnen een paar weken, plaats de spier in een oplossing van 50% glycerol/50% ontspannende oplossing (zie reagentia), en bewaar bij -20 ° C.
- Voor gebruik after een paar weken, plaats de spier in een oplossing van 75% glycerol/25% ontspannende oplossing (zie reagentia), en bewaar bij -80 ° C.
- Als alternatief, laat spier droog, pin naar cork, en op te slaan op silica korrels bij -80 ° C. Deze gedehydrateerde spieren kunnen worden gebruikt voor het jaar.
7. Voorbereiding van Fresh Spier voor verzending van Cultuur van de Cel van externe laboratoria
Protocollen voor de oprichting van celculturen zijn elders 4-7 goed beschreven.
- Vul een 50 ml steriele conische buis met een steriele volledige groei media.
- Voeg het spierweefsel aan de buis met een steriele pincet volledig onderdompelen van het weefsel in media.
- Vul de rest van de buis met media om uitdroging voorkomen tijdens het transport.
- Voeg ijs packs om de doos piepschuim en plaats de conische buis nabij diverse koelelementen.
- Let op: alleen ijs packs (en niet droog ijs) worden gebruiktschade voorkomen bevriezing van de vloeistof en weefsel.
- Schip pakketten O / N, maar weefsels kan 2 dagen duren onder deze omstandigheden.
Representative Results
Voorbeelden van de artefacten gezien met onjuiste bevriezen voorzien, werden verschillende muis quadriceps ingevroren met behulp van verschillende technieken (figuur 3) naar veelvoorkomende fouten repliceren. Zoals getoond in figuur 3A, geschikt bevroren skeletspier toont een strakke aanbrenging van myofibers aan het omringende weefsel (meestal andere spiervezels, maar soms endomysial ruimte tussen spiervezels is gevuld met fibrose of ontstekingscellen in een verscheidenheid van ziekte of letsel processen) en een duidelijk zichtbare cytoplasmatische compartiment. Voor pathologische analyse, de mogelijkheid om de intracellulaire ruimte zie vaak belangrijker dan de endomysial compartiment, zoals het gewoonlijk essentieel om duidelijk de aanwezigheid van degeneratieve veranderingen regeneratieve veranderingen of andere pathognomonische bevindingen (centrale kernen, intracellulaire inclusies) in deze ruimte. Aldus vormt de aanwezigheid van ijskristallen in het intracellulaire compartiment vertegenwoordigt OnsBELANGRIJKSTE probleem in de pathologische beoordeling van spieren.
Juiste bevriezing van spierweefsel vereist zowel voldoende koude temperaturen en voldoende snel bevriezen om de vorming van ijskristallen te voorkomen. Zelfs bij de verantwoording van beide factoren, kan aanzienlijke bevriezing artefact nog optreden als gevolg van overmatig vocht in het spierweefsel. Dit probleem wordt meestal aangetroffen in het spierweefsel die eerder ondergedompeld in zoutoplossing en gedroogd onvoldoende of wanneer spier is in direct contact met oktober fixeermiddelen op de plaats van snijden (figuur 3B, 3E). Terwijl sommige contact met oktober is meestal onvermijdelijk als gevolg van de montage-proces, moet al het mogelijke worden gedaan om het contact tussen gebieden die histologisch worden geëvalueerd en de oktober gebruikt voor het monteren te voorkomen. In tegenstelling, monsters bevroren met behulp van een -80 ° C vriezer (Figuur 3C) en vloeibare stikstof (Figuur 3D) bieden bijvoorbeelds van bevriezing artefact dat wordt geproduceerd door suboptimale temperatuur of snelheid van bevriezing. De trage invriezen ondervonden door het plaatsen van weefsel in een -80 ° C vriezer biedt een extreem voorbeeld van bevriezing artefact. Bij gebruik van vloeibare stikstof, het belangrijkste probleem is dat contact tussen vloeibare stikstof en het weefsel veroorzaakt een omhulsel van gasvormig stikstof te vormen op weefsel-vloeistof interface en dit gasvormige interface is niet voldoende koud om snelle spieren bevriezen 1 produceren. Dit kan aanzienlijke bevriezing artefact produceren buurt van het oppervlak van het monster, maar de interne delen van het monster hebben meer kans op flash-vries met een geschikte snelheid en zijn volledig gespaard van bevriezing artefact. Terwijl de eenvoudige onderdompeling van spierweefsel in vloeibare stikstof is lang niet zo nuttig als de-isopentaan invriezen proces, kan het nuttig zijn voor het invriezen van grote exemplaren spier in situaties waarin isopentaan niet beschikbaar is (zoals klinische autopsie monsters bij instellingen metuit klinische spier pathologie laboratoria). Resultaten met behulp van deze strategie zijn algemeen beter bij gebruik van grote delen van weefsel (> 2 cm in verschillende afmetingen).
Hoewel het vermijden van bevriezing artefact zorgt voor optimale histologische resultaten is een techniek ook ontwikkeld (en beschreven) die nagenoeg keert bevriezen artefacten de evaluatie onrechtmatig ingevroren weefsel mogelijk. Weefsel dat niet goed is bevroren (figuur 3E) worden ontdooid en opnieuw ingevroren onder goed gecontroleerde omstandigheden (figuur 3F) de herverdeling van water in de vezels mogelijk maken, en de mate van morfologische conservering die verkregen kan uitstekend. In onze ervaring, dit proces blijft de intracellulaire morfologie van het weefsel tot een opmerkelijke mate, maar vaak levert een artefactuele scheiding van vezels in de endomysial ruimte. Omdat veel pathologische eindpunten zijn in de intracellulaire ruimte en die inde endomysial ruimte wordt het best bekeken met behulp van speciale vlekken (ofwel fibrose markeren of om andere celtypen te identificeren), deze artefactuele veranderingen zijn waarschijnlijk niet echt afbreuk doen aan de pathologische evaluatie van de spier.
Figuur 1. Triage weefsel voor structurele, functionele en cellulaire studies van de skeletspier. Afhankelijk van de soorten onderzoeken gewenst kan verzameld skeletspierweefsel verwerkt op verschillende manieren voor optimale resultaten. De in dit document protocollen beschrijven methoden voor triaging of verwerken skeletspieren exemplaren voor off-site studies om de resultaten verkregen uit deskundige kern installaties te optimaliseren.
Figuur 2. Voorbeelden van inrichtingen gebruikt voor spier vriespunt. Zoals beschreven in het protocol optimale spier bevriezing vereist onderdompelen van spierweefsel in isopentaan dat op zijn vriestemperatuur. Een veilig en efficiënt middel om ijskoude isopentaan omvat het gebruik van een metalen houder voor de isopentaan die wordt afgekoeld in een omgeving Dewar met vloeibare stikstof. Omdat het vaak handig beide handen vrij te hebben, is het mogelijk om een brace zoals een ring stand (A) de isopentaan container in de vloeibare stikstof houden terwijl tegen vermenging van de twee vloeistoffen. Alternatief kan de houder worden gehouden in de vloeibare stikstof handmatig (B). In beide gevallen, het weefsel moet niet in de isopentaan geplaatst totdat het zichtbaar wordt isopentaan invriezen bij de bodem van de houder (gewoonlijk als ondoorzichtige witte kiezels), en vervolgens worden ondergedompeld gedurende 10-20 seconden om volledige bevriezing mogelijk. Isopentane bij vriestemperatuur produceert minimal "mist", (dat wil zeggen, de temperatuur is onvoldoende wanneer aanzienlijke mist aanwezig is). Zodra het weefsel wordt bevroren, plaats het direct in pre-gekoelde containers (en dan direct in een koelkast of vriezer) om onbedoelde ontdooien na bevriezing te voorkomen. (C) Op passende Gedragen bevroren gluteus dient de meerderheid van de spierweefsel uitsteekt uit een basis van bevroren OCT hebben.
Figuur 3. Voorbeelden van invriezen artefact en effectieve ontdooien / opnieuw bevriezen. Representatieve beelden van (A) geschikt isopentaan bevroren spier, (B) spier geschikte bevroren in isopentaan, maar terwijl in contact met oktober fixeermiddel, (C) spier bevroren in een -80 ° C vriezer, en (D (B), de hoog vloeistofgehalte LGO levert aanzienlijke bevriezen artefact spier die in contact zijn, zodat alleen de minimale hoeveelheid OCT nodig voor montage worden gebruikt en de spier voor histologische evaluatie moet "standing out "van het oppervlak. De traagheid van het vriesproces met behulp van een (C) -80 ° C vriezer of (D) vloeibare stikstof (met betrekking tot de snelheid van bevriezing in ijskoud isopentaan) kan leiden tot de productie van significante bevriezing artefact. Panelen E en F tonen de spieren van dezelfde specimen dat was (E) aanvankelijk suboptimaal bevroren (als gevolg van overmatig contact met oktober) en vervolgens (F) ontdooid en opnieuw ingevroren met behulp van de hierin beschreven techniek. Terwijl een aantal artefactuele scheiding tussen vezels kunnen waarnemen in het opnieuw ingevroren monster, de verbetering in de intracellulaire morfologie van de spiervezels is duidelijk zichtbaar. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Discussion
Skeletspier is een structureel en functioneel uniek weefsel, en gespecialiseerde voorbereiding procedures zijn noodzakelijk om de optimale beoordeling van de structurele en functionele parameters mogelijk te maken. Terwijl een groot aantal weefsels vaak voor pathologische studies in de klinische en onderzoek contexten zijn bevroren, bevriezen protocollen voor niet-spierweefsel meestal om de totale onderdompeling van het weefsel in oktober voor het invriezen. Zoals getoond in figuur 3, een dergelijk protocol is geschikt voor pathologische evaluatie van de skeletspieren en toch voldoende overeenstemming van de hier beschreven protocol dat dit een veel voorkomende fout. Het doel van dit artikel is een eenvoudig protocol voor de correcte afhandeling van de spier te bieden aan dit soort zaken te voorkomen. Advies is ook opgesteld op de correcte afhandeling van de spier voor off-site fysiologische en cellulaire studies in een poging om de overname van de hoge kwaliteit van de gegevens door externe kern laboratoria in gevallen vergemakkelijken wheopnieuw ter studies niet de voorkeur of mogelijk.
Zoals in dit protocol, elementen die absoluut essentieel voor de juiste bewerking van spieren voor pathologische studies omvatten het minimaliseren van het watergehalte van het weefsel, het verminderen van de temperatuur waarbij de spier wordt bevroren, en het verhogen van de snelheid waarmee het vriespunt wordt bereikt. Overmatig vocht in het weefsel of overmatig traagheid van het invriezen (geproduceerd door onvoldoende temperaturen of door een gebrek aan direct contact tussen de bevriezing middel en het weefsel, zoals ondervonden met vloeibare stikstof) zal leiden tot het bevriezen van artefacten die pathologische analyse kan aantasten. Als oktober levert een extra bron van weefselvocht, vele laboratoria plakmiddelen zoals tragacanth als inbedding substraat. Zelfs in gevallen waarin het vriespunt op de juiste wijze wordt uitgevoerd, moet ervoor worden gezorgd dat vervolgens per ongeluk ontdooien exemplaren voorkomen door contact met RT containers of instrumenten.Dus een succesvolle vriesproces vereist een zekere planning die vooraf koelen van alle instrumenten en de te gebruiken omvat. Bij het invriezen artefacten worden aangetroffen, is een werkwijze beschreven voor het herstel van het weefsel dat is voldoende voor de meeste pathologische evaluaties. Echter, deze vries / dooi cyclus niet perfect histologie bieden en heeft het potentieel om andere moleculaire of enzymatische studies van het weefsel (naast de tijd voor het opnieuw invriezen van het weefsel) beïnvloeden, zodat met geschikte eerste bevriezing praktijken verreweg de voorkeur . Wanneer invriezen artefact wordt aangetroffen op vooraf bevroren weefsel, maar de hierin beschreven techniek kan zeer nuttig zijn.
Fixatie en verwerking van weefsel voor EM kan specifieke technische uitdagingen die planning voorafgaand aan weefsel collectie vereisen. De meest voorkomende fout bij het verzamelen van monsters voor EM omvat het gebruik van weefsel fragmenten die te dik zijn glutaraldehyde doordringen. Glutaaraldehyd dringt slechts ongeveer 0,1 cm in het spierweefsel van een bepaald oppervlak moet ervoor worden gezorgd dat een dimensie van de EM monsters niet dikker dan 0,2 cm. Daarnaast, zoals EM is een uitstekend middel rechtstreeks gewaardeerd het contractiele apparaat, sommige onderzoekers hebben strategieën ontwikkeld om voorspanning of voorrek de spier voor bevestiging aan de meting van contractiele elementen dat bij een fysiologisch relevante spanning. Er is geen standaard protocol voor voorspanning, maar twee strategieën worden kort beschreven in dit protocol. Opgemerkt zij dat probeert voorspanning de spier kan onvoorspelbare resultaten tenzij zij gedaan in een zeer specifieke manier, en het kan de voorkeur verdienen om spieren vast in slappe toestand te artefactuele veranderingen in sarcomeer lengte te voorkomen door een afwijkende pre-spanprocedure 8,9. Voor spieren waarin dergelijke metingen zijn niet nodig (waaronder de meeste biopsies uitgevoerd voor klinische doeleinden), inspanningen voorspanning de spier algemeen niet gemaakt, en het hoofdeffect op spiermorfologie een niet-uniforme verdeling van sarcomeren in de spier.
Dit document is de eerste in een reeks SOP's voor het uitvoeren van tests op het gebied aangeboren spierziekte, en het vertegenwoordigt de inspanningen van meer dan 20 experts op het aangeboren spierziekte veld dat routinematig uitvoeren van cellulaire, moleculaire, functionele, fysiologische en pathologisch onderzoek. Een reeks van gepubliceerde SOP's zullen beschikbaar worden gesteld in het komende jaar, en de nodige protocollen en passende bekendmaking formaten voor elke besproken in een aangeboren spierziekte Consortium Workshop gehouden in april 2013 in Washington DC Het doel van deze SOP inspanning is te voorzien een routekaart voor de nodige testen en analyseren van monsters in de spier veld aangeboren ziekte tot 1) standaardisering van de praktijken en eindpunten gebruikt in ons vakgebied als much mogelijk, en 2) geven instructie op standaard praktijken voor nieuwe onderzoekers in ons vakgebied. Wij zijn van mening dat deze middelen de komst van nieuwe onderzoekers in onze onder-bestudeerde veld zal vergemakkelijken en aldus de reikwijdte van het onderzoek die kunnen worden uitgevoerd. Daarnaast zal er een standaardisatie van praktijken zeer nuttig zijn om gegevens over studies te vergelijken en eindpunten vast te stellen bij het plannen en uitvoeren van preklinische en klinische proeven.
Terwijl de belangrijkste focus van dit artikel heeft betrekking op de juiste invriezen en bereiding van weefsel voor verschillende studies, onze gezamenlijke groep besproken de nuttige eindpunten voor de pathologische analyse van monsters spier. Momenteel is er geen officiële consensus over de aanpak houden bij het uitvoeren pathologische analyse en een verscheidenheid van verschillende studies uitgevoerd om nieuwe bevindingen betrekking op voorgaande publicaties voor iedere respectieve ziekte. Dus we dachten dat het nuttig zou zijnstellen enkele algemene richtlijnen voor de planning van pathologische eindpunten in de spieren pathologie karakterisering. Voorafgaand aan het kwantificeren van de pathologie in een studie, moet nagedacht in gebracht: 1) de methode van fiber maat opmeten, 2) de mogelijkheid van een vezel-type-specifieke afwijkingen of effecten van de behandeling, 3) de mogelijkheid van afwijkingen of effecten die beperkt individuele spieren, en 4) een strategie voor het kwantificeren pathologische bevindingen die karakteristiek voor de ziekte onder studie. Vezelgrootte is een noodzakelijke eindpunt voor de meeste studies, en helaas is er een uitgebreide variatie in de manier waarop het wordt gekwantificeerd. Veel studies rapporteren deze resultaten met behulp van geautomatiseerde kwantificering die door proprietary imaging software, maar veel van deze programma's nemen sneltoetsen (zoals in de veronderstelling dat de vezels zijn cirkels of ellipsen) dat deze geautomatiseerde metingen onnauwkeurig kunnen maken. Het is noodzakelijk om te begrijpen hoe deze geautomatiseerde programma's maken hun metingen boordat hebben vertrouwen in de metingen, en we moedigen onderzoekers om deze gegevens op te nemen in papier-methoden. Daarnaast is de specifieke meting gebruikt om vezelgrootte duiden is uiterst variabel en sommige metingen zijn te verkiezen boven anderen 10,11. Een veelgebruikte eenheid vezelgrootte is de vezel doorsnede (CSA), vooral omdat onderzoekers uitvoeren fysiologische studies standaardiseren van resultaten CSA metingen verkregen met de instrumenten. Helaas, terwijl CSA metingen nauwkeurig reflecteren vezelgrootte in perfecte dwarsdoorsneden, zij uitvoerig afhankelijk vezeloriëntatie (voorzover lengte of schuin doorgesneden vezels kunstmatig hoge CSA metingen hebben) en zijn dus niet ideaal voor metingen vezelgrootte. Een voorkeur meting vezels grootte die minder afhankelijk vezel dwarsdoorsnede is de diameter van de minimum Feret (MinFeret diameter), die de meting van ee minor diameter in de spiercel 12. Deze meting is slechts weinig afhankelijk vezeloriëntatie is gewoonlijk de klinische gouden standaard voor vezels meting en onderzoekers ertoe bewegen naar het gebruik van deze techniek. Deze metingen kunnen vaak worden uitgevoerd met behulp van dezelfde software die CSA metingen genereert 13 en ook eenvoudig handmatig meten. Met betrekking tot de evaluatie van de pathologische gegevens naar soort vezel, specifiek spier, en in de context van pathologische bevindingen met betrekking tot de specifieke ziekte, deze zijn minder controversiële kwesties die alleen tijdens de planning van een onderzoek moet worden overwogen. Vezeltype kan worden geëvalueerd middels immunohistochemische kleuring of ATPase, maar het is nuttig om te overwegen die specifieke spieren en diersoorten specifieke mengsels van deze typen vezels (dus noodzakelijk verschillende verwachtingen en teststrategieën). Muscle specifieke pathologische betrokkenheid of werkzaamheid van de behandelingoptreden, en totaalgewicht spier vergeleken met controles kunnen worden gebruikt om de mate van heterogeniteit van de ziekte te identificeren alvorens over het spieren pathologisch evalueren. Tenslotte is het bekend dat veel spierziekten worden geassocieerd met specifieke pathologische afwijkingen (bijvoorbeeld nemaline staven nemaline myopathie) 14,15, en dus is ook nuttig om te overwegen of deze afwijkingen worden gevonden in een vezel-type of spier -specifieke verdeling bij het uitvoeren van de analyse 16,17. Over het algemeen, terwijl wij geen voorstellen doen voor een starre set van normen voor de evaluatie van de spier, geloven we dat deze kwesties voorafgaand aan de uitvoering van pathologische studies in elke skeletspier ziekte moet worden beschouwd.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For tissue freezing | |||
| Liquid nitrogen dewar with a liquid withdrawal device | Custom Biogenic Systems | Lab-5 Series | Any other liquid nitrogen dewar could substitute. |
| Cold-conductive container | Fisher | 02-583A | |
| Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen | Nalgene | 4150-2000 | |
| Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer | Thomas Scientific | 1228Y01 | Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing. |
| For single fiber functional testing | |||
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11 | |
| Sylgard coating | Ellsworth Adhesives | 3-6636 | |
| Dissection stereomicroscope | Harvard Apparatus | 693101 | Any other dissection microscope could substitute. |
| For cell culture | |||
| Sterile laminar flow hood | Thermo Scientific | 51022485 | Any other cell culture hood could substitute. |
| For tissue freezing | |||
| Plastic bags/containers | Nasco | B01009WA | |
| Thermal safety gloves | Denville | G4162 | |
| Face shield | Fisher Scientific | S47640 | |
| Long forceps | Fisher Scientific | 12-460-807 | |
| Marker | Staples | 125328 | |
| For cell culture | |||
| Sterile 50 ml conical tubes | Denville | C1060-P | |
| PES filter unit, 500 ml, 0.22 µm | Denville | F5227 | |
| Sterile forceps | Fisher Scientific | 644320 | |
| Ice packs | Fisher Scientific | NC9909223 | |
| Insulated styrofoam box | Polar Tech | 207F | |
| Packing tape | Staples | 795570 | |
| Tissue freezing | |||
| Liquid nitrogen | Airgas | NI NF160LT350 | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma | M32631-4L | Store Isopentane in a flammable materials cabinet. |
| EM fixative (choose one) | The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM. | ||
| 2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 16537-15 | |
| Karnovsky's fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer) | Electron Microscopy Sciences | 15732-10 | |
| For functional studies (if desired) | |||
| Relaxing solution, containing (in mmol/L) | |||
| 40 BES | Sigma | B9879 | |
| 10 EGTA | Sigma | E4378 | |
| 6.56 MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| 5.88 Na-ATP | Sigma | A3377 | |
| 1.0 DTT | RPI | D11000 | |
| 46.35 K-propionate | Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1 | ||
| 15 creatine phosphate, pH 7.0 | Sigma | P7936 | |
| 0.4 leupeptin | Calbiochem | 10895 | |
| 0.1 PMSF | Sigma | P7676 | |
| Skinning solution, containing | |||
| Relaxing solution (See Above) | |||
| 0.5% Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Indicating silica granules | |||
| Flat pieces of cork (1 x 1 inch) | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| For cell culture (if desired) | |||
| Complete Growth Medium, containing (for 500 ml) | Sterilize by filtering the solution through a 500 ml 0.22 µm PES filter unit. Store at 4°C and use within 1 month. | ||
| 395 ml of high glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D5671 | |
| 100 ml of fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F6178 | |
| 5 ml of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG) | Sigma | G1146 | |
| See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications |
References
- Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. 15, Elsevier. 407-442 (2007).
- Lawlor, M. W., et al. Enzyme replacement therapy rescues weakness and improves muscle pathology in mice with X-linked myotubular myopathy. Hum Mol Genet. 22, 1525-1538 (2013).
- Talmadge, R. J., Roy, R. R. Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms. J Appl Physiol. 75, 2337-2340 (1993).
- Blau, H. M., et al. Differentiation properties of pure populations of human dystrophic muscle cells. Exp Cell Res. 144, 495-503 (1983).
- Lawlor, M. W., et al. Myotubularin-deficient myoblasts display increased apoptosis, delayed proliferation, and poor cell engraftment. Am J Pathol. 181, 961-968 (2012).
- Pavlath, G. K., Gussoni, E. Human myoblasts and muscle-derived SP cells. Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).
- Webster, C., Blau, H. M. Accelerated age-related decline in replicative life-span of Duchenne muscular dystrophy myoblasts: implications for cell and gene therapy. Somat Cell Mol Genet. 16, 557-565 (1990).
- Ottenheijm, C. A., et al. Thin filament length dysregulation contributes to muscle weakness in nemaline myopathy patients with nebulin deficiency. Hum Mol Genet. 18, 2359-2369 (2009).
- Witt, C. C., et al. Nebulin regulates thin filament length, contractility, and Z-disk structure in vivo. EMBO J. 25, 3843-3855 (2006).
- Garton, F., et al. Validation of an automated computational method for skeletal muscle fibre morphometry analysis. Neuromuscul Disord. 20, 540-547 (2010).
- Kim, Y. J., et al. Fully automated segmentation and morphometrical analysis of muscle fiber images. Cytometry A. 71, 8-15 (2007).
- Lawlor, M. W., et al. Inhibition of activin receptor type IIb increases strength and lifespan in myotubularin-deficient mice. Am J Pathol. 178, 784-793 (2011).
- Mula, J., et al. Automated image analysis of skeletal muscle fiber cross-sectional area. J Appl Physiol. 114, 148-155 (2013).
- Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. , Elsevier. 407-442 (2007).
- Nance, J. R., et al.
- Clarke, N. F., et al. Mutations in TPM3 are a common cause of congenital fiber type disproportion. Ann Neurol. 63, 329-337 (2008).
- Lawlor, M. W., et al. Mutations of tropomyosin 3 (TPM3) are common and associated with type 1 myofiber hypotrophy in congenital fiber type disproportion. Hum Mutat. 31, 176-183 (2010).
