Abstract
कंकाल की मांसपेशी, क्योंकि कार्यात्मक सेलुलर, आणविक, और रोग मूल्यांकन से इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए ऊतक संग्रह के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल की आवश्यकता है जो इसकी संरचना और समारोह की एक अद्वितीय ऊतक है. जन्मजात मांसपेशियों की बीमारी के लिए कंकाल की मांसपेशी जब मूल्यांकन कारण जन्मजात पेशी विकारों और इन सुविधाओं की मान्यता के मामले में हस्तक्षेप करने के निर्धारण के लिए क्षमता में देखा कुछ रोग असामान्यताओं का सूक्ष्मता के लिए, स्थिर मांसपेशियों के रोग मूल्यांकन तय पेशी के लिए बेहतर है. अन्य ऊतकों जब ठंड आमतौर पर इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं कि ऊतकीय परीक्षा के लिए कंकाल की मांसपेशी ठंड साथ ही, जब मांसपेशियों में गंभीर ठंड कलाकृतियों का उत्पादन करने की क्षमता विशिष्ट सावधानियों की आवश्यकता है. इस पांडुलिपि के इष्टतम कंकाल की मांसपेशी आकारिकी की रक्षा करने के लिए तरल नाइट्रोजन के साथ ठंडा isopentane (2 methylbutane) का उपयोग कंकाल की मांसपेशी की तेजी से ठंड के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. यह प्रक्रिया भी च के लिए प्रभावी हैआनुवंशिक या प्रोटीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए करना ऊतक reezing. इसके अलावा, हम इकट्ठा करने के लिए आवश्यक न्यूनतम प्रयास पर ध्यान देने के साथ भी (1) एक फाइबर कार्यात्मक अध्ययन और (2) myoblast सेल संस्कृति के लिए ऊतक की अल्पावधि ट्राइएज के लिए पसंदीदा विधियों का वर्णन है कि एक व्यापक प्रक्रिया है, में हमारे ठंड प्रोटोकॉल एकीकृत है ऊतक और इन अध्ययनों को पूरा करने के लिए विशेष अनुसंधान या संदर्भ प्रयोगशालाओं के लिए परिवहन. कुल मिलाकर, इस पांडुलिपि ताजा ऊतक को प्रभावी ढंग से प्ररूपी अध्ययन की एक किस्म के लिए वितरित किया जा सकता है की एक रूपरेखा प्रदान करता है और इस तरह जन्मजात मांसपेशियों की बीमारी से संबंधित रोग के अध्ययन के लिए मानक संचालन प्रक्रिया (रियायतों) प्रदान करता है.
Protocol
काटा जानवर और मांसपेशियों के लिए उपयुक्त पहचानकर्ता के साथ पेशी भंडारण के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए कंटेनर लेबल. यह जोड़ा जाता है जब बैग / कंटेनरों और यंत्र ऊतक के फ्रीज / विगलन को रोकने के लिए पूर्व शांत.
मांसपेशियों के ऊतकों संग्रह के लिए 1. अध्ययन के डिजाइन संबंधी
- छोटे पशु मॉडल अक्सर रोग के अध्ययन के लिए पर्याप्त myofiber नमूने उपलब्ध कराने के लिए एक संपूर्ण पेशी के मूल्यांकन की आवश्यकता के बाद से छोटे पशु के लिए मांसपेशियों की बीमारी के (murine) मॉडल के अध्ययन के लिए एक पूरे मांसपेशियों का उपयोग करें. बड़े जानवर के लिए मांसपेशियों की बीमारी के (कैनाइन) मॉडल, उनके अनुप्रस्थ (पार के अनुभागीय) पहलू में कम से कम 0.3 x 0.3 सेमी या अधिक कर रहे हैं कि मांसपेशियों के अंश का उपयोग करें.
नोट: कोर बायोप्सी भी इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन नमूने मुद्दों के कारण प्राथमिक लक्षण वर्णन पढ़ाई के लिए suboptimal हो सकता है. - Sarcomere शामिल अध्ययन के लिए, sarcomere लंबाई की ultrastructural माप एक महत्वपूर्ण समापन बिंदु शामिल हो सकता है और requ सकता हैक्रोध से निपटने के विशेष. यह आमतौर पर बीमारियों में ही प्रासंगिक है, जहां nemaline मायोपथी के कुछ कारणों में के रूप में sarcomere शो अनुचित लंबाई के तत्वों,. कुछ प्रयोगशालाओं बल्कि गैर tensioned या गैर बढ़ाकर पेशी पर इन मापन प्रदर्शन से अपने गैर अनुबंधित या बढ़ाकर राज्य में मांसपेशियों को ठीक करना पसंद करते हैं.
- Sarcomere लंबाई मापी जा नहीं होगा, (अभिकर्मकों देखें) वांछित ईएम लगानेवाला में सीधे रखकर मांसपेशी पूर्व खींचने के बिना मांसपेशियों के ऊतकों को ठीक.
- Sarcomere लंबाई मापा जाएगा, तो (चर्चा देखें) मांसपेशी पूर्व फैलाने के लिए कई तकनीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है:
- यह जानवर में अब भी है, जबकि उसके आराम तनाव में पेशी कराने के लिए एक clamping के उपकरण का उपयोग करें, क्लैंप के बाहर चारों ओर मांसपेशियों आबकारी, और (अभिकर्मकों देखें) वांछित ईएम लगानेवाला में सीधे जगह है.
- खिंचाव और कहा कि एक के समान लंबाई में (जैसे काग के एक टुकड़े के रूप में) एक सतह को पेशी पिन
2. वांछित अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं कि टुकड़ों में पृथक कंकाल की मांसपेशी उप विभाजित (चित्रा 1)
- जमे हुए मांसपेशी ऊतक विज्ञान के लिए:
- नमूना पूर्वाग्रह कम से कम (1.1 कदम देखें), लेकिन नमूनों <कलाकृतियों ठंड से बचने के लिए 1.5 सेमी होना चाहिए करने के लिए संभव के रूप में दिया पेशी के रूप में ज्यादा शामिल करें.
- कारण से निपटने में अंतर करने के लिए फाइबर आकार में artifactual मतभेदों को रोकने के लिए इसी प्रकार इसी अध्ययन से सभी की मांसपेशियों को समझो.
- इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) के लिए:
- मूल पेशी के अनुदैर्ध्य अक्ष के लिए नमूना समानांतर के अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ, नमूना से मांसपेशियों के एक ~ 0.5 x 0.2 x 0.2 सेमी पट्टी काटें.
नोट: लगानेवाला पर्याप्त रूप से इतना 2 मिमी या उससे कम पर नमूना मोटाई को बनाए रखने, ऊतक का मोटा टुकड़े घुसना नहीं होगा उचित परिणाम प्राप्त करने में महत्वपूर्ण है. इसके अतिरिक्त,पेशी के इस तरह के छोटे टुकड़ों के उन्मुखीकरण अक्सर मुश्किल होता है के रूप में, यह करने के लिए मांसपेशियों की वास्तविक अभिविन्यास (यानी, तय नमूना के सबसे लंबे समय तक पहलू मांसपेशी / myofibers के अनुदैर्ध्य अभिविन्यास है) कि mimics ऊतक का एक टुकड़ा का उपयोग करने की सलाह दी जाती है ईएम प्रसंस्करण के दौरान हैंडलिंग और भ्रम को कम.
- मूल पेशी के अनुदैर्ध्य अक्ष के लिए नमूना समानांतर के अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ, नमूना से मांसपेशियों के एक ~ 0.5 x 0.2 x 0.2 सेमी पट्टी काटें.
- सेल संस्कृति के लिए:
- वांछित सेल उपज सेल संस्कृति स्थापना के लिए आवश्यक मांसपेशियों की राशि को प्रभावित कर सकते हैं. एकल मांसपेशियों (या मांसपेशियों के कुछ भागों) छोटे जानवरों से सेल कल्चर स्थापित करने के लिए अपर्याप्त सेल नंबर प्रदान करते हैं, तो हो सकता है, यदि आवश्यक हो, कई मांसपेशियों से पूल ऊतक.
इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) के लिए 3. ऊतक निर्धारण और प्रसंस्करण
- (अभिकर्मकों देखें) वांछित ईएम लगानेवाला में सीधे अपने सबसे पतला आयाम में 2 मिमी से अधिक नहीं मांसपेशी का एक टुकड़ा रखें.
- Fixati के 2-48 घंटे के बाद (अभिकर्मकों देखें) ईएम लगानेवाला बफर में पेशी रखेंपर. (सप्ताह या महीनों के लिए) लम्बे समय तक निर्धारण ईएम पढ़ाई पर ultrastructural विस्तार की हानि हो सकती है.
- प्रसंस्करण के लिए एक EM कोर की सुविधा के लिए भेजें.
Histological, बायोकेमिकल, और आण्विक अध्ययन के लिए 4. बलवान बर्फ़ीली
- ऊतक तौलिया थोड़ा पक्षपाती है जब तक अच्छी तरह से एक कागज तौलिए से नमूना सोख्ता द्वारा नमूना में अत्यधिक नमी को दूर. अत्यधिक नमी की मांसपेशी में महत्वपूर्ण ठंड कलाकृतियों का उत्पादन होगा.
नोट: ऊतक आगे बेबी पाउडर में यह रोलिंग द्वारा सूखे की जा सकती है. वे एक जरूरत से ज्यादा नम वातावरण में किया गया है जब तक कि यह कदम आम तौर पर मांसपेशियों के लिए आवश्यक नहीं है. - उन्मुख मांसपेशी (चित्रा -2) के लिए एक आधार प्रदान करने के लिए ही पर्याप्त अक्टूबर के साथ, एक उथले cryomold के तल में या काग अक्टूबर (या इस तरह के गम Tragacanth रूप में एक समान चिपकने वाला) रखें. ठंड से पहले काग या cryomold लेबल नमूना ट्रैकिंग के लिए उपयोगी हो सकता है.
- Carefully sectioned पेशी अक्टूबर (चित्रा -2) के साथ संपर्क में नहीं है कि इतनी अक्टूबर से फैलने वाला पेशी के बहुमत के साथ वांछित अभिविन्यास में ढालना में पेशी जगह है.
- यह लगभग 3-4 सेमी की गहराई तक पहुँच जाता है जब तक एक धातु कप के लिए isopentane जोड़ें.
- थर्मल सुरक्षा दस्ताने पर रखो और देवर के ढक्कन को हटा दें.
- कप के बाहर पर तरल नाइट्रोजन का स्तर कप के अंदर पर isopentane के स्तर से ऊपर है, इसलिए है कि तरल नाइट्रोजन के साथ संपर्क में धातु कप प्लेस या पकड़. इन कंटेनरों की व्यवस्था करने की रणनीति चित्रा 2 में दिखाया गया.
- इसके साथ काम करने के लिए बोझिल हो सकता है कि एक बुदबुदाती फोम का उत्पादन (और ठंड के लिए भी अपर्याप्त ठंड है) के रूप में, तरल नाइट्रोजन धातु कप में प्रवेश करने की अनुमति न दें.
- यह उचित तापमान पर पहुँच गया जब निर्धारित करने के लिए isopentane निरीक्षण करें. उचित तापमान पर (बेहतर के बीच -140 -149 डिग्री सेल्सियस), तोजमे हुए isopentane के ढक्कन सफेद कंकड़ (कुछ ही मिनटों के बाद, और प्रारंभिक कोहरे isopentane ऊपर गायब हो गया है के बाद) बनेगी कप के नीचे, या समाधान पर आम तौर पर गुड़ की स्थिरता के लिए और अधिक मोटा होना होगा. पहले इस चरण के लिए बर्फ़ीली ठंड atifacts निकलेगा.
- Isopentane पूरी तरह ठोस जमा देता है, तो पिघलना और बाद में उपयोग करने से पहले फिर से ठंड तापमान के लिए यह ठंडा.
- पूर्व ठंडा संदंश का प्रयोग, लगभग 10-20 सेकंड के लिए isopentane में नमूना और काग / ढालना कम है.
- एक पूर्व ठंडा कंटेनर में जमी नमूना रखें.
- एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में जमा होने तक हर समय सूखी बर्फ पर नमूना और कंटेनर रखें.
ठंड विरूपण साक्ष्य पहले से ही जमे हुए ऊतक में मौजूद है, तो 5., यह प्रक्रिया के बाद का प्रयोग ठंड विरूपण साक्ष्य की डिग्री में सुधार "पिघलना और फ्रिज में" संभव है
- एक समय में फ्रीजर, एक के बाहर ब्लॉक लो, और उन्हें सूखी बर्फ पर रहते हैं. इस प्रोटोकॉल का समय महत्वपूर्ण है. केवल पिघलना और एक समय में एक ब्लॉक फ्रिज.
- सूखी बर्फ से आर टी के लिए नमूना ले जाएँ.
- नमूना अक्टूबर में एम्बेडेड है, एक स्केलपेल का उपयोग संभव के रूप में पूरी तरह से आसपास के अक्टूबर हटा दें.
- नमूना नहीं, बल्कि यह बाहर सूख रहा है, मुद्दे पर जहां यह पूरी तरह thawed है इस मुद्दे पर जहां आरटी पर पिघलना करने की अनुमति दें.
- धीरे नमूना पूरी तरह से अगले चरण पर प्रगति से पहले thawed है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक संदंश के साथ नमूना ठेस.
- कदम 4.1-4.10 में निर्दिष्ट के रूप में मांसपेशियों रुक.
चमड़ी भी फाइबर कार्यात्मक परीक्षण के लिए पेशी के 6. तैयारी
- पेशी के लिए भंडारण की प्रक्रिया मांसपेशी / फाइबर प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है पर निर्भर करता है.
- कुछ ही हफ्तों के भीतर उपयोग के लिए, -20 डिग्री सेल्सियस (अभिकर्मकों देखें) समाधान आराम 50% glycerol/50% की एक समाधान में पेशी जगह है, और दुकान
- उपयोग पिछाड़ी के लिएकुछ ही हफ्तों के एर, डिग्री सेल्सियस -80 पर (अभिकर्मकों देखें) समाधान आराम 75% glycerol/25% की एक समाधान में पेशी जगह है, और दुकान
- वैकल्पिक रूप से, -80 डिग्री सेल्सियस पर सिलिका कणिकाओं पर पेशी सूखी, पिन काग के लिए, और दुकान जाने ये निर्जलित मांसपेशियों वर्षों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
बाहर प्रयोगशालाओं के लिए सेल संस्कृति के लदान के लिए ताजा स्नायु के 7. तैयारी
सेल संस्कृतियों की स्थापना के लिए प्रोटोकॉल कहीं और 4-7 अच्छी तरह से वर्णित किया गया है.
- बाँझ पूर्ण विकास मीडिया के साथ एक 50 मिलीलीटर बाँझ शंक्वाकार ट्यूब भरें.
- पूरी तरह से मीडिया में ऊतक submerging, एक बाँझ संदंश का उपयोग ट्यूब के लिए मांसपेशियों के ऊतकों में जोड़ें.
- लदान के दौरान सुखाने को रोकने के लिए मीडिया के साथ ट्यूब के शेष भरें.
- स्टायरोफोम बॉक्स के लिए आइस पैक जोडें और कई आइस पैक निकट शंक्वाकार ट्यूब जगह.
- केवल आइस पैक (और नहीं सूखी बर्फ) का उपयोग किया जाना चाहिए कृपया ध्यान दें कितरल और ऊतकों की ठंड से नुकसान को रोकने के लिए.
- पोत संकुल हे / n, लेकिन ऊतकों इन शर्तों के तहत 2 दिन पिछले कर सकते हैं.
Representative Results
अनुचित ठंड के साथ देखा कलाकृतियों का उदाहरण देते हैं, कई माउस quadriceps मांसपेशियों सामान्य रूप से सामना करना पड़ा त्रुटियों को दोहराने के लिए विभिन्न तकनीकों (चित्रा 3) का उपयोग जमे हुए थे. चित्रा 3 में दिखाया गया है, उचित रूप से जमे हुए कंकाल की मांसपेशी आसपास के ऊतकों (आमतौर पर अन्य मांसपेशी फाइबर, लेकिन कभी कभी myofibers के बीच endomysial अंतरिक्ष बीमारी या चोट प्रक्रियाओं की एक किस्म में फाइब्रोसिस या भड़काऊ कोशिकाओं से भर जाता है) को myofibers के एक तंग समानाधिकरण से पता चलता है और एक स्पष्ट रूप से दिखाई cytoplasmic डिब्बे. यह स्पष्ट रूप से इस में अपक्षयी परिवर्तन, पुनर्योजी परिवर्तन, या अन्य pathognomonic निष्कर्ष (केंद्रीय नाभिक, intracellular समावेशन) की उपस्थिति की पहचान करने के लिए आम तौर पर महत्वपूर्ण है के रूप में रोग विश्लेषण के लिए, intracellular अंतरिक्ष को देखने की क्षमता, अक्सर endomysial डिब्बे से ज्यादा महत्वपूर्ण है अंतरिक्ष. इस प्रकार, intracellular डिब्बे में बर्फ क्रिस्टल की उपस्थिति AM प्रतिनिधित्व करता हैमांसपेशियों के रोग मूल्यांकन में ajor समस्या.
मांसपेशियों के ऊतकों के समुचित ठंड दोनों पर्याप्त ठंडे तापमान और बर्फ के क्रिस्टल के गठन से बचने के लिए ठंड से एक पर्याप्त गति की आवश्यकता है. दोनों कारकों के लिए लेखांकन, तब भी जब काफी ठंड विरूपण साक्ष्य अभी भी मांसपेशियों के ऊतकों के भीतर क्योंकि अत्यधिक नमी के कारण हो सकता है. यह समस्या सबसे अधिक पहले से खारा में डूबे और अपर्याप्त सूखे या मांसपेशी अक्टूबर (चित्रा 3 बी, 3E) सेक्शनिंग के स्थल पर मीडिया बढ़ते के साथ सीधे संपर्क में रहा है जब गया था कि मांसपेशियों के ऊतकों में सामना करना पड़ा है. अक्टूबर के साथ कुछ संपर्क बढ़ते प्रक्रिया का एक परिणाम के रूप में आम तौर पर अपरिहार्य है, वहीं हर प्रयास histologically का मूल्यांकन किया और अक्टूबर बढ़ते के लिए इस्तेमाल किया जाएगा कि क्षेत्रों के बीच संपर्क से बचने के लिए किया जाना चाहिए. इसके विपरीत, एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर (चित्रा -3 सी) और तरल नाइट्रोजन (चित्रा 3 डी) के प्रयोग से जमे हुए नमूने उदाहरण प्रदानठंड की suboptimal तापमान या गति द्वारा निर्मित है कि ठंड विरूपण साक्ष्य की है. एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ऊतक रखकर सामना करना पड़ा धीमी जमने की प्रक्रिया विरूपण साक्ष्य ठंड का एक चरम उदाहरण प्रदान करता है. तरल नाइट्रोजन का उपयोग करते हैं, तो मुख्य समस्या तरल नाइट्रोजन और ऊतकों के बीच संपर्क ऊतक तरल इंटरफेस पर फार्म गैसीय नाइट्रोजन का एक म्यान का कारण बनता है, और यह गैसीय इंटरफ़ेस 1 ठंड तेजी से मांसपेशियों का निर्माण करने के लिए पर्याप्त रूप से ठंडा नहीं है. यह नमूना की सतह के पास महत्वपूर्ण ठंड विरूपण साक्ष्य उत्पादन कर सकते हैं, लेकिन नमूना के आंतरिक क्षेत्रों एक उचित दर पर फ्लैश फ्रीज करने की संभावना है और पूरी तरह से विरूपण साक्ष्य ठंड से बख्शा जा सकता है. तरल नाइट्रोजन में मांसपेशियों के ऊतकों की साधारण विसर्जन isopentane ठंड प्रक्रिया के रूप में उपयोगी पास कहीं भी नहीं है, यह isopentane ऐसे संस्थानों में नैदानिक शव परीक्षण नमूनों के रूप में (अनुपलब्ध साथ है जहां स्थितियों में बड़ी मांसपेशी नमूनों की ठंड के लिए उपयोगी हो सकता हैबाहर नैदानिक पेशी विकृति विज्ञान प्रयोगशालाओं). (कई आयामों में> 2 सेमी) ऊतक के बड़े हिस्से का उपयोग करते समय इस रणनीति का प्रयोग का परिणाम आम तौर पर बेहतर कर रहे हैं.
ठंड विरूपण साक्ष्य से बचाव के इष्टतम ऊतकीय परिणाम प्रदान करता है, एक तकनीक काफी अनुचित तरीके से जमे हुए ऊतक के मूल्यांकन की अनुमति के लिए कलाकृतियों ठंड पराजयों कि भी विकसित किया गया है (और इस के साथ साथ वर्णित है). अनुचित तरीके से (चित्रा 3E) जमे हुए है कि ऊतक thawed और फाइबर के भीतर पानी के पुनर्वितरण की अनुमति के लिए कसकर नियंत्रित परिस्थितियों (चित्रा 3F) के तहत refrozen, और प्राप्य है कि रूपात्मक संरक्षण की डिग्री उत्कृष्ट हो सकता है किया जा सकता है. हमारे अनुभव में, इस प्रक्रिया को एक उल्लेखनीय हद तक ऊतक के intracellular आकारिकी को बरकरार रखता है, लेकिन यह अक्सर endomysial अंतरिक्ष के भीतर फाइबर की एक artifactual जुदाई पैदा करता है. जैसा कि बहुत से रोग endpoints के intracellular अंतरिक्ष और उन में में पाए जाते हैंendomysial अंतरिक्ष सर्वश्रेष्ठ (फाइब्रोसिस को उजागर करने या अन्य प्रकार की कोशिकाओं की पहचान करने के लिए या तो) विशेष दाग का उपयोग कर देखा जाता है, इन artifactual परिवर्तन वास्तव में मांसपेशियों के रोग मूल्यांकन क्षीण संभावना नहीं है.
कंकाल की मांसपेशी की, संरचनात्मक कार्यात्मक, और सेलुलर अध्ययन के लिए ऊतक के चित्रा 1. वर्गीकरण. वांछित पढ़ाई के प्रकार पर निर्भर करता है, एकत्र कंकाल मांसपेशियों के ऊतकों के इष्टतम परिणामों के लिए तरीकों की एक किस्म में संसाधित किया जा सकता है. इस पत्र में उल्लिखित प्रोटोकॉल विशेषज्ञ कोर सुविधाओं से प्राप्य परिणामों का अनुकूलन करने के लिए परोक्ष पढ़ाई के लिए कंकाल की मांसपेशी नमूनों triaging या प्रसंस्करण के लिए विधियों का वर्णन.
चित्रा 2. मांसपेशी ठंड के लिए इस्तेमाल किया apparatuses के उदाहरण हैं. प्रोटोकॉल में वर्णित है, इष्टतम मांसपेशी ठंड अपने जमने के तापमान पर है कि isopentane में मांसपेशियों के ऊतकों का विसर्जन की आवश्यकता है. ठंडा isopentane प्राप्त करने का एक सुरक्षित और कारगर साधन तरल नाइट्रोजन युक्त आसपास के देवर में ठंडा है कि isopentane के लिए एक धातु कंटेनर का इस्तेमाल शामिल है. यह दोनों हाथों से मुक्त है करने के लिए अक्सर सुविधाजनक है, यह दो तरल पदार्थ के मिश्रण को रोकने जबकि तरल नाइट्रोजन में isopentane कंटेनर पकड़ करने के लिए इस तरह के (ए) खड़े एक अंगूठी के रूप में एक गले का उपयोग करना संभव है. वैकल्पिक रूप से, कंटेनर भी मैन्युअल तरल नाइट्रोजन (बी) में आयोजित किया जा सकता है. या तो मामले में, ऊतक isopentane दिख कंटेनर (आमतौर पर के रूप में अपारदर्शी सफेद कंकड़) के तल पर ठंड है, और फिर पूरी ठंड अनुमति देने के लिए 10-20 सेकंड के लिए डूब जाना चाहिए जब तक isopentane में नहीं रखा जाना चाहिए. Isopeठंड के तापमान पर ntane न्यूनतम "कोहरे" (काफी कोहरे मौजूद है यानी, तापमान अपर्याप्त है) पैदा करता है. ऊतक जमे हुए है एक बार, ठंड के बाद आकस्मिक विगलन को रोकने के लिए (एक कूलर या फ्रीजर में सीधे तो और) पूर्व ठंडा कंटेनर में सीधे जगह है. (सी) उचित घुड़सवार जमी पेशी जमे हुए अक्टूबर के एक बेस से फैला हुआ मांसपेशियों के ऊतकों का बहुमत होना चाहिए.
अक्तूबर बढ़ते मध्यम के साथ संपर्क में, (सी) मांसपेशी में जमे हुए हैं जबकि (ए) उचित isopentane जमी पेशी के चित्रा 3. विरूपण साक्ष्य ठंड, और प्रभावी विगलन / refreezing के के उदाहरण हैं. छवियों प्रतिनिधि, (बी) मांसपेशी isopentane में उचित रूप से जमे हुए है, लेकिन एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर, और (डी में (बी) में दिखाया गया है, अक्टूबर के उच्च तरल सामग्री इसके साथ संपर्क में है कि मांसपेशियों में महत्वपूर्ण ठंड विरूपण साक्ष्य, बढ़ते के लिए आवश्यक अक्टूबर की तो केवल न्यूनतम राशि का इस्तेमाल किया जाना चाहिए पैदा करता है, और ऊतकीय मूल्यांकन के लिए मांसपेशियों "खड़े होना चाहिए इसकी सतह से "बाहर. एक (सी) -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर या (डी) तरल नाइट्रोजन (बर्फ के ठंडे isopentane में ठंड की गति के सापेक्ष) का उपयोग करते हुए जमने की प्रक्रिया की सुस्ती महत्वपूर्ण ठंड विरूपण साक्ष्य का उत्पादन बढ़ सकता है. (कारण अक्टूबर के साथ अत्यधिक संपर्क करने के लिए) शुरू में suboptimally जमी (ई) था और तब (एफ) thawed और यहाँ बताया तकनीक का उपयोग refrozen कि एक ही नमूना से पैनलों ई और एफ शो पेशी. एक refrozen नमूने में फाइबर के बीच कुछ artifactual जुदाई का निरीक्षण कर सकते हैं, सुधार मैंn मांसपेशी फाइबर के intracellular आकारिकी आसानी से स्पष्ट है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Discussion
कंकाल की मांसपेशी एक संरचनात्मक और कार्यात्मक अनूठा ऊतक है, और विशेष तैयारी की प्रक्रियाओं संरचनात्मक और कार्यात्मक मापदंडों के इष्टतम आकलन की अनुमति आवश्यक है. ऊतकों की एक किस्म आमतौर पर नैदानिक और अनुसंधान संदर्भों में रोग के अध्ययन के लिए जमे हुए हैं, वहीं गैर मांसपेशियों के ऊतकों के लिए ठंड प्रोटोकॉल आमतौर पर ठंड से पहले अक्टूबर में ऊतक की कुल विसर्जन शामिल है. 3 चित्र में दिखाया गया है, इस तरह के एक प्रोटोकॉल कंकाल की मांसपेशी के रोग मूल्यांकन के लिए अनुपयुक्त है और अभी तक यह एक अधिक सामना करना पड़ा त्रुटि है कि यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल को काफी समान है. इस पत्र के लक्ष्य के लिए इस तरह के मुद्दों से बचने के लिए मांसपेशियों के समुचित से निपटने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल प्रदान करना है. सलाह भी मामलों में बाहर कोर प्रयोगशालाओं द्वारा उच्च गुणवत्ता वाले डेटा के अधिग्रहण को सुविधाजनक बनाने के प्रयास में परोक्ष शारीरिक और सेलुलर अध्ययन के लिए मांसपेशियों के समुचित से निपटने पर संकलित किया गया है wheपुन साइट पढ़ाई बेहतर या संभव नहीं हैं.
इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, रोग के अध्ययन के लिए मांसपेशियों की उचित प्रसंस्करण में बिल्कुल जरूरी है कि तत्वों, ऊतक के पानी की मात्रा को कम करने की मांसपेशी में जमे हुए है, जिस पर तापमान कम है, और ठंड हासिल की है जिस गति से बढ़ रही है शामिल हैं. ऊतक या (तरल नाइट्रोजन के साथ सामना करना पड़ा है के रूप में अपर्याप्त तापमान से या ठंड एजेंट और ऊतकों के बीच सीधे संपर्क का अभाव, द्वारा उत्पादित) जमने की प्रक्रिया का अत्यधिक सुस्ती के भीतर अत्यधिक नमी रोग विश्लेषण ख़राब कर सकते हैं कि कलाकृतियों ठंड को बढ़ावा मिलेगा. अक्टूबर ऊतक नमी का एक अतिरिक्त स्रोत प्रदान करता है, कई प्रयोगशालाओं एक embedding सब्सट्रेट के रूप में गोंद Tragacanth जैसे अन्य चिपकने का उपयोग करें. यहां तक कि ठंड उचित प्रदर्शन किया है जिन मामलों में, देखभाल आरटी कंटेनर या उपकरणों के साथ संपर्क के माध्यम से बाद में गलती से विगलन नमूनों से बचने के लिए लिया जाना चाहिए.इस प्रकार, एक सफल जमने की प्रक्रिया में इस्तेमाल किया जा करने के लिए सभी उपकरणों और कंटेनर के एक पूर्व द्रुतशीतन भी शामिल है कि योजना का एक डिग्री की आवश्यकता है. ठंड कलाकृतियों का सामना कर रहे हैं, तो सबसे रोग मूल्यांकन के लिए पर्याप्त है कि ऊतक की वसूली के लिए यहाँ वर्णित एक विधि है. हालांकि, इस फ्रीज / पिघलना चक्र सही ऊतक विज्ञान की पेशकश और (फिर से फ्रीज ऊतक के लिए आवश्यक समय के अलावा) ऊतक के अन्य आणविक या एंजाइमी पढ़ाई ख़राब करने की क्षमता है, तो उचित प्रारंभिक ठंड प्रथाओं का उपयोग बेहद पसंद किया जाता है नहीं है . ठंड विरूपण साक्ष्य पूर्व जमी ऊतक पर सामना करना पड़ा है जहां मामलों में, हालांकि, इस के साथ साथ वर्णित तकनीक बेहद उपयोगी हो सकता है.
ईएम पूर्व ऊतक संग्रह करने के लिए योजना बनाने की आवश्यकता है कि विशिष्ट तकनीकी चुनौतियों की पेशकश कर सकते हैं के लिए ऊतक के फिक्सेशन और प्रसंस्करण. EM के लिए नमूनों को एकत्रित करते समय सबसे आम त्रुटि glutaraldehyd के लिए भी मोटी हैं कि ऊतक टुकड़े का उपयोग शामिल हैई घुसना. Glutaraldehyde केवल एक सतह दिया, देखभाल से मांसपेशियों के ऊतकों में लगभग 0.1 सेमी प्रवेश के रूप में उन्हें नमूनों में से एक आयाम कोई मोटा 0.2 सेमी है कि यह सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए. ईएम सीधे सिकुड़ा तंत्र के मूल्यांकन का एक बहुत अच्छा साधन है के रूप में इसके साथ ही, कुछ जांचकर्ताओं रणनीति विकसित किया है मांसपेशी पूर्व निर्धारण के लिए पूर्व तनाव या पूर्व खिंचाव एक physiologically प्रासंगिक तनाव में सिकुड़ा तत्वों की माप की अनुमति देने के लिए. वहाँ पूर्व कसने के लिए कोई मानक प्रोटोकॉल है, लेकिन दो रणनीतियों संक्षेप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित हैं. यह वे एक बहुत ही विशेष तरीके से किया जाता है, और यह एक गैर मानक के माध्यम से sarcomere लंबाई में artifactual परिवर्तन को रोकने में सुस्त राज्य में मांसपेशियों को ठीक करने के लिए बेहतर हो सकता है, जब तक मांसपेशियों में अप्रत्याशित परिणाम उत्पन्न कर सकते पूर्व tensioning करने का प्रयास करता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए पूर्व कसने प्रक्रिया 8,9. ऐसे विशिष्ट माप सबसे बी सहित (आवश्यक नहीं कर रहे हैं, जिसमें मांसपेशियों के लिएनैदानिक प्रयोजनों के लिए किया iopsies), मांसपेशियों में तनाव पूर्व के प्रयासों में आम तौर पर नहीं बने हैं, और मांसपेशियों आकारिकी पर मुख्य प्रभाव मांसपेशी में sarcomeres की एक गैर वर्दी रिक्ति है.
इस पत्र में जन्मजात मांसपेशियों की बीमारी के क्षेत्र में परीक्षण के प्रदर्शन के लिए रियायतों प्रदान करने के लिए एक श्रृंखला में पहली बार प्रतिनिधित्व करता है, और यह नियमित रूप से सेलुलर, आणविक, कार्यात्मक, शारीरिक प्रदर्शन कि जन्मजात मांसपेशियों की बीमारी के क्षेत्र में 20 से अधिक विशेषज्ञों के प्रयासों का प्रतिनिधित्व करता है, और रोग अनुसंधान. प्रकाशित रियायतों की एक श्रृंखला की आगामी वर्ष से अधिक उपलब्ध कराया जाएगा, और प्रत्येक के लिए आवश्यक प्रोटोकॉल और उचित प्रकाशन प्रारूपों इस शराबी प्रयास का लक्ष्य प्रदान करना है वॉशिंगटन डीसी में 2013 के अप्रैल में आयोजित एक जन्मजात मांसपेशियों की बीमारी के कंसोर्टियम कार्यशाला में चर्चा की गई 1) एम के रूप में हमारे क्षेत्र में इस्तेमाल किया प्रथाओं और endpoints के प्रमाण के अनुसार जन्मजात मांसपेशियों की बीमारी के क्षेत्र में आवश्यक परीक्षण और नमूनों के विश्लेषण के लिए एक रोडमैपसंभव है, और के रूप में uch 2) हमारे क्षेत्र में नए शोधकर्ताओं के लिए मानक प्रथाओं पर शिक्षा प्रदान करते हैं. हम इन संसाधनों हमारे अधीन अध्ययन क्षेत्र में नए जांचकर्ताओं के प्रवेश की सुविधा है और इस तरह का प्रदर्शन किया जा सकता है कि अनुसंधान के दायरे में सुधार होगा. इसके अतिरिक्त, प्रथाओं का एक मानकीकरण अध्ययनों में आंकड़ों की तुलना करने के लिए और preclinical और नैदानिक परीक्षणों की योजना बना और जब प्रदर्शन endpoints की पहचान करने के लिए अत्यंत उपयोगी हो जाएगा.
इस लेख का मुख्य फोकस पढ़ाई की एक किस्म के लिए उपयुक्त ठंड और ऊतकों की तैयारी से संबंधित है, जबकि हमारे सहयोगी समूह भी पेशी नमूनों के रोग विश्लेषण के लिए उपयोगी endpoints पर चर्चा की. वर्तमान में, वहाँ रोग विश्लेषण करते समय लेने के लिए दृष्टिकोण पर कोई आधिकारिक आम सहमति है, और विभिन्न अध्ययनों की एक किस्म प्रत्येक संबंधित बीमारी के लिए पूर्व प्रकाशन के लिए नए निष्कर्ष संबंधित करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं. इस प्रकार, हम यह करने के लिए उपयोगी होगा कि सोचापेशी विकृति के लक्षण वर्णन में रोग endpoints की योजना बनाने के लिए कुछ सामान्य दिशा निर्देशों का प्रस्ताव. पिछले एक अध्ययन में विकृति बढ़ाता, काफी सोचा) 1 में फाइबर आकार माप की विधि रखा जाना चाहिए, 2) फाइबर प्रकार विशिष्ट असामान्यताएं या उपचार के प्रभाव की संभावना, 3) असामान्यताएं या प्रभाव की संभावना सीमित कर रहे हैं कि व्यक्ति की मांसपेशियों के लिए, और 4) के एक अध्ययन के तहत बीमारी के लक्षण हैं कि रोग निष्कर्षों बढ़ाता के लिए एक रणनीति. फाइबर आकार सबसे अध्ययन के लिए एक आवश्यक समापन बिंदु है, और दुर्भाग्य से यह मात्रा निर्धारित है कि कैसे में व्यापक भिन्नता है. कई अध्ययनों से मालिकाना इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदान की स्वचालित मात्रा का ठहराव तरीकों का उपयोग कर इन परिणामों की रिपोर्ट, लेकिन इन कार्यक्रमों में से कई इन स्वचालित माप गलत प्रदान कर सकते हैं (जैसे फाइबर हलकों या ellipses हैं संभालने के रूप में) शॉर्टकट ले. यह इन स्वचालित प्रोग्राम उनके माप ख कैसे समझ लेना जरूरी हैefore माप में विश्वास रहा है, और हम कागज तरीकों में इन विवरण शामिल करने के लिए जांचकर्ताओं प्रोत्साहित करते हैं. इसके अतिरिक्त, फाइबर आकार निरूपित किया जाता विशिष्ट माप अत्यंत चर रहा है, और कुछ माप दूसरों 10,11 करने के लिए बेहतर हैं. फाइबर आकार का आमतौर पर इस्तेमाल किया माप शारीरिक अध्ययन के प्रदर्शन जांचकर्ताओं अपने उपकरणों का उपयोग कर प्राप्त सीएसए माप के लिए उनके परिणामों के मानकीकरण, विशेषकर इसलिए क्योंकि फाइबर पार के अनुभागीय क्षेत्र (सीएसए) है. सीएसए माप सही सही अनुप्रस्थ वर्गों में फाइबर आकार को प्रतिबिंबित कर सकते हैं, जबकि दुर्भाग्य से, वे (अनुदैर्ध्य या तिरछे से sectioned फाइबर कृत्रिम रूप से उच्च सीएसए माप होगा कि सीमा तक) फाइबर उन्मुखीकरण पर बड़े पैमाने पर निर्भर कर रहे हैं और फाइबर आकार के लिए इस प्रकार आदर्श नहीं नाप रहे हैं. फाइबर पार के अनुभागीय क्षेत्र पर कम निर्भर है कि फाइबर आकार का एक बेहतर माप वीं की माप है जो न्यूनतम Feret व्यास (MinFeret व्यास), हैपेशी सेल 12 में ई नाबालिग व्यास. इस माप फाइबर उन्मुखीकरण पर केवल थोड़ा निर्भर है और आम तौर पर फाइबर माप के लिए नैदानिक सोने का मानक है, और जांचकर्ताओं इस तकनीक के उपयोग की ओर ले जाने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है. इन मापों अक्सर सीएसए माप 13 उत्पन्न करता है कि एक ही सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जा सकता है, और भी मैन्युअल मापने के लिए सीधा कर रहे हैं कर सकते हैं. फाइबर प्रकार, विशिष्ट मांसपेशी, और विशिष्ट रोग से संबंधित रोग निष्कर्षों के संदर्भ में के अनुसार रोग डेटा का मूल्यांकन करने के लिए सम्मान के साथ, ये तो बस एक अध्ययन की योजना बनाने के दौरान विचार किया जाना चाहिए कि कम विवादास्पद मुद्दे हैं. फाइबर प्रकार immunohistochemical या ATPase धुंधला का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है, लेकिन यह विशिष्ट मांसपेशियों और जानवरों की प्रजातियों इन फाइबर प्रकार के विशिष्ट मिश्रण (इस प्रकार विभिन्न उम्मीदों की जरूरत महसूस और रणनीतियों के परीक्षण) है कि विचार करने के लिए उपयोगी है. स्नायु विशिष्ट रोग भागीदारी या उपचार प्रभावकारिताहोते हैं, और कुल मांसपेशी वजन नियंत्रण की तुलना में विकृतिविज्ञानी मूल्यांकन करने के लिए मांसपेशियों पर निर्णय लेने से पहले बीमारी की विविधता की डिग्री की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है सकते हैं. अंत में, यह अच्छी तरह से कई मांसपेशियों की बीमारियों (जैसे nemaline मायोपथी में nemaline छड़ के रूप में) विशिष्ट रोग असामान्यताएं 14,15 के साथ जुड़े रहे हैं जाना जाता है, और इसलिए यह इन असामान्यताएं एक फाइबर प्रकार या मांसपेशी में पाए जाते हैं कि क्या विचार करने के लिए भी उपयोगी है विशेष वितरण विश्लेषण 16,17 जब प्रदर्शन. हम पेशी के मूल्यांकन के लिए मानकों का एक कड़ा सेट प्रस्ताव नहीं है, जबकि कुल मिलाकर, हम इन मुद्दों पर पहले किसी भी कंकाल की मांसपेशी रोग में रोग के अध्ययन के प्रदर्शन के लिए विचार किया जाना चाहिए कि विश्वास करते हैं.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For tissue freezing | |||
| Liquid nitrogen dewar with a liquid withdrawal device | Custom Biogenic Systems | Lab-5 Series | Any other liquid nitrogen dewar could substitute. |
| Cold-conductive container | Fisher | 02-583A | |
| Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen | Nalgene | 4150-2000 | |
| Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer | Thomas Scientific | 1228Y01 | Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing. |
| For single fiber functional testing | |||
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11 | |
| Sylgard coating | Ellsworth Adhesives | 3-6636 | |
| Dissection stereomicroscope | Harvard Apparatus | 693101 | Any other dissection microscope could substitute. |
| For cell culture | |||
| Sterile laminar flow hood | Thermo Scientific | 51022485 | Any other cell culture hood could substitute. |
| For tissue freezing | |||
| Plastic bags/containers | Nasco | B01009WA | |
| Thermal safety gloves | Denville | G4162 | |
| Face shield | Fisher Scientific | S47640 | |
| Long forceps | Fisher Scientific | 12-460-807 | |
| Marker | Staples | 125328 | |
| For cell culture | |||
| Sterile 50 ml conical tubes | Denville | C1060-P | |
| PES filter unit, 500 ml, 0.22 µm | Denville | F5227 | |
| Sterile forceps | Fisher Scientific | 644320 | |
| Ice packs | Fisher Scientific | NC9909223 | |
| Insulated styrofoam box | Polar Tech | 207F | |
| Packing tape | Staples | 795570 | |
| Tissue freezing | |||
| Liquid nitrogen | Airgas | NI NF160LT350 | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma | M32631-4L | Store Isopentane in a flammable materials cabinet. |
| EM fixative (choose one) | The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM. | ||
| 2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 16537-15 | |
| Karnovsky's fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer) | Electron Microscopy Sciences | 15732-10 | |
| For functional studies (if desired) | |||
| Relaxing solution, containing (in mmol/L) | |||
| 40 BES | Sigma | B9879 | |
| 10 EGTA | Sigma | E4378 | |
| 6.56 MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| 5.88 Na-ATP | Sigma | A3377 | |
| 1.0 DTT | RPI | D11000 | |
| 46.35 K-propionate | Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1 | ||
| 15 creatine phosphate, pH 7.0 | Sigma | P7936 | |
| 0.4 leupeptin | Calbiochem | 10895 | |
| 0.1 PMSF | Sigma | P7676 | |
| Skinning solution, containing | |||
| Relaxing solution (See Above) | |||
| 0.5% Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Indicating silica granules | |||
| Flat pieces of cork (1 x 1 inch) | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| For cell culture (if desired) | |||
| Complete Growth Medium, containing (for 500 ml) | Sterilize by filtering the solution through a 500 ml 0.22 µm PES filter unit. Store at 4°C and use within 1 month. | ||
| 395 ml of high glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D5671 | |
| 100 ml of fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F6178 | |
| 5 ml of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG) | Sigma | G1146 | |
| See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications |
References
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