Abstract
İskelet kası, çünkü işlevsel hücresel, moleküler ve patolojik değerlendirme en iyi sonuçları elde etmek için doku toplama için özel protokoller gerektirir yapısı ve işlevi, eşsiz bir dokudur. Doğuştan kas hastalığı iskelet kas değerlendirirken nedeniyle doğuştan kas hastalıkları ve bu özelliklerin tanınması ile müdahale tespit için potansiyel görülen bazı patolojik anormalliklerin incelik için, dondurulmuş kas patolojik değerlendirilmesi sabit kas tercih edilir. Diğer dokular dondurulurken, yaygın olarak kullanılmaz, histolojik inceleme için iskelet kas dondurma ek olarak, kas ağır dondurma eserler üretilmesi için muhtemel özel önlemleri gerektirir. Bu makale uygun iskelet kası morfolojisi korumak için sıvı nitrojen ile soğutulur izopentan (2-metilbütan) kullanılarak iskelet kası hızlı dondurulması için bir protokol açıklamaktadır. Bu işlem aynı zamanda f etkilidirgenetik ve protein ifade çalışmaları için tasarlanmıştır doku reezing. Ayrıca, biz toplamak için gerekli minimum çaba odaklanarak da (1) Tek lif fonksiyonel çalışmalar ve (2) myoblast hücre kültürü için doku kısa vadeli triajın için tercih edilen yöntemleri açıklayan geniş bir prosedür, içine bizim dondurma protokolü entegre etmiş doku ve bu çalışmaları tamamlamak için özel bir araştırma veya referans laboratuarları nakleder. Genel olarak, bu el yazması taze doku etkili fenotipik çalışmalar çeşitli dağıtılmış olabilir nasıl bir taslağını sağlayan ve böylece doğuştan kas hastalığı ile ilgili patolojik çalışmalar için standart işletim prosedürleri (SOP) sağlar.
Protocol
Hasat edilmiş hayvan ve kas için uygun tanımlayıcıları ile kas depolama için kullanılacak kaplar etiketleyin. Ilave edildiğinde torba / kaplar ve aletler doku dondurma / çözülme önlemek için önceden soğutmak.
Kas Doku Koleksiyonu için 1. Çalışma-tasarım Hususlar
- Küçük hayvan modelleri genellikle patolojik çalışmalar için yeterli miyofiberde oluşan örnekleme sağlamak için bütün bir kas değerlendirme gerektiren beri küçük hayvan için kas hastalığı (fare) modelleri, çalışma için bütün bir kas kullanın. Büyük bir hayvan için, kas hastalığı (köpek) modelleri, çapraz (enine kesit) yönü içinde, en azından 0.3 x 0.3 cm veya daha büyük olan kas bölümlerini kullanır.
Not: Çekirdek biyopsileri de kullanılabilir, ancak örnekleme sorunları nedeniyle birinci karakterizasyon çalışmalar için optimum altı olabilir. - Sarkomerinde içeren çalışmalar için, sarkomer uzunluğu ultrastrüktürel ölçümü kritik bir bitiş noktası içerebilir ve requ olabilirire işleme uzman. Bu genellikle hastalıklarda sadece ilgili olduğu nemaline miyopati bazı nedenleri olarak sarkomer gösteri uygunsuz uzunlukları elemanları,. Bazı laboratuvarlar yerine non-gerilmiş veya non-gergin kas bu ölçümler gerçekleştirirken daha, onun olmayan sözleşmeli veya gerilmiş durumda kas düzeltmek için tercih.
- Sarkomer uzunluğu ölçülür olmayacak eğer, (Reaktifler bakınız) istenilen EM fiksatif içine doğrudan yerleştirerek kas ön-germe olmadan kas dokusunu düzeltmek.
- Sarkomer uzunlukları ölçülür edilecek olursa, (Tartışma) kas ön germek için çeşitli teknikler kullanılabilir:
- Bu hayvan hala iken dinlenme gerilimde kas tutmak için bir sıkıştırma aygıtını kullanarak, kelepçenin dış çevresinde kas tüketim ve (Reaktifler bakınız) istenen EM sabitleyici doğrudan yerleştirin.
- Stretch ve gözlemlenmiştir benzer bir uzunlukta (örneğin mantar bir parçası olarak), bir yüzeye kas pin
2.. İstenilen Çalışmalar için uygun olan Fragments içine İzole İskelet kas Sub-bölmek (Şekil 1)
- Dondurulmuş kas histoloji için:
- Örnekleme verevi en aza indirmek (adım 1.1), ancak örnekler <eserler donmaması için 1.5 cm olmalıdır mümkün belirli bir kas kadar içerir.
- Nedeniyle işleme farklılıklara fiber boyutunda farklılıklar suni önlemek için benzer şekilde aynı çalışma her tedavi kas.
- Elektron mikroskobu (EM) için:
- Orijinal kas uzunlamasına eksenine paralel örnek uzunlamasına ekseni ile, örnek bir kas ~ 0.5 x 0.2 x 0.2 cm şerit kesin.
NOT: sabitleştirci yeterli yani 2 mm veya daha az numune kalınlığı muhafaza, doku kalın parçalar nüfuz olmayacaktır uygun sonuçlar elde etmek çok önemlidir. Ek olarak,kas gibi küçük parçaları yönlendirme genellikle zordur gibi, kas için, asıl yönü (yani, sabit numunenin uzun yönü, kas / myofibers uzunlamasına yönlendirmesidir) taklit eden bir doku parçasının kullanılması tavsiye edilir EM işleme sırasında tutuşu ve karışıklığı en aza indirmek.
- Orijinal kas uzunlamasına eksenine paralel örnek uzunlamasına ekseni ile, örnek bir kas ~ 0.5 x 0.2 x 0.2 cm şerit kesin.
- Hücre kültürü için:
- İstenilen hücre verimi hücre kültürü kurulması için gerekli kas miktarını etkileyebilir. Tek kaslar (veya kas kısımları) küçük hayvanların hücre kültürleri kurmak için yeterli hücre sayıları sağlamak, böylece olabilir gerekirse, birden fazla kas gelen havuz doku.
Elektron Mikroskopi (EM) 3. Doku Fixation ve İşleme
- (Reaktifler bakınız) istenen EM sabitleyici içine doğrudan ince boyutta 2 mm'den daha büyük bir kas fragmanı yerleştirin.
- Fixati arasında 2-48 saat sonra (Reaktifler bakınız) EM sabitleyici tampon maddesi içinde kas yerleştirinüzerinde. (Haftalarca veya aylarca) Uzun süreli sabitleme EM çalışmalar ultrastrüktürel ayrıntı kaybına neden olabilir.
- Işlenmesi için bir EM çekirdek tesisine gönderin.
Histolojik, Biyokimyasal ve Moleküler Çalışmalar 4. Kas Donma
- Doku havlu hafif yapışkan olana kadar iyice bir kağıt havlu ile numune blot ile numune aşırı nemi. Aşırı nem, kas önemli donma eserler üretecek.
Not: Doku ayrıca bebek toz yuvarlayarak kurutulabilir. Bu aşırı nemli ortamda olmuştur sürece, bu adım, genel olarak kaslar için gerekli değildir. - Yönlendirilmiş kas (Şekil 2C) için bir zemin temin etmek üzere, sadece yeterli Ekim olan, sığ cryomold dibinde veya mantardan Ekim üzerinde (veya kitre gibi benzer bir yapışkan) yerleştirin. Donma önce mantar veya cryomold etiketleme numune takibi için yararlı olabilir.
- Carefully kesitsel kas Ekim (Şekil 2C) ile temas halinde değildir, böylece Ekim çıkıntılı kas çoğunluğu ile, istenen şekilde kalıp içine kas yerleştirin.
- Yaklaşık 3-4 cm derinliğe ulaşıncaya kadar metal bir fincan izopentanın ekleyin.
- Termal emniyet eldiven giyin ve Dewar kapağını kaldırın.
- Bardağın dış sıvı azot seviyesi fincanın iç izopentan seviyesinin üstünde olacak şekilde, sıvı azot ile temas halinde olan metal kabı yerleştirin veya tutun. Bu kaplar düzenlemek için stratejiler, Şekil 2 'de gösterilmiştir.
- Onunla çalışmak hantal olabilir köpüren köpük üreten (ve dondurma için de yeterince soğuk) gibi, sıvı nitrojen, metal bardak girmesine izin vermeyin.
- Bu uygun sıcaklığa ulaştığını belirlemek için izopentanın gözlemlemek. Uygun bir sıcaklıkta (optimal arasında -140 -149 ° C), bu yüzdendondurulmuş izopentanın kapak beyaz çakıl taşları (bir kaç dakika sonra, ve ilk sis izopentanın yukarıdaki kayboldu sonra) oluşturacak fincan alt veya çözüm genelde pekmez kıvamına kalınlaştırmak olacak. Önce bu aşamaya dondurma dondurma atifacts verecektir.
- Isopentan tamamen katı donarsa, çözülme ve sonraki kullanımdan önce tekrar dondurucu soğuklar için o soğuk.
- Önceden soğutulmuş forseps kullanılarak, yaklaşık 10-20 saniye boyunca izopentan içine numune ve mantar / alt kalıp.
- Önceden soğutulmuş bir kaba donmuş numune yerleştirin.
- -80 ° C dondurucu transferine kadar her zaman kuru buz üzerinde numune ve muhafaza edin.
Donma Artifact Zaten Frozen Doku mevcut ise 5., Bu Prosedür izlenerek kullanılması Donma Artifacti derecesi geliştirin "Yumuşama ve tekrar dondurmayın" Olası bir
- Bir anda dondurucu, biri dışında blok almak, Ve kuru buz üzerinde saklayın. Bu protokolün zamanlaması önemlidir. Sadece çözülme ve her seferinde bir blok dondurursam.
- Kuru buz oda sıcaklığına örnek taşıyın.
- Örnek Ekim gömülü ise, bir neşter kullanarak mümkün olduğunca tamamen çevreleyen Ekim çıkarın.
- Örnek değil, bunun kurumasını olduğu noktaya, tamamen çözülmüş noktaya OS'nda erimesine izin verin.
- Yavaşça numune tamamen sonraki adıma ilerleyen önce çözülmüş olduğundan emin olmak için bir forseps ile numune eşya.
- Adımlarla 4,1-4,10 belirtilen kas dondurun.
Skinned Tek Fiber Fonksiyonel Test Kası 6. Hazırlanması
- Kas için depolama prosedürü kas / lif deneyleri için kullanılan zaman bağlıdır.
- Bir kaç hafta içinde kullanım için, -20 ° C 'de (Reaktifler bakınız) çözeltisi rahatlatıcı% 50 glycerol/50% çözeltisi içinde kas yerleştirin ve mağaza
- Kullanım aft içinBirkaç hafta er, -80 ° C'de (Reaktifler bakınız) çözeltisi rahatlatıcı% 75 glycerol/25% çözeltisi içinde kas yerleştirmek ve depolamak
- Alternatif olarak, -80 ° C'de silis granülleri kas kuru, iğne mantar için, ve mağaza izin Bu susuz kaslar yıl için de kullanılabilir.
Dış Laboratuvarları Hücre Kültürü nakliyesine için Taze Kas 7. Hazırlanması
Hücre kültürlerinin kurulması için başka protokoller 4-7 de tarif edilmiştir.
- Steril tam büyüme ortamı ile bir 50 ml'lik steril bir konik tüp doldurun.
- Tam ortam içinde daldırılması doku, steril bir forseps kullanılarak tüp kas dokusu ekleyin.
- Nakliye sırasında kurumasını önlemek için ortam ile tüp kalan doldurun.
- Strafor kutu buz paketleri ekleyin ve birkaç buz paketleri yakın konik tüp yerleştirin.
- Sadece buz paketleri (ve kuru buz) kullanılması gerektiğini unutmayınsıvı ve doku dondan zarar görmesini önlemek için.
- Gemi paketleri O / N, fakat dokuların bu şartlar altında 2 gün sürebilir.
Representative Results
Uygunsuz dondurma ile görülen eserler örnekler sağlamak için, birçok fare kuadriseps kaslar sık karşılaşılan hataları çoğaltmak için farklı teknikler (Şekil 3) kullanılarak dondurulmuştur. Şekil 3A'da görüldüğü gibi, uygun bir şekilde dondurulmuş iskelet kası çevreleyen doku (genellikle diğer kas lifleri, ama bazen myofibers arasındaki boşluk endomisyal hastalık veya yaralanma süreçlerin çeşitli fibrozu ya da enflamatuar hücre ile doldurulur) için myofibers sıkı bir appozisyon gösterir ve açıkça görülebilen bir sitoplazmik bölmesi. Açıkça bu dejeneratif değişiklikler, rejeneratif değişiklikler veya diğer patognomonik bulgular (merkez çekirdekleri, hücre içi inklüzyonlar) varlığını tespit etmek genellikle kritik olarak patolojik inceleme için, hücre içi alanı görüntülemek için yeteneği, sık sık endomisyal bölmesine daha önemlidir alanı. Bu nedenle, hücre içi bölmesindeki buz kristallerinin mevcudiyeti am temsil ederkas patolojik değerlendirmesinde ajor sorun.
Kas dokusunun uygun dondurucu hem de yeterince soğuk sıcaklıklar ve buz kristallerinin oluşmasını önlemek için yeterli bir donma hızı gerektirir. Her iki faktör için muhasebe bile, ciddi donma eserdir hala kas dokusu içinde aşırı nem nedeniyle oluşabilir. Bu sorun, en sık önceden tuzlu batırılır ve yetersiz kurutulmuş veya kas Ekim (Şekil 3B, 3E) Kesit yerinde montaj medya ile doğrudan temas içinde olmuştur zaman olmuştu kas dokusunda karşılaştı. Ekim bazı iletişim montaj işleminin bir sonucu olarak genellikle kaçınılmazdır birlikte, nitelikli histolojik olarak değerlendirildi ve Ekim monte etmek için kullanılacak alanlar arasında teması önlemek için yapılmalıdır. Buna karşılık, bir -80 ° C dondurucu (Şekil 3C) ve sıvı azot (Şekil 3D) kullanılarak dondurulmuş numuneleri örnek teşkildonma suboptimal sıcaklık veya hız tarafından üretilen dondurma dışlayıcı s. -80 ° C derin dondurucuda doku yerleştirerek karşılaştığı yavaş dondurma işlemi objeyi donma aşırı bir örnek sağlar. Sıvı azot kullanılarak, ana problem, sıvı nitrojen ile doku arasında iletişim doku-sıvı arayüzünde oluşturmak üzere gaz halinde bir azot kılıf neden olur ve bu gaz arayüzü 1 dondurma hızlı kas üretmek için yeterince soğuk olmasıdır. Bu, numunenin yüzeyine yakın önemli dondurma objeyi üretebilir, ancak numunenin iç alanları uygun bir hızda flaş-dondurularak olasılığı daha yüksektir ve tamamen objeyi dondurma korunmuş olabilir. Sıvı azot içinde kas dokusunun basit daldırma izopentan dondurma işlemi olarak faydalıdır yakın yerde iken, izopentan gibi kurumlarda klinik otopsi numuneler olarak (kullanılamaz ile olduğu durumlarda büyük bir kas numunelerin dondurma için yararlı olabilirÇıkış klinik kas patoloji laboratuarları). (Çeşitli ebatlarda> 2 cm) doku büyük miktarlar kullanılarak, bu strateji kullanılarak sonuçlar genellikle daha iyidir.
Dondurma dışlayıcı kaçınma uygun histolojik sonuçlar sağlamakla birlikte, esas itibarıyla düzgün bir teknik dondurulmuş doku değerlendirilmesini sağlamak için eserler dondurma tersine bu da geliştirilmiştir (ve bu tarifnamede anlatıldığı gibi) vardır. Doğru bir biçimde (Şekil 3E) dondurulur Doku çözülmüş ve liflerin içinde suyun dağıtılması izin vermek için sıkı bir şekilde kontrol edilen şartlar (Şekil 3F) altında refrozen ve elde edilebilir morfolojik koruma derecesi mükemmel olabilir edilebilir. Deneyimlerimize göre, bu işlem, dikkate değer bir ölçüde doku hücre morfolojisini koruyan, ancak genellikle endomisyal alanı içinde liflerin bir suni ayrılmasını üretir. Birçok patolojik uç noktalar, hücre içi alan ve bu olarak bulunurlarendomisyal uzay iyi (fibrozis vurgulamak için ya da diğer hücre tiplerini belirlemek ya) özel boyalar kullanılarak görüntülenebilir, bu suni değişiklikler gerçekten kas patolojik değerlendirme zarar vermemektedirler.
Iskelet kası, yapısal, işlevsel ve hücresel çalışmalar için doku Şekil 1.. Triage. Istenilen çalışmalar türüne bağlı olarak toplandı, iskelet kası dokusu en iyi sonuçlar için çeşitli şekillerde işlenebilir. Bu yazıda belirtilen protokoller uzman çekirdek tesislerinden elde sonuçları optimize etmek için off-site çalışmaları için iskelet kası örnekleri triaging veya işleme yöntemleri açıklanmaktadır.
Şekil 2,. Kas dondurma için kullanılan aparatların örnekleri. Protokolde tarif edildiği gibi, uygun, kas donma donma sıcaklıktadır izopentan içinde kas dokusunun daldırma gerektirir. Buzla soğutulmuş izopentan elde edilmesi için güvenli ve etkili bir araç, sıvı azot içeren bir Dewar çevreleyen soğutulur izopentan için bir metal kap kullanımını gerektirir. Her iki eller serbest olması da uygun olduğu için, bu iki sıvıların karışımını önlerken, sıvı azot içinde izopentan kabı tutmak için örneğin (A) bir halka stand olarak bir kuşak kullanmak mümkündür. Seçenek olarak ise, kabın el ile de sıvı azot ile (B) 'de tutulabilir. Her iki durumda da, doku izopentan gözle görülür bir kap (genellikle opak, beyaz çakıl) altındaki dondurma, ve daha sonra tam dondurma izin vermek için, 10-20 saniye için daldırılmış olmalıdır kadar izopentan yerleştirilir olmamalıdır. Isopedonma sıcaklığında ntane minimal "sis", (önemli bir sis varsa, yani, sıcaklık yetersiz olduğu) üretir. Doku dondurulmuş sonra, dondurma işleminin yanlışlıkla çözülme önlemek için (bir soğutucu veya dondurucu doğrudan ve daha sonra) daha önceden soğutulmuş kaplar içine doğrudan yerleştirin. (C) Doğru monte edilmiş dondurulmuş kas dondurulmuş OCT bir tabanından çıkıntı yapan kas dokusunun çoğunluğu olmalıdır.
Ekim montaj ortamı ile temas durumunda, (C) kas donmuş durumda, (A) uygun bir izopentan dondurulmuş kas Şekil 3. Objeyi dondurma, ve etkili bir eritme / tekrar soğutulmasından ve örnekler. Örnek görsel (B) kas izopentan içinde uygun bir dondurulmuş, ama Bir -80 ° C dondurucu, ve (D (B) 'de gösterildiği gibi, Ekim yüksek sıvı içeriği onunla temas halinde olan kas önemli donma objeyi, montaj için gerekli Ekim dolayısıyla sadece minimum miktarda kullanılmalıdır üretir ve histolojik değerlendirme için kas "ayakta olmalıdır yüzeyinden "dışarı. Bir (C) -80 ° C dondurucu ya da (D) sıvı azot (buz gibi soğuk izopentan içinde donma hızına göre) kullanılarak dondurma işleminin yavaş olması önemli dondurma dışlayıcı üretimine yol açabilir. (Nedeniyle, Ekim ile fazla temas için) ilk olarak ideal olarak dondurulmuş (E) ve daha sonra (F) çözündürüldü ve burada tarif edilen teknik kullanılarak refrozen aynı örnekten Paneller E ve F göstermek kas. Bir refrozen numunedeki liflerin arasında bir suni ayırma gözlemlemek mümkün olmakla birlikte, gelişme in kas liflerinin hücre morfolojisi kolayca görülür. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Discussion
İskelet kası bir yapısal ve işlevsel benzersiz dokusu ve özel hazırlık prosedürleri yapısal ve fonksiyonel parametrelerin optimum değerlendirmesini sağlamak için gereklidir. Dokuların çeşitli yaygın klinik ve araştırma bağlamlarda patolojik çalışmalar için dondurulur birlikte, non-kas dokuları için donma protokoller genellikle dondurma işleminden önce Ekim dokusunun toplam daldırma içerir. Şekil 3'te gösterildiği gibi, bu tür bir protokol iskelet kası patolojik değerlendirilmesi için uygun olan ve yine de bu sık karşılaşılan hata olduğu burada tarif edilen protokol için yeterince benzer. Bu yazının amacı bu gibi sorunları önlemek için kas doğru kullanımı için basit bir protokol sağlamaktır. Önerileri de durumlarda çekirdeği dışında laboratuvarlar tarafından yüksek kaliteli veri kazanımını kolaylaştırmak amacıyla off-site fizyolojik ve hücresel çalışmalar için kas doğru kullanımı üzerinde derlenmiştir where yerinde çalışmalar tercih veya mümkün değildir.
Bu protokolde belirtildiği gibi, patolojik çalışmalar için kas uygun işlem kesinlikle gerekli olan elemanları, doku su içeriği minimize kas dondurulur sıcaklığın azaltılması ve dondurma elde edilir hızını artırarak içerir. Doku veya (sıvı azot ile karşılaşıldığında yetersiz sıcaklıkları ile ya da dondurma maddesi ve doku arasında doğrudan bir temas olmaması, tarafından üretilmiş) dondurma işleminin aşırı yavaşlık olan aşırı nem patolojik analizi bozabilir eserler dondurma yol açacaktır. Ekim doku nem ek bir kaynak sağlar gibi, birçok laboratuvarda bir gömme alt tabaka olarak kitre zamkı gibi diğer yapıştırıcılar kullanın. Hatta donma uygun gerçekleştirilir durumlarda, bakım RT konteynerler veya aletlerle temas yoluyla sonradan yanlışlıkla çözülme örnekleri önlemek için alınmalıdır.Bu nedenle, bir dondurma işleminin başarılı kullanılacak tüm aletler ve konteynerlerin bir ön soğutma içeren planlama derecesi gerektirir. Dondurma eserler karşılaşılan zaman, çoğu patolojik değerlendirme için yeterli olan doku kurtarma için burada tarif edilen bir yöntem yoktur. Bununla birlikte, bu dondurma / çözme döngüsü mükemmel histoloji sunmak ve (yeniden dondurma doku için gerekli olan zaman ek olarak) doku diğer moleküler ya da enzimatik çalışmaları zarar potansiyeline sahip, çok uygun başlangıç donma uygulamaları kullanarak çok tercih edilir etmez . Donma artefakt, önceden dondurulmuş dokuda karşılaşılan durumlarda, ancak burada tarif edilen teknik, son derece yararlı olabilir.
EM önce doku toplama planlama gerektiren özel teknik zorlukları sunabilir için doku tespiti ve işlenmesi. EM için numune toplama En sık karşılaşılan hata glutaraldehyd için çok kalındır doku parçalarının kullanımını gerektirire nüfuz. Glutaraldehit, sadece belirli bir yüzey, bakım kas dokusu içine, yaklaşık 0.1 cm nüfuz olarak EM örneklerinin bir boyuta kalın 0.2 'den cm olduğundan emin olmak için dikkat edilmelidir. EM doğrudan kasılma cihazı değerlendirerek mükemmel bir araçtır Buna ek olarak, bazı araştırmacılar stratejiler geliştirdik kas öncesinde tespit öncesi gerginlik veya önceden streç fizyolojik ilgili bir gerilimde kontraktil elemanların ölçümü izin için. Orada ön-germe için standart bir protokoldür, ancak iki strateji kısaca bu protokolü tarif edilmiştir. Onlar çok özel bir şekilde yapılır ve bir standart dışı ile sarkomer uzunluğu artifaktüel değişiklikleri önlemek için gevşek devlet kasları düzeltmek için tercih edilebilir sürece kas öngörülemeyen sonuçlar üretebilir ön-germe girişimleri dikkat edilmelidir Önceden germe işlemi 8,9. Bu tür özel ölçümler de dahil olmak üzere pek çok b (gerekli değildir olduğu için, kaslarınklinik amaçlar için gerçekleştirilen iopsies), kas-geriliminin önceden harcanan çabalar genellikle yapılmaz, ve kas morfolojisi üzerinde temel etkisi kas sarkomerlerin düzgün olmayan bir aralıklarıdır.
Bu yazıda konjenital kas hastalıkları alanında testlerin performansı için SOP sağlamak için bir dizi ilk temsil eder ve rutin hücresel, moleküler, fonksiyonel, fizyolojik gerçekleştirmek doğuştan kas hastalığı alanında 20 yılı uzmanların çabalarını temsil eder ve patolojik araştırma. Yayınlanan SOP'ların bir dizi önümüzdeki yıl hazır olacak ve her biri için gerekli protokoller ve uygun yayın formatları bu SOP çabanın amacı sağlamaktır Washington DC 2013 yılının Nisan ayında düzenlenen bir Konjenital Kası Hastalıkları Konsorsiyumu Çalıştayı ele alındı 1) m olarak alanında kullanılan uygulamaları ve uç noktaları standardize doğuştan kas hastalığı alanında gerekli test ve numunelerin analizi için bir yol haritasımümkün gibi uch 2) bizim alanda yeni araştırmacılar için standart uygulamaları eğitimi sağlamak. Biz bu kaynaklar bizim altında çalışılan alana yeni araştırmacıların girişini kolaylaştırmak ve böylece yapılabilir araştırmanın kapsamını artıracak inanıyoruz. Ayrıca, uygulamaların bir standardizasyon çalışmalar arasında verileri karşılaştırmak ve klinik öncesi ve klinik denemeler planlarken ve gerçekleştirirken, son noktaları tanımlamak için son derece yararlı olacaktır.
Bu makalenin ana odak çalışmaları çeşitli için uygun donma ve doku hazırlanması ile ilgili iken, bizim işbirlikçi grup da kas örneklerinin patolojik inceleme için yararlı bitiş noktaları tartışıldı. Şu anda, orada patolojik analizi yaparken almaya yaklaşımı hiçbir resmi uzlaşma olduğunu ve farklı çalışmalar çeşitli ilgili her hastalık için önceki yayınlarda yeni bulgular ilişki yapılmaktadır. Böylece, biz yararlı olacağını düşündümkas patoloji karakterizasyonu patolojik uç noktalarının planlanması için bazı genel kurallar öneriyoruz. Önceki bir çalışmada, patoloji miktarının için, önemli bir düşünce) 1'e fiber boyutu ölçüm yöntemi konulmalıdır, 2) lif türüne özgü anormalliklerin ya da tedavi etkilerinin olasılığı, 3) anormallikleri veya etkilerinin olasılığı sınırlıdır ki Bireysel kaslara ve 4) çalışma altındaki hastalık için karakteristik olan patolojik bulgular miktarının belirlenmesi için bir stratejidir. Fiber boy en çalışmaları için gerekli bir uç nokta olduğunu, ve ne yazık ki sayısal nasıl geniş bir varyasyon vardır. Birçok çalışma, özel görüntüleme yazılımı tarafından sağlanan otomatik ölçümü yöntemleri kullanarak bu sonuçları rapor, ancak bu programların çok bu otomatik ölçümler hatalı hale getirebilir (örneğin lifler daire veya elips olduğunu varsayarak gibi) kısayolları alın. Bu otomatik programlar kendi ölçümleri b yapmak nasıl anlamak için gerekliefore ölçümlerde güven sahip ve biz kağıt yöntemleri bu bilgileri içerecek şekilde araştırmacıları teşvik ediyoruz. Ayrıca, fiber boyutu belirtmek için kullanılan özel ölçüm son derece değişkendir, ve bazı ölçümler diğerleri 10,11 tercih edilir. Fiber ebadı genel olarak kullanılan bir ölçüm fizyolojik çalışmalar yapmak araştırmacılar aletleri kullanılarak elde CSA ölçümlerine sonuçları standart oldukları için, bir elyaf kesit alanı (CSA) 'dir. CSA ölçümler doğru mükemmel enine kesitlerinde fiber boyutunu yansıtmak iken, ne yazık ki, onlar (boyuna veya eğimli-kesitli lifler yapay yüksek CSA ölçümler olacak ölçüde) lif yönelim yoğun bağımlı olan ve fiber boyutu dolayısıyla ideal değildir ölçümlerdir. Lif kesit alanının daha az bağımlıdır fiber ebadı tercih edilen bir ölçüm th ölçümüdür minimum Feret çapı (MinFeret çap), olduğukas hücresi 12 e küçük çapı. Bu ölçüm lif yönelim sadece biraz bağlıdır ve genellikle lif ölçümü için klinik altın standart olduğunu ve araştırmacılar bu tekniğin kullanılması doğru hareket için teşvik edilir. Bu ölçümler genellikle CSA ölçümleri 13 üretir aynı yazılımı kullanılarak yapılacaktır ve ayrıca elle ölçmek için basit olabilir. Lif tipi, belirli kas, ve belirli bir hastalığa bağlı patolojik bulgular bağlamında göre patolojik verileri değerlendirerek göre, bu sadece bir çalışma, planlama aşamasında dikkate alınmalıdır az tartışmalı konulardır. Fiber tipi immünohistokimyasal veya ATPaz boyama kullanılarak değerlendirilebilir, ama belli kasları ve hayvan türlerinin bu fiber tiplerinin özel karışımlar (böylece farklı beklentileri gerektiren ve stratejileri test) olduğunu dikkate almak yararlı olur. Kas spesifik patolojik tutulum veya tedavi etkinliğiortaya çıkar ve toplam kas ağırlığı kontrol grubu ile karşılaştırıldığında patolojik değerlendirmek için kas karar vermeden önce hastalığın heterojenlik derecesini belirlemek için kullanılabilir olabilir. Son olarak, bu da birçok kas hastalıkları (örneğin, nemaline miyopati nemaline çubuklar gibi) belirli bir patolojik anormallikler 14,15 ile ilişkili olduğu bilinmektedir ve bu yüzden, bu anormallikler, bir elyaf tipi ya da kas bulunan olmadığını dikkate almak da yararlıdır özgü dağılım analizi 16,17 gerçekleştirilmesi. Biz kas değerlendirilmesi için standartların esnek olmayan bir dizi teklif yok ederken Genel olarak, biz bu konuları önceden herhangi bir iskelet kası hastalığı patolojik çalışmaların performansının kabul edilmesi gerektiğine inanıyorum.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For tissue freezing | |||
| Liquid nitrogen dewar with a liquid withdrawal device | Custom Biogenic Systems | Lab-5 Series | Any other liquid nitrogen dewar could substitute. |
| Cold-conductive container | Fisher | 02-583A | |
| Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen | Nalgene | 4150-2000 | |
| Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer | Thomas Scientific | 1228Y01 | Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing. |
| For single fiber functional testing | |||
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11 | |
| Sylgard coating | Ellsworth Adhesives | 3-6636 | |
| Dissection stereomicroscope | Harvard Apparatus | 693101 | Any other dissection microscope could substitute. |
| For cell culture | |||
| Sterile laminar flow hood | Thermo Scientific | 51022485 | Any other cell culture hood could substitute. |
| For tissue freezing | |||
| Plastic bags/containers | Nasco | B01009WA | |
| Thermal safety gloves | Denville | G4162 | |
| Face shield | Fisher Scientific | S47640 | |
| Long forceps | Fisher Scientific | 12-460-807 | |
| Marker | Staples | 125328 | |
| For cell culture | |||
| Sterile 50 ml conical tubes | Denville | C1060-P | |
| PES filter unit, 500 ml, 0.22 µm | Denville | F5227 | |
| Sterile forceps | Fisher Scientific | 644320 | |
| Ice packs | Fisher Scientific | NC9909223 | |
| Insulated styrofoam box | Polar Tech | 207F | |
| Packing tape | Staples | 795570 | |
| Tissue freezing | |||
| Liquid nitrogen | Airgas | NI NF160LT350 | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma | M32631-4L | Store Isopentane in a flammable materials cabinet. |
| EM fixative (choose one) | The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM. | ||
| 2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 16537-15 | |
| Karnovsky's fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer) | Electron Microscopy Sciences | 15732-10 | |
| For functional studies (if desired) | |||
| Relaxing solution, containing (in mmol/L) | |||
| 40 BES | Sigma | B9879 | |
| 10 EGTA | Sigma | E4378 | |
| 6.56 MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| 5.88 Na-ATP | Sigma | A3377 | |
| 1.0 DTT | RPI | D11000 | |
| 46.35 K-propionate | Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1 | ||
| 15 creatine phosphate, pH 7.0 | Sigma | P7936 | |
| 0.4 leupeptin | Calbiochem | 10895 | |
| 0.1 PMSF | Sigma | P7676 | |
| Skinning solution, containing | |||
| Relaxing solution (See Above) | |||
| 0.5% Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Indicating silica granules | |||
| Flat pieces of cork (1 x 1 inch) | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| For cell culture (if desired) | |||
| Complete Growth Medium, containing (for 500 ml) | Sterilize by filtering the solution through a 500 ml 0.22 µm PES filter unit. Store at 4°C and use within 1 month. | ||
| 395 ml of high glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D5671 | |
| 100 ml of fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F6178 | |
| 5 ml of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG) | Sigma | G1146 | |
| See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications |
References
- Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. 15, Elsevier. 407-442 (2007).
- Lawlor, M. W., et al. Enzyme replacement therapy rescues weakness and improves muscle pathology in mice with X-linked myotubular myopathy. Hum Mol Genet. 22, 1525-1538 (2013).
- Talmadge, R. J., Roy, R. R. Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms. J Appl Physiol. 75, 2337-2340 (1993).
- Blau, H. M., et al. Differentiation properties of pure populations of human dystrophic muscle cells. Exp Cell Res. 144, 495-503 (1983).
- Lawlor, M. W., et al. Myotubularin-deficient myoblasts display increased apoptosis, delayed proliferation, and poor cell engraftment. Am J Pathol. 181, 961-968 (2012).
- Pavlath, G. K., Gussoni, E. Human myoblasts and muscle-derived SP cells. Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).
- Webster, C., Blau, H. M. Accelerated age-related decline in replicative life-span of Duchenne muscular dystrophy myoblasts: implications for cell and gene therapy. Somat Cell Mol Genet. 16, 557-565 (1990).
- Ottenheijm, C. A., et al. Thin filament length dysregulation contributes to muscle weakness in nemaline myopathy patients with nebulin deficiency. Hum Mol Genet. 18, 2359-2369 (2009).
- Witt, C. C., et al. Nebulin regulates thin filament length, contractility, and Z-disk structure in vivo. EMBO J. 25, 3843-3855 (2006).
- Garton, F., et al. Validation of an automated computational method for skeletal muscle fibre morphometry analysis. Neuromuscul Disord. 20, 540-547 (2010).
- Kim, Y. J., et al. Fully automated segmentation and morphometrical analysis of muscle fiber images. Cytometry A. 71, 8-15 (2007).
- Lawlor, M. W., et al. Inhibition of activin receptor type IIb increases strength and lifespan in myotubularin-deficient mice. Am J Pathol. 178, 784-793 (2011).
- Mula, J., et al. Automated image analysis of skeletal muscle fiber cross-sectional area. J Appl Physiol. 114, 148-155 (2013).
- Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. , Elsevier. 407-442 (2007).
- Nance, J. R., et al.
- Clarke, N. F., et al. Mutations in TPM3 are a common cause of congenital fiber type disproportion. Ann Neurol. 63, 329-337 (2008).
- Lawlor, M. W., et al. Mutations of tropomyosin 3 (TPM3) are common and associated with type 1 myofiber hypotrophy in congenital fiber type disproportion. Hum Mutat. 31, 176-183 (2010).
