Abstract
骨骼肌是因为它的结构和功能，这需要用于组织收集特定的协议来从功能性的，细胞，分子和病理评估获得最佳结果的唯一组织。由于见于先天性肌肉疾病以及潜在的供固定干预承认这些特征的一些病理异常的微妙，当评估骨骼肌先天性肌肉疾病冷冻肌肉病理评价，优选固定的肌肉。此外，为了产生严重的冰冻文物肌肉的潜在需要特定的预防措施，冻结骨骼肌冻结其他组织时并不常用组织学检查时。此手稿描述用液氮冷却以保持最佳的骨骼肌形态的协议为使用异戊烷（2 - 甲基丁烷）骨骼肌的快速冷冻。这个过程也有效于Freezing组织用于基因或蛋白表达的研究。此外，我们还整合了冷冻协议到一个更广泛的过程，还介绍了组织的短期分流首选方法（1）单根纤维的功能性研究及（2）成肌细胞培养，重点是收集必要的最低限度的努力组织并运输到专门的研究或参考实验室来完成这些研究。总体而言，这份手稿提供了如何新鲜组织可以有效地分布于各种表型研究的概况，从而为相关的先天性肌肉疾病的病理研究提供了标准操作规程（SOP）。
Protocol
标记被用于肌肉存储为相应的标识符对动物和肌肉收获的容器。预冷却袋/容器和工具，以防止组织冻结/解冻它被添加时。
1，研究设计注意事项肌肉组织收集
- 对于小动物肌肉疾病（鼠）模型，使用整个肌肉的研究，因为小动物模型往往需要一个完整的肌肉进行评估，以进行病理研究提供足够的肌纤维取样。对于大型动物（犬）模型的肌肉疾病，使用肌部是在其横向（横截面）的高宽至少0.3×0.3 cm以上。
注：核心活检也可以使用，但可能是次优由于采样问题的主要表征的研究。 - 对于涉及肌节的研究中，肌节长度的超微结构测量结果可包括临界端点，并且可以热曲愤怒专门处理。这是通常只在相关的疾病如肌节演出长度不合适的元素，如杆状体肌病的一些原因。一些实验室偏好来修复肌肉在其非收缩或伸展状态，而不是在非张紧或者非拉伸肌肉执行这些测量。
- 如果肌小节长度将无法测量，修复肌肉组织没有直接将它放到所需的EM固定液（见试剂）预拉伸肌肉。
- 如果肌节的长度将被测量，可以使用多种技术来预拉伸的肌肉（见讨论）：
- 使用一个夹紧装置，以保持肌肉在其静止张力而它仍然是在动物，切除肌肉围绕夹的外侧，并直接将其放置到所需的EM固定液（见试剂）。
- 伸展和脚的肌肉的表面（如一块软木）在类似于所观察到的长度
2，子划分隔离骨骼肌成片段是适合所需的研究（图1）
- 对于冰冻肌肉组织学：
- 包括尽可能多的给定的肌肉尽可能地减少抽样偏差（见步骤1.1），但标本应<1.5厘米避免冻结文物。
- 对待所有的肌肉从同一研究同样以防止纤维尺寸伪迹的差异是由于处理分歧。
- 用于电子显微镜（EM）：
- 切〜0.5×0.2×0.2cm的肌肉从样品条带，用平行于原始肌肉的纵向轴线的样品的纵向轴线。
注：固定剂将不能充分穿透较厚的组织片，因此保持试样的厚度为2mm或更小是在获得适当的结果是至关重要的。此外，如肌肉的这种小片段的定向是非常困难的，它最好是使用组织的模仿肌肉的实际取向（ 即，固定的试样的最长方面是肌肉/肌纤维的纵向方向），以一个片段最大限度地减少电磁处理过程中处理和混乱。
- 切〜0.5×0.2×0.2cm的肌肉从样品条带，用平行于原始肌肉的纵向轴线的样品的纵向轴线。
- 细胞培养：
- 所需的细胞产量可能影响肌肉的所需细胞培养建立的量。单一的肌肉（肌肉或部分）由小动物可提供足够的细胞数量，建立细胞培养，所以如果需要的话，从多个池中的肌肉组织。
3，组织固定和处理电子显微镜（EM）
- 放置肌肉不大于2毫米的最薄维度直接到期望的EM固定液更大（参见试剂）的片段。
- 将在新兴市场固定缓冲液的肌肉2-48小时fixati后（见试剂）上。长期固定（几个星期或几个月）会导致超微结构细节上的电磁研究的损失。
- 发送到EM核心设施进行处理。
4，肌凝的组织学，生物化学和分子生物学研究
- 通过彻底印迹检体用纸巾除去过多的水分在试样直至组织稍微粘附在毛巾。过多的水分会在肌肉产生显著冻结文物。
注：组织可以通过滚动它在婴儿爽身粉被进一步干燥。此步骤一般是不需要的肌肉，除非它们已经在过度潮湿的环境中。 - 放置十月（或类似的粘合剂，如西黄蓍胶）中的浅cryomold的底部或软木，只有足够十月以便为导向的肌肉（ 图2C）的基础。标签冻结前的软木或cryomold可能是标本跟踪有用。
- Caref来自ully放置肌入模具中所需的方向，与大多数肌肉从十月突出，使得剖开肌肉不与十月（ 图2C）相接触。
- 添加异戊烷到金属杯，直到达到约3-4厘米的深度。
- 戴上热防护手套，取出杜瓦的盖子。
- 放置或保持在金属杯与液氮接触，从而使液氮在杯的外侧上的电平高于异戊烷在杯子内部的水平。策略来安排这些容器，如图2所示。
- 不要让液氮进入金属杯，因为它产生的气泡的泡沫，可以用繁琐的工作（也是不够寒冷冻结）。
- 观察异戊烷，以确定何时已经达到适当的温度。在适当的温度（最佳的-140至-149℃），使冷冻异戊烷盖白色卵石将形成（几分钟后，并在最初的雾已经异戊烷以上消失）在杯子的底部，或在溶液中一般会变厚，以糖蜜的一致性。冻结之前，这个阶段将产生结冰atifacts。
- 如果异戊烷完全冻结坚实，解冻，并将其寒意后续使用前再次冻结温度。
- 用预冷的镊子，降低标本和软木/模具放入异戊烷约10-20秒。
- 将冷冻的样品到预先冷却的容器中。
- 保持试样和容器上的干冰在任何时候，直到转移到-80℃冰箱。
5，如果冷冻神器是目前在已经冷冻的组织，它可以提高冷冻神器的等级使用下面的“解冻和重新冻结”程序
- 取块出来的冷冻机， 其中一个在一个时间，并让他们在干冰。本协议的时间是至关重要的。只解冻和重新冻结一个块的时间。
- 移动样品从干冰至室温。
- 如果样品是嵌入在华侨城，用手术刀为彻底清除周围华侨城越好。
- 允许样品在室温下解冻到它是完全解冻的点，而不是在那里变干的地步。
- 轻轻地督促试样用钳子，以确保试样进展到下一个步骤之前完全解冻。
- 冻结肌肉如步骤4.1-4.10规定。
6制备肌肉的剥皮单纤维功能测试
- 对肌肉的存储过程取决于当肌肉/纤维被用于实验上。
- 对于在几个星期内使用时，将肌肉中的50％glycerol/50％放松溶液中的溶液（见试剂），并储存在-20℃。
- 使用尾部呃几个星期，将肌肉中的75％glycerol/25％放宽溶液的溶液（见试剂），并储存在-80°C。
- 或者，让肌肉干，脚软木，和存储在二氧化硅颗粒在-80°C。这些脱水肌肉可以使用多年。
7，准备新鲜的肌肉的细胞培养一批货物到实验室外
协议为建立细胞培养已在别处4-7良好描述。
- 填在50ml的无菌锥形管中，用无菌的完全生长培养基。
- 用无菌镊子，完全浸没在介质中的组织加肌肉组织的管。
- 填写与媒体管的剩余部分，以防止运输过程中的干燥。
- 加冰袋的保丽龙盒，然后将锥形管附近几个冰袋。
- 请注意，只有冰袋（而不是干冰）应使用以防止损坏从液体和组织的冰冻。
- 寄送包裹的O / N，但组织可以持续在这些条件下2天。
Representative Results
为了提供可见不当冻结文物的例子，几个鼠标股四头肌采用不同的技术（ 图3）复制的一般常见的错误冻结。 如图3A所示 ，适当的冷冻骨骼肌显示肌纤维的紧密并置到周围组织（通常是其它的肌纤维，但有时肌纤维之间的肌内膜空间填充有纤维变性或炎性细胞在多种疾病或损伤过程中）和一个清晰可见细胞质车厢。对于病理分析，以查看细胞内空间的能力往往比肌内膜车厢更为重要，因为它清楚地识别的退行性变化，再生变化，或其他特殊病征的发现（中央细胞核，细胞内的夹杂物）在此的存在通常是至关重要的空间。因此，冰晶在细胞内隔室的存在表示点在肌肉的病理学评估ajor问题。
适当冷冻肌肉组织的同时需要足够冷的温度和冷冻，以避免冰晶形成足够的速度。占这两个因素，即使，相当大的冷冻神器仍然可以发生，因为过多的水分内的肌肉组织。这个问题以前已经浸泡在盐水和干燥不足或当肌肉一直在直接接触与华侨城的安装媒体在切片（ 图3B，3E）的部位肌肉组织中最常遇到的。虽然与华侨城一些接触通常是不可避免的作为安装过程的结果，应尽一切努力避免将组织学评价和OCT用于安装区域之间的接触。与此相反，用-80℃的冰箱中（ 图3C）和液氮（ 图3D）冻结的样品提供示例s表示是次优的温度冻结或速度产生冻结神器。通过将组织在-80℃冰箱中遇到的慢速冷冻过程提供冷冻神器的一个极端的例子。当使用液态氮，其主要问题是，液态氮和组织之间的接触导致气态氮气鞘，以形成在所述组织液界面，而这种气体的界面是不足够冷，以产生快速冷冻肌肉1。这可以产生显著冷冻工件试样的表面附近，但是试样的内部区域更可能闪冻在适当的速率，并且可以完全幸免冷冻工件。而在液氮肌肉组织的简单的浸泡是隔靴搔痒的异戊烷冷冻过程一样有用，它可以为大肌肉标本的情况下，冻结，其中异戊烷是不可用的（如临床尸检标本的机构是有用的出临床肌肉病理实验室）。使用这种策略的结果通常是更好地利用组织的大部分时（> 2cm的几个维度）。
而避免冷冻工件提供了最佳的组织学结果，这种技术也得到了发展（和本文中所描述的），其基本上反转冻结的工件，以允许未正确冷冻组织的评估。组织被不正当地冻结（ 图3E）可以被融化并严格控制的条件下（ 图3F）下再冷冻，以允许水在纤维中的重新分布，形态和保存是可获得的程度可以是优秀的。根据我们的经验，这个过程会保留在组织的细胞内的形态，以显着的程度，但是它经常会产生纤维的肌内膜空间内的伪迹的分离。因为许多病理端点被发现在细胞内空间以及在在肌内膜空间，最好用特殊染色观察（或者突出纤维化或物色其他细胞类型），这些伪迹的变化是不可能真正削弱肌肉的病理评价。
图1。分流的组织为骨骼肌的结构，功能和细胞的研究。根据所希望的研究类型，收集骨骼肌组织可以以各种不同的方式获得最佳的结果进行处理。本文概述的协议描述了会审或处理骨骼肌标本进行异地的研究，以优化结果从专家的核心设施获得的方法。
图2。用于肌肉冷冻装置的实施例，由于在协议中所述，最佳肌肉冷冻需要在肌肉组织中的异戊烷是在其凝固温度的浸泡。获得冰冷异戊烷的一种安全和有效的方法包括使用一金属容器的被冷却的周围杜瓦含有液氮的异戊烷。因为它往往是方便的双手自由的，它可以使用一个括号，如环站（A）来保存异戊烷容器中的液氮，同时防止两种液体的混合物。或者，所述容器也可以在手动液氮（B）的保持。在任一情况下，该组织不应被放入异戊烷，直到异戊烷是明显地冻结在容器（通常为不透明的白色鹅卵石）的底部，然后应浸泡10-20秒，以允许完全冻结。 ISOPEntane在冷冻温度下产生最小的“雾”，（ 即 ，温度不够，如果相当多雾的话）。一旦组织被冻结，（直，然后进入冷却器或冷冻库），直接将其放入预先冷却的容器中，以防止意外的解冻冷冻后。 （三）适当安装冷冻肌肉应该有大部分的肌肉组织冷冻华侨城的一个碱基突出。
（ 一 ）适当的异戊烷冷冻肌肉图3。冻结的有效解冻/再冻结神器，和的例子。代表性的图像，（B）肌肉中异戊烷冻结适当的，但同时在与华侨城的安装介质接触，（C）肌肉冻结在-80℃下冷冻，和（D （B），华侨城的高液体含量产生显著冻结神器肌肉是与它接触，应采用华侨城需要安装所以只有少量，和肌肉的组织学评价应该是“站立出“，从它的表面。使用（C）-80°C冰箱或（D）液态氮（相对于在冰冷的异戊烷冻结的速度）冻结过程的缓慢会导致生产显著冻结神器。板E和F显示肌肉从即得（E）的初始次优的冷冻（由于与十月过度接触），然后（F）解冻，并使用本文描述的技术再冷冻同一标本。虽然人们可以观察到纤维之间的一些伪迹分离再冷冻样品中，改善我n中肌纤维细胞内的形态是显而易见的。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
Discussion
骨骼肌是一个结构和功能上独特的组织，并专门编写的程序是必要的，以允许的结构和功能参数的最佳评估。而各种组织中通常冻结在临床和研究上下文病理研究，对于非肌肉组织冷冻协议冷冻前通常涉及组织在OCT中的全浸没。如示于图3中 ，这样的协议不适合于骨骼肌的病理评价，但足以类似于这里所描述的协议，这是一个经常遇到的错误。本文的目标是提供一个简单的协议，用于肌肉的妥善处理，以避免这样的问题。建议也被编上肌肉异地生理和细胞研究的妥善处理，努力促进收购的高质量的数据在案件以外的核心实验室磨片重新现场研究是不可取的或可能的。
作为在该协议指出，这是在肌肉的正确处理绝对必不可少的病理研究内容包括最小化的组织中的水含量，从而降低在该肌肉被冻结的温度，并增加在该冷冻达到的速度。组织或冷冻过程（由温度不足或缺乏的冷冻剂和所述组织之间的直接接触，产生如遇到用液氮）的过度缓慢内过多的水分会导致冻结的工件，可以削弱病理分析。华侨城提供了组织液的额外来源，许多实验室使用其他粘合剂像西黄蓍胶作为嵌入基板。即使在被适当地执行冻结的情况下，应注意通过与RT容器或器具接触，以避免意外后解冻标本。因而，一个成功的冻结过程需要一定程度的规划，其中包括一个预冷所使用的所有仪器和容器。当遇到冷冻的工件，有这里描述的是足以满足大多数病理学评估的组织的恢复方法。然而，这种冷冻/解冻循环不提供完美的组织学和有损害的组织（除了需要重新冻结的组织中的时间）的其它分子或酶研究的电位，因此，使用适当的初始冷冻做法是大大优选。在冷冻工件被预先冷冻的组织中遇到的情况下，然而，这里描述的技术可以是非常有用的。
固定组织的EM可以提供，此前组织收集需要规划具体的技术挑战和处理。采集标本的EM时最常见的错误包括使用组织碎片太厚的glutaraldehyd的e来渗透。戊二醛只从一个给定的表面，护理穿透约0.1厘米进入肌肉组织，应采取措施，确保了EM的样本中的一维是厚度不超过0.2厘米。此外，由于EM是直接评估收缩装置的极好手段，一些研究者已经开发战略，以预拉伸或预拉伸前的肌肉固定，使收缩元素的测量在生理相关的张力。没有标准协议，用于预张紧，但两种策略在本协议简要介绍。应当指出，试图预张紧的肌肉会产生不可预测的结果，除非它们被做在一个非常特定的方式，并且它可能是优选的修复肌肉松驰状态，以防止在肌小节长度伪迹的变化通过一个非标准预张紧步骤8,9。对于肌肉在这种特定的测量是没有必要的（包括第二个白用于临床目的进行iopsies），努力以预张力的肌肉一般不进行，并且对肌肉形态的主要效果是肌节的肌非均匀间距。
本文代表了第一个系列提供标准操作程序进行测试的先天性肌肉疾病领域的表现，它代表了20位专家在执行例行的细胞，分子，功能性，生理性的先天性肌肉疾病领域的努力，病理研究。发表的SOP的范围内将提供在未来的一年，并为每个必要的协议和相应的出版形式，这在先天性肌肉疾病协会研讨会于2013年四月在华盛顿举行讨论这个SOP努力的目标是提供路线图进行必要的测试和样本分析中的先天性肌肉疾病领域1）标准化在我们的领域作为米的做法和终点UCH越好，2）提供指导标准的做法，新的研究人员在我们的领域。我们相信，这些资源将促进新的调查进入我们的下深入研究的领域，从而提高了可进行的研究范围之内。此外，实践标准化将是比较不同的研究数据，并在规划和实施临床前和临床试验时，识别端点极有帮助。
而本文的重点是关系到适当的冻结和准备组织的各种研究，我们的合作小组还讨论了有用的端点的肌肉标本的病理分析。目前，正在执行的病理分析时采用的方法没有官方的共识，以及各种不同的研究分析，以与新的发现之前的出版物为每个相应的疾病。因此，我们认为这将是有益的建议在肌肉病理特征病理端点的规划一些一般性的准则。前量化的一项研究的病理学，相当大的思想应放入1）纤维尺寸测量的方法，2）的纤维类型特定异常或治疗效果的可能性，3）异常或影响的可能性被限制个别的肌肉，和4）的策略用于定量病理结果是特征的疾病正在研究中。纤维的大小是一个必要的端点大多数研究，遗憾的是在它是如何量化广泛的变化。许多研究利用专有的图像处理软件提供的自动定量方法报告这些结果，但许多这些项目的拍摄快捷键（如假设纤维是圆形或椭圆形），可以使这些自动测量不准确。有必要了解这些自动化的程序是如何让他们的测量结果b安伏有信心的测量，我们鼓励研究者，包括纸张的方法这些细节。此外，用于表示纤维大小的特定的测量是非常可变的，有些测量是优选他人10,11。纤维的大小的常用测量纤维横截面面积（CSA），尤其是因为进行生理学研究调查其结果标准化，以使用其工具获得CSA测量。不幸的是，虽然CSA测量可以准确地反映纤维尺寸完美横截面，它们广泛地依赖于纤维方向（的范围内，纵向或斜向剖面的纤维将有虚高CSA测量）和对纤维的大小从而不理想的测量。纤维尺寸的优选测量其较少依赖于纤维的截面积为最小的Feret直径（MinFeret直径），这是个测量e小调直径在肌肉细胞12。这种测量方法是仅稍微依赖于纤维的取向和一般临床黄金标准纤维的测量，调查被鼓励移向使用这种技术。这些测量通常可以使用其生成CSA测量值13中的相同的软件制造，并且也简单的手动测量。对于根据光纤类型，特定的肌肉，并在涉及到具体的疾病病理结果的情况下评估的病理资料，这些都是应该只是一个研究的规划过程中考虑较少争议的问题。纤维类型可以用免疫组织化学或ATP酶染色法进行评价，但要考虑到特定的肌肉和动物物种具有这些纤维类型的特定混合物（因而需要不同的期望和测试策略）是有用的。肌肉特异性病理介入或治疗功效可以发生，并且总肌重量与对照相比，可以用来决定肌肉病理评估之前，以确定疾病的异质性程度。最后，这是众所周知的，许多肌肉 疾病都与特定的病理异常（如在杆状体肌病杆状体杆）14,15相关联，因此它也是有用的，考虑这些异常是否被发现在纤维型或肌在进行分析时，16,17的具体分布。总体而言，虽然我们不建议一个不灵活的一套肌肉的评价标准，但我们相信这些问题之前，应在任何骨骼肌肉疾病的病理研究的性能考虑。
Disclosures
作者什么都没有透露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For tissue freezing | |||
| Liquid nitrogen dewar with a liquid withdrawal device | Custom Biogenic Systems | Lab-5 Series | Any other liquid nitrogen dewar could substitute. |
| Cold-conductive container | Fisher | 02-583A | |
| Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen | Nalgene | 4150-2000 | |
| Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer | Thomas Scientific | 1228Y01 | Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing. |
| For single fiber functional testing | |||
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11 | |
| Sylgard coating | Ellsworth Adhesives | 3-6636 | |
| Dissection stereomicroscope | Harvard Apparatus | 693101 | Any other dissection microscope could substitute. |
| For cell culture | |||
| Sterile laminar flow hood | Thermo Scientific | 51022485 | Any other cell culture hood could substitute. |
| For tissue freezing | |||
| Plastic bags/containers | Nasco | B01009WA | |
| Thermal safety gloves | Denville | G4162 | |
| Face shield | Fisher Scientific | S47640 | |
| Long forceps | Fisher Scientific | 12-460-807 | |
| Marker | Staples | 125328 | |
| For cell culture | |||
| Sterile 50 ml conical tubes | Denville | C1060-P | |
| PES filter unit, 500 ml, 0.22 µm | Denville | F5227 | |
| Sterile forceps | Fisher Scientific | 644320 | |
| Ice packs | Fisher Scientific | NC9909223 | |
| Insulated styrofoam box | Polar Tech | 207F | |
| Packing tape | Staples | 795570 | |
| Tissue freezing | |||
| Liquid nitrogen | Airgas | NI NF160LT350 | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma | M32631-4L | Store Isopentane in a flammable materials cabinet. |
| EM fixative (choose one) | The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM. | ||
| 2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 16537-15 | |
| Karnovsky's fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer) | Electron Microscopy Sciences | 15732-10 | |
| For functional studies (if desired) | |||
| Relaxing solution, containing (in mmol/L) | |||
| 40 BES | Sigma | B9879 | |
| 10 EGTA | Sigma | E4378 | |
| 6.56 MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| 5.88 Na-ATP | Sigma | A3377 | |
| 1.0 DTT | RPI | D11000 | |
| 46.35 K-propionate | Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1 | ||
| 15 creatine phosphate, pH 7.0 | Sigma | P7936 | |
| 0.4 leupeptin | Calbiochem | 10895 | |
| 0.1 PMSF | Sigma | P7676 | |
| Skinning solution, containing | |||
| Relaxing solution (See Above) | |||
| 0.5% Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Indicating silica granules | |||
| Flat pieces of cork (1 x 1 inch) | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| For cell culture (if desired) | |||
| Complete Growth Medium, containing (for 500 ml) | Sterilize by filtering the solution through a 500 ml 0.22 µm PES filter unit. Store at 4°C and use within 1 month. | ||
| 395 ml of high glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D5671 | |
| 100 ml of fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F6178 | |
| 5 ml of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG) | Sigma | G1146 | |
| See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications |
References
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