Abstract
Skeletmuskel er en unik væv på grund af dens struktur og funktion, som kræver særlige protokoller til væv samling for at opnå optimale resultater fra funktionelle, cellulære, molekylære og patologisk evalueringer. På grund af den subtile nogle patologiske abnormiteter set i medfødte muskelsygdomme og potentialet for fiksering til at blande sig med anerkendelsen af disse funktioner, patologisk vurdering af frosne muskler er at foretrække frem for faste muskler, når de evaluerer skeletmuskulatur for medfødt muskelsygdom. Derudover potentialet til at producere alvorlige fryse artefakter i musklen kræver særlige forholdsregler, når frysning skeletmuskulatur til histologisk undersøgelse, der ikke er almindeligt anvendt, når frysning andre væv. Dette håndskrift beskriver en protokol for hurtig nedfrysning af skeletmuskulaturen ved hjælp isopentan (2-methylbutan) køles med flydende nitrogen for at bevare optimal skeletmuskulatur morfologi. Denne procedure er også effektiv til freezing væv beregnet til genetiske eller protein ekspressionsundersøgelser. Desuden har vi integreret vores nedfrysning i en bredere procedure, der også beskriver foretrukne fremgangsmåder til på kort sigt triage væv for (1) enkelt fiber funktionelle undersøgelser og (2) myoblast cellekultur med fokus på minimal indsats nødvendigt at indsamle væv og transportere det til specialiserede forsknings-eller reference-laboratorier til at gennemføre disse undersøgelser. Samlet set dette manuskript giver en oversigt over, hvordan frisk væv effektivt kan distribueres til en række fænotypiske studier og giver dermed standardprocedurer (SOP) for patologiske undersøgelser i forbindelse med medfødt muskelsygdom.
Protocol
Mærk de beholdere, der skal anvendes til muskel opbevaring med hensigtsmæssige identifikatorer for dyret og muskel høstet. Pre-afkøle poser / beholdere og instrumenter til at forhindre frysning / optøning af vævet, når det tilsættes.
1.. Undersøgelse design Overvejelser for muskelvæv Collection
- For små dyr (murine) modeller af muskelsygdom, bruge en hel muskel til studiet, da små dyremodeller kræver ofte en vurdering af en hel muskel til at give tilstrækkelig myofiber prøveudtagning til patologiske undersøgelser. For store dyr (hunde) modeller af muskelsygdom, bruger muskel portioner, der er mindst 0,3 x 0,3 cm eller større i deres tværgående (tværsnit) aspekt.
BEMÆRK: Core biopsier kan også anvendes, men kan være suboptimal for primære karakterisering undersøgelser på grund af prøveudtagning spørgsmål. - For undersøgelser, der involverer sarkomeret kan ultrastrukturelle måling af sarkomer længde indeholde en kritisk endpoint og kan require specialiseret håndtering. Dette er normalt kun relevant i sygdomme, hvor elementer af sarkomeret viser upassende længder, som i nogle årsager til nemaline myopati. Nogle laboratorier foretrækker at løse muskel i sin ikke i underentreprise eller strakt tilstand, snarere end at udføre disse målinger på ikke-spændt eller ikke-strakt muskel.
- Hvis det ikke vil blive målt sarkomeret længde, fastsætte muskelvæv uden forudgående strækker musklen ved at placere det direkte i den ønskede EM fiksativ (se Reagenser).
- Hvis vil blive målt sarkomeret længder, kan flere teknikker til at pre-strække musklen (se Diskussion) anvendes:
- Brug en spændeanordning til at holde muskler på sin hvilespænding mens det stadig er i dyret, udskære musklen omkring ydersiden af klemmen, og placere det direkte i den ønskede EM fiksativ (se Reagenser).
- Stræk og pin musklen til en overflade (såsom et stykke af kork) i en længde svarende til den observeret
2.. Sub-opdele Isoleret Skeletmuskel i fragmenter, der er passende til den Studier (figur 1)
- For frosset muskel histologi:
- Medtag så meget af en given muskel som muligt for at minimere prøveudtagning bias (se trin 1.1), men prøver skal være <1,5 cm for at undgå frysning artefakter.
- Behandl alle muskler fra samme forsøg på samme måde for at forhindre kunstig forskelle i fiber størrelse som følge af forskelle i håndtering.
- Til elektronmikroskopi (EM):
- Skær en ~ 0,5 x 0,2 x 0,2 cm strimmel af muskel fra prøven med den langsgående akse af prøven parallelt med den langsgående akse af den oprindelige muskel.
BEMÆRK: fiksativ vil ikke i tilstrækkelig grad gennemtrænge tykkere stykker af væv, så opretholde modellen tykkelse på 2 mm eller mindre er afgørende for at opnå passende resultater. Derudoversom orientering af disse små fragmenter af musklen er ofte vanskeligt, er det tilrådeligt at bruge et fragment af væv, der efterligner den faktiske retning af musklen (dvs. den længste del af de faste model er den langsgående orientering af muskel / myofibre) til minimere håndtering og forvirring under EM forarbejdning.
- Skær en ~ 0,5 x 0,2 x 0,2 cm strimmel af muskel fra prøven med den langsgående akse af prøven parallelt med den langsgående akse af den oprindelige muskel.
- For cellekultur:
- Den ønskede celleudbytte kan påvirke mængden af muskel kræves til cellekultur etablering. Enlige muskler (eller dele af muskler) fra små dyr kan give utilstrækkelige celletal at etablere cellekulturer, så hvis det er nødvendigt, pool væv fra flere muskler.
3.. Vævsfiksering and Processing for Electron Microscopy (EM)
- Placer et fragment af muskel ikke er større end 2 mm i sit tyndeste dimension direkte til den ønskede EM fiksativ (se Reagenser).
- Placer muskel i EM fiksativ buffer (se Reagenser) efter 2-48 hr af fixatipå. Langvarig fiksering (uger eller måneder), kan resultere i tab af ultrastrukturelle detaljer på EM-studier.
- Send til en EM core facilitet til forarbejdning.
4.. Muscle frysning for Histologisk, Biokemisk og Molekylær Studies
- Fjern overdreven fugt i prøven ved grundigt at duppe prøven med et stykke køkkenrulle, indtil vævet er lidt klæbende til håndklæde. Overdreven fugt vil producere betydelige frysning artefakter i musklen.
BEMÆRK: Væv kan tørres yderligere ved at rulle den i baby pulver. Dette trin er generelt ikke nødvendigt for musklerne, medmindre de har været i en alt for fugtigt miljø. - Placer oktober (eller et lignende lim, såsom tragantgummi) i bunden af en lavvandet kryoformen eller på kork, med kun nok OLT danne grundlag for den orienterede musklen (figur 2C). Mærkning af kork eller kryoformen før frysning kan være nyttige for modellen sporing.
- Carefully placere musklen i formen i den ønskede orientering, med et flertal af musklen rager frem fra oktober så sektioneret muskel ikke er i kontakt med oktober (figur 2C).
- Tilføj isopentan til et metal kop, indtil den når en dybde på ca 3-4 cm.
- Sæt på termiske beskyttelseshandsker og fjerne låget på Dewar.
- Placer eller hold metalkop i kontakt med flydende nitrogen, således at niveauet af flydende nitrogen på ydersiden af bægeret er over niveauet af isopentan på indersiden af bægeret. Strategier for at arrangere disse beholdere er vist i figur 2.
- Lad ikke flydende nitrogen for at komme ind i metal cup, da det producerer en boblende skum, der kan være besværlige at arbejde med (og er heller ikke tilstrækkeligt kold frost).
- Observere isopentan at bestemme, når det har nået en passende temperatur. Ved den passende temperatur (optimalt mellem -140 til -149 ° C), sålåg hvide småsten frosset isopentan vil danne (efter et par minutter, og efter den oprindelige tåge er forsvundet over isopentan) i bunden af koppen eller opløsningen vil generelt tykkere til konsistensen af melasse. Frysning forud for denne fase vil give frysning atifacts.
- Hvis isopentan helt fryser fast, optø og chill det til frostgrader igen før efterfølgende brug.
- Brug pre-kølet pincet, sænkes prøven og kork / skimmel i isopentanet ca 10-20 sek.
- Placer frosne prøve i en forud afkølet beholder.
- Hold prøve og container på tøris på alle tidspunkter indtil overførsel til en -80 ° C fryser.
5.. Hvis Nedfrysning Artifact er til stede i Allerede Frozen Tissue, det er muligt at forbedre graden af indefrysning Artifact hjælp af følgende "Thaw og genfryses" Procedure
- Tag blokke ud af fryseren, en ad gangen, Og holde dem på tøris. Timingen af denne protokol er kritisk. Kun tø og genfryses én blok ad gangen.
- Flyt prøve fra tøris til RT.
- Hvis prøven er indlejret i OLT fjerne den omgivende OLT fuldstændigt som muligt ved hjælp af en skalpel.
- Lad prøven tø op ved stuetemperatur til det punkt, hvor den er helt optøet, men ikke til det punkt, hvor det tørrer ud.
- Forsigtigt prod prøven med en pincet for at sikre, at prøven er helt optøs før går videre til næste trin.
- Frys musklen som angivet i trin 4,1-4,10.
6.. Forberedelse af muskel til Skinned Single Fiber Funktionel Test
- Proceduren for muskel opbevaring afhænger når musklen / fiber bliver brugt til forsøg.
- Til brug inden for et par uger, skal du placere musklen i en opløsning af 50% afslappende løsning glycerol/50% (se Reagenser) og opbevares ved -20 ° C.
- Til brug agtersteis et par uger, skal du placere musklen i en opløsning af 75% afslappende løsning glycerol/25% (se Reagenser) og opbevares ved -80 ° C.
- Alternativt, lad muskel tørre, pin til kork, og gemme på silica granulat ved -80 ° C. Disse dehydrerede muskler kan anvendes til år.
7.. Udarbejdelse af frisk muskel til forsendelse Cell Culture til eksterne laboratorier
Protokoller til etablering af cellekulturer er blevet godt beskrevet andetsteds 4-7.
- Fyld en 50 ml sterilt konisk rør med steril komplet vækstmedium.
- Tilsæt muskelvæv til røret ved hjælp af en steril pincet, fuldstændig nedsænkning af vævet i mediet.
- Fyld den resterende del af røret med medierne for at forhindre udtørring under forsendelsen.
- Tilføj isposer til Styrofoam kassen, og placer den koniske rør nær flere isposer.
- Bemærk, at der kun skal bruges isposer (og ikke tør is)at forhindre skader fra frysning af væsken og væv.
- Ship pakker O / N, men væv kan sidste 2 dage under disse betingelser.
Representative Results
For at give eksempler på de artefakter, der ses med forkert frysning, blev adskillige muse quadriceps musklerne nedfrosset ved hjælp af forskellige teknikker (figur 3) til at replikere hyppigst forekommende fejl. Som vist i figur 3A, passende frosset skeletmuskel viser en stram anbringelsen af myofibre til det omgivende væv (som regel andre muskelfibre, men undertiden endomysial rummet mellem myofibre er fyldt med fibrose eller inflammatoriske celler i en række af sygdom eller skade processer), en tydeligt synlig cytoplasmatisk rum. For patologisk analyse, evnen til at se den intracellulære rum er ofte vigtigere end den endomysial rum, som det er normalt kritisk til klart at identificere tilstedeværelsen af degenerative forandringer, regenerative forandringer eller andre patognomoniske fund (centrale kerner, intracellulære inklusioner) i dette plads. Tilstedeværelsen af iskrystaller i det intracellulære rum repræsenterer amajor problem i patologisk vurdering af muskler.
Korrekt nedfrysning af muskelvæv kræver både tilstrækkelig kolde temperaturer og en tilstrækkelig hastighed for frost for at undgå dannelsen af iskrystaller. Selv når der tegner sig for de to faktorer, kan en betydelig frysning artefakt stadig opstå på grund af overdreven fugt i muskelvæv. Dette problem er mest almindeligt stødt på i muskelvæv, der tidligere havde været nedsænket i saltvand og tørret tilstrækkeligt, eller når muskler har været i direkte kontakt med oktober montering medier på stedet for sektionering (figur 3B, 3E). Mens nogle kontakt med oktober er normalt uundgåelig som følge af monteringen, bør der gøres alt for at undgå kontakt mellem områder, som vil blive histologisk evalueret og OLT bruges til montering. I modsætning hertil prøver frosset under anvendelse af en -80 ° C fryser (figur 3C) og flydende nitrogen (figur 3D) give eksempels for frysning artefakt, der er produceret af suboptimal temperatur eller hastighed for frost. Den langsomme nedfrysningsproces stødt ved at placere væv i en -80 ° C fryser giver et ekstremt eksempel på frysning artefakt. Ved anvendelse af flydende nitrogen, er det vigtigste problem, at kontakt mellem flydende nitrogen, og vævet forårsager en kappe af gasformigt nitrogen til dannelse på vævs-væske-grænsefladen, og dette gasformige grænseflade er ikke tilstrækkelig lav til at producere en hurtig muskel frysning 1. Dette kan give betydelige frysning artefakt nær overfladen af prøven, men interne områder af prøven er mere tilbøjelige til flash-freeze med en passende hastighed, og kan være helt forskånet for frysning artefakt. Mens den simple nedsænkning af muskelvæv i flydende nitrogen er ikke nær så anvendelig som isopentan-frysning proces, kan det være nyttigt for indefrysning af store muskelgrupper prøver i situationer, hvor isopentan er tilgængelig (f.eks kliniske autopsiprøver på institutioner medud kliniske muskel patologilaboratorier). Resultater ved hjælp af denne strategi er generelt bedre, når du bruger store dele af væv (> 2 cm i flere dimensioner).
Mens undgåelse af indefrysningen artefakt giver optimale histologiske resultater, har en teknik også blevet udviklet (og beskrevet heri), som i væsentlig grad vender frysning artefakter til at muliggøre en vurdering af forkert frosset væv. Væv, der uretmæssigt frosset (3E) kan optøet og frosset igen under strengt kontrollerede forhold (Figur 3F) for at tillade en omfordeling af vandet inden fibrene, og graden af morfologiske bevarelse, der er opnåelige kan være fremragende. Det er vores erfaring, denne proces bevarer den intracellulære morfologi af vævet til en bemærkelsesværdig grad, men det giver ofte en kunstig adskillelse af fibrene i det endomysial rum. Da mange patologiske slutpunkter findes i det intracellulære rum, og de iden endomysial rum ses bedst ved hjælp af specielle pletter (enten for at fremhæve fibrose eller til at identificere andre celletyper), er det usandsynligt, at virkelig forringe patologisk vurdering af muskel disse kunstig ændringer.
Figur 1.. Visitation væv for strukturelle, funktionelle og cellulære studier af skeletmuskulaturen. Afhængigt af de typer af undersøgelser ønskes, kan opsamles skeletmuskulatur væv blive behandlet i en række forskellige måder for at opnå optimale resultater. De protokoller, der er skitseret i dette dokument beskriver metoder til triaging eller forarbejdning skeletmuskelrelaksantia prøver for off-site undersøgelser for at optimere de resultater, der kan opnås fra ekspert core-faciliteter.
Figur 2.. Eksempler på apparater, der anvendes til muskel frysning. Som beskrevet i protokollen, optimal muskel frysning kræver nedsænkning af muskelvæv i isopentan der er på sit frysepunktet. En sikker og effektiv metode til opnåelse af iskold isopentan indebærer brug af en metalbeholder til isopentan, der er afkølet i et omgivende Dewar indeholder flydende nitrogen. Da det ofte er praktisk at have begge hænder fri, er det muligt at anvende en bandage såsom en ring stativ (A) til at holde isopentan beholder i flydende nitrogen og samtidig forhindre blanding af de to væsker. Alternativt kan beholderen også blive afholdt i den flydende nitrogen manuelt (B). I begge tilfælde bør det væv, ikke anbringes i isopentan indtil isopentan synligt frysning ved bunden af beholderen (sædvanligvis uigennemsigtige hvide småsten) og derefter skal nedsænkes til 10-20 sek for at tillade fuldstændig frysning. Isopentane ved frysepunktet producerer en minimal "tåge" (dvs. temperaturen er utilstrækkelig, hvis betydelig tåge er til stede). Når vævet er frosset, placere den direkte i pre-afkølede containere (og derefter direkte ind i en køler eller fryser) for at forhindre utilsigtet optøning efter frysning. (C) Tilstrækkeligt monteret frosset muskel skal have hovedparten af muskelvæv rager ud fra en base af frosset oktober
Fig. 3. Eksempler på frysning artefakter og effektiv optøning / genfrysning. Repræsentative billeder af (A) passende isopentan frosset muskel, (B) muskel fryses hensigtsmæssigt i isopentan, men mens i kontakt med oktober monterings medium (C) muskel fryses i en -80 ° C fryser, og (D (B), det høje væskeindhold OLT producerer betydelig frysning artefakt i muskel, der er i kontakt med den, bør så kun den minimale mængde af OLT kræves til montage skal bruges, og musklen til histologisk evaluering bør være "stående ud "fra dens overflade. Langsommelighed indefrysning proces med en (C) -80 ° C fryseren eller (D) flydende nitrogen (i forhold til hastigheden af frost i iskold isopentan), kan føre til produktion af betydelig frysning artefakt. Paneler E og F viser muskler fra samme prøve, der var (E), som oprindeligt suboptimalt frosne (på grund af overdreven kontakt med OLT), og derefter (F) optøet og genfrosne hjælp af teknikken beskrevet heri. Mens man kan observere nogle kunstig adskillelse mellem fibrene i genfrosset prøve, forbedring in den intracellulære morfologi af muskelfibre er umiddelbart indlysende. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Skeletmuskel er et strukturelt og funktionelt enestående væv, og specialiserede forberedelse procedurer er nødvendige for at give den optimale vurdering af strukturelle og funktionelle parametre. Mens en række forskellige væv almindeligvis er frosset til patologiske undersøgelser i kliniske og forskningsmæssige sammenhænge, indefrysning protokoller for ikke-muskelvæv normalt indebærer total fordybelse af vævet i OCT inden frysning. Som vist i figur 3, en sådan protokol er uegnet til patologisk evaluering af skeletmuskulatur og alligevel er tilstrækkeligt ens til protokollen beskrevet her, at dette er en almindeligt forekommende fejl. Målet med dette oplæg er at give en enkel protokol for korrekt håndtering af muskel for at undgå spørgsmål som dette. Rådgivning er også blevet udarbejdet på korrekt håndtering af muskel for off-site fysiologiske og cellulære studier i et forsøg på at lette erhvervelsen af data af høj kvalitet af eksterne centrale laboratorier, where undersøgelser på stedet ikke er at foretrække eller mulig.
Som nævnt i denne protokol, elementer, der er helt afgørende i den korrekte behandling af muskel til patologiske undersøgelser omfatter minimere indholdet af vævet vand, faldende temperatur, hvor musklen er frosset, og øger den hastighed, hvormed frysning er opnået. Overdreven fugt i vævet eller overdreven langsommelighed fryseprocessen (produceret af utilstrækkelige temperaturer eller ved manglende direkte kontakt mellem frysning agent og væv, som er stødt på med flydende kvælstof), vil føre til indefrysning artefakter, der kan forringe patologisk analyse. Som oktober giver en ekstra kilde til væv fugt, mange laboratorier bruge andre klæbestoffer som tragacanthgummi som en indlejring substrat. Selv i tilfælde, hvor frost udføres korrekt, bør der udvises forsigtighed for at undgå efterfølgende uheld optøning prøver gennem kontakt med RT beholdere eller instrumenter.En vellykket frysning kræver en grad af planlægning, der omfatter en forud afkøling af alle instrumenter og beholdere, der skal anvendes. Ved indfrysning af artefakter er stødt på, er der en metode, der er beskrevet her til genopretning af det væv, der er tilstrækkelig for de fleste patologiske evalueringer. Men denne fryse / tø cyklus ikke tilbyde perfekt histologi og har potentiale til at forringe andre molekylære eller enzymatiske undersøgelser af væv (ud over den tid, der kræves til at re-fryse vævet), så ved hjælp af passende indledende indefrysning praksis er langt at foretrække . I tilfælde, hvor frysning artefakt stødt på præ-frosset væv, dog kan den teknik, der er beskrevet heri, kan være særdeles nyttig.
Fiksering og forarbejdning af væv til EM kan tilbyde specifikke tekniske udfordringer, der kræver planlægning forud for væv samling. Den mest almindelige fejl, når indsamling af prøver til EM indebærer brug af vævsfragmenter, der er for tyk til glutaraldehyde til at trænge igennem. Som glutaraldehyd kun trænger ca 0,1 cm i muskelvæv fra en given overflade, pleje bør tages for at sikre, at én dimension af EM-prøverne ikke er tykkere end 0,2 cm. Derudover, da EM er et glimrende middel til direkte at vurdere kontraktile apparat, har nogle forskere udviklet strategier til at pre-spænding eller pre-stretch musklen før fiksering for at tillade måling af kontraktile elementer på en fysiologisk relevant spænding. Der er ingen standard-protokol til forspænding, men to strategier er kort beskrevet i denne protokol. Det skal bemærkes, at forsøg på at forspænding musklen kan producere uforudsigelige resultater, medmindre de er gjort på en meget konkret måde, og det kan være at foretrække at fastsætte muskler i slap tilstand for at forhindre kunstig ændringer i sarkomer længde gennem en ikke-standard forspænding procedure 8,9. For muskler hvor sådanne konkrete målinger ikke er nødvendige (herunder de fleste biopsies udføres til kliniske formål), er generelt ikke gjort en indsats for at forspænding musklen, og den primære effekt på muskel morfologi er en uensartet afstand af sarcomeres i musklen.
Dette papir er den første i en serie for at give SOP for udførelsen af test i medfødt muskelsygdom felt, og det repræsenterer de bestræbelser over 20 eksperter i medfødt område muskel sygdom, der rutinemæssigt udføre cellulære, molekylære, funktionelle, fysiologiske og patologisk forskning. En række offentliggjorte SOP'er vil blive stillet til rådighed i det kommende år, og de nødvendige protokoller og passende offentliggørelse formater til hver blev drøftet på en medfødt muskelsygdom Consortium Workshop afholdt i april 2013 i Washington DC Målet med denne SOP indsats er at give en køreplan for den nødvendige afprøvning og analyse af prøver i det medfødt område muskelsygdom 1) at standardisere praksis og endpoints, der anvendes i vores område som mUCH som muligt, og 2) give instruktion om standard praksis for nye forskere inden for vores felt. Vi mener, at disse midler vil gøre det lettere for nye efterforskere i vores under-studerede felt og dermed forbedre omfanget af forskning, der kan udføres. Derudover vil en standardisering af praksis være yderst nyttigt at sammenligne data på tværs af studier og identificere endpoints når planlægning og udførelse af prækliniske og kliniske forsøg.
Mens det vigtigste fokus i denne artikel er relateret til den passende frysning og forberedelse af væv til en række undersøgelser, vores kollaborative gruppe drøftede også de nyttige endpoints for patologisk analyse af muskel prøver. På nuværende tidspunkt er der ingen officiel enighed om tilgang til at tage, når du udfører patologisk analyse, og en række forskellige undersøgelser er udført for at relatere nye resultater til tidligere publikationer for de enkelte sygdomme. Således har vi troet, at det ville være nyttigt atforeslå nogle generelle retningslinjer for planlægning af patologiske endepunkter i muskel patologi karakterisering. Forud for kvantificering af patologi i en undersøgelse, bør store tanke sættes i 1) målemetoden fiber størrelse, 2) muligheden for fiber-typespecifikke abnormiteter eller behandling virkninger, 3) muligheden for abnormiteter eller effekter, der er begrænset individuelle muskler, og 4) en strategi til kvantificering patologiske fund, der er karakteristisk for sygdommen under undersøgelsen. Fiber størrelse er en nødvendig endpoint for de fleste undersøgelser, og desværre er der en omfattende variation i, hvordan det er kvantificeret. Mange undersøgelser rapporterer disse resultater ved hjælp af automatiserede kvantificering fra proprietære imaging software, men mange af disse programmer tager genveje (såsom at antage, at fibrene er cirkler eller ellipser), der kan gøre disse automatiserede målinger unøjagtige. Det er nødvendigt at forstå, hvordan disse automatiske programmer gøre deres målinger bør have tillid til målingerne, og vi opfordrer efterforskere til at medtage disse oplysninger i papir metoder. Derudover specifik måling anvendes til at betegne fiberstørrelse er yderst variabel og visse målinger er at foretrække frem for andre 10,11. Et almindeligt anvendt måling af fiber størrelse er fiberen tværsnitsareal (CSA), især fordi efterforskerne udfører fysiologiske studier standardisere deres resultater til CSA målinger opnået ved hjælp af deres instrumenter. Desværre, mens CSA målinger præcist kan afspejle fiber størrelse i perfekt tværsnit, er de i vid udstrækning afhængige af fiber orientering (i det omfang, langsgående eller skråt-delt fibre vil have kunstigt høje CSA målinger), og er således ikke ideelle målinger for fiber størrelse. Et foretrukket måling af fiber størrelse, der er mindre afhængig af fiber tværsnitsareal er minimum Feret diameter (MinFeret diameter), som er målingen af the mindre diameter i musklen celle 12. Denne måling er kun lidt afhængig af fiberorientering og er generelt klinisk guldstandard til måling fibre og undersøgere opfordres til at bevæge sig mod anvendelse af denne teknik. Disse målinger kan ofte ske ved hjælp af den samme software, der genererer CSA målinger 13, og er også ligetil at måle manuelt. Med hensyn til vurderingen af de patologiske data i henhold til fibertype, specifik muskel, og i forbindelse med patologiske fund relateret til den specifikke sygdom, disse er mindre kontroversielle emner, der bare skal overvejes under planlægningen af en undersøgelse. Fiber type kan evalueres ved hjælp af immunhistokemisk eller ATPase farvning, men det er nyttigt at overveje at specifikke muskler og dyrearter har særlige blandinger af disse fibertyper (hvilket nødvendiggør forskellige forventninger og testningsstrategier). Muskel specifik patologisk involvering eller behandlingseffektkan forekomme, og den samlede muskel vægt i forhold til kontroller kan bruges til at identificere graden af heterogenitet af sygdom, før der træffes beslutning om musklerne til at patologisk evaluere. Endelig er det velkendt, at mange muskelsygdomme er associeret med specifikke patologiske abnormiteter (såsom nemaline stænger i nemaline myopati) 14,15, og så er det også nyttigt at overveje, om disse abnormiteter er fundet i en fiber-type eller muskel -specifik fordeling, når du udfører analysen 16,17. Samlet set mens vi ikke foreslå en ufleksibel sæt standarder for evaluering af muskler, tror vi, at disse spørgsmål bør overvejes forud for udførelsen af patologiske undersøgelser i enhver skeletmuskulatur sygdom.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For tissue freezing | |||
| Liquid nitrogen dewar with a liquid withdrawal device | Custom Biogenic Systems | Lab-5 Series | Any other liquid nitrogen dewar could substitute. |
| Cold-conductive container | Fisher | 02-583A | |
| Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen | Nalgene | 4150-2000 | |
| Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer | Thomas Scientific | 1228Y01 | Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing. |
| For single fiber functional testing | |||
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11 | |
| Sylgard coating | Ellsworth Adhesives | 3-6636 | |
| Dissection stereomicroscope | Harvard Apparatus | 693101 | Any other dissection microscope could substitute. |
| For cell culture | |||
| Sterile laminar flow hood | Thermo Scientific | 51022485 | Any other cell culture hood could substitute. |
| For tissue freezing | |||
| Plastic bags/containers | Nasco | B01009WA | |
| Thermal safety gloves | Denville | G4162 | |
| Face shield | Fisher Scientific | S47640 | |
| Long forceps | Fisher Scientific | 12-460-807 | |
| Marker | Staples | 125328 | |
| For cell culture | |||
| Sterile 50 ml conical tubes | Denville | C1060-P | |
| PES filter unit, 500 ml, 0.22 µm | Denville | F5227 | |
| Sterile forceps | Fisher Scientific | 644320 | |
| Ice packs | Fisher Scientific | NC9909223 | |
| Insulated styrofoam box | Polar Tech | 207F | |
| Packing tape | Staples | 795570 | |
| Tissue freezing | |||
| Liquid nitrogen | Airgas | NI NF160LT350 | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma | M32631-4L | Store Isopentane in a flammable materials cabinet. |
| EM fixative (choose one) | The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM. | ||
| 2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 16537-15 | |
| Karnovsky's fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer) | Electron Microscopy Sciences | 15732-10 | |
| For functional studies (if desired) | |||
| Relaxing solution, containing (in mmol/L) | |||
| 40 BES | Sigma | B9879 | |
| 10 EGTA | Sigma | E4378 | |
| 6.56 MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| 5.88 Na-ATP | Sigma | A3377 | |
| 1.0 DTT | RPI | D11000 | |
| 46.35 K-propionate | Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1 | ||
| 15 creatine phosphate, pH 7.0 | Sigma | P7936 | |
| 0.4 leupeptin | Calbiochem | 10895 | |
| 0.1 PMSF | Sigma | P7676 | |
| Skinning solution, containing | |||
| Relaxing solution (See Above) | |||
| 0.5% Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Indicating silica granules | |||
| Flat pieces of cork (1 x 1 inch) | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| For cell culture (if desired) | |||
| Complete Growth Medium, containing (for 500 ml) | Sterilize by filtering the solution through a 500 ml 0.22 µm PES filter unit. Store at 4°C and use within 1 month. | ||
| 395 ml of high glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D5671 | |
| 100 ml of fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F6178 | |
| 5 ml of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG) | Sigma | G1146 | |
| See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications |
References
- Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. 15, Elsevier. 407-442 (2007).
- Lawlor, M. W., et al. Enzyme replacement therapy rescues weakness and improves muscle pathology in mice with X-linked myotubular myopathy. Hum Mol Genet. 22, 1525-1538 (2013).
- Talmadge, R. J., Roy, R. R. Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms. J Appl Physiol. 75, 2337-2340 (1993).
- Blau, H. M., et al. Differentiation properties of pure populations of human dystrophic muscle cells. Exp Cell Res. 144, 495-503 (1983).
- Lawlor, M. W., et al. Myotubularin-deficient myoblasts display increased apoptosis, delayed proliferation, and poor cell engraftment. Am J Pathol. 181, 961-968 (2012).
- Pavlath, G. K., Gussoni, E. Human myoblasts and muscle-derived SP cells. Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).
- Webster, C., Blau, H. M. Accelerated age-related decline in replicative life-span of Duchenne muscular dystrophy myoblasts: implications for cell and gene therapy. Somat Cell Mol Genet. 16, 557-565 (1990).
- Ottenheijm, C. A., et al. Thin filament length dysregulation contributes to muscle weakness in nemaline myopathy patients with nebulin deficiency. Hum Mol Genet. 18, 2359-2369 (2009).
- Witt, C. C., et al. Nebulin regulates thin filament length, contractility, and Z-disk structure in vivo. EMBO J. 25, 3843-3855 (2006).
- Garton, F., et al. Validation of an automated computational method for skeletal muscle fibre morphometry analysis. Neuromuscul Disord. 20, 540-547 (2010).
- Kim, Y. J., et al. Fully automated segmentation and morphometrical analysis of muscle fiber images. Cytometry A. 71, 8-15 (2007).
- Lawlor, M. W., et al. Inhibition of activin receptor type IIb increases strength and lifespan in myotubularin-deficient mice. Am J Pathol. 178, 784-793 (2011).
- Mula, J., et al. Automated image analysis of skeletal muscle fiber cross-sectional area. J Appl Physiol. 114, 148-155 (2013).
- Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. , Elsevier. 407-442 (2007).
- Nance, J. R., et al. Congenital myopathies: an update. Curr Neurol Neurosci Rep. 12, 165-174 (2012).
- Clarke, N. F., et al. Mutations in TPM3 are a common cause of congenital fiber type disproportion. Ann Neurol. 63, 329-337 (2008).
- Lawlor, M. W., et al. Mutations of tropomyosin 3 (TPM3) are common and associated with type 1 myofiber hypotrophy in congenital fiber type disproportion. Hum Mutat. 31, 176-183 (2010).
