Abstract
Skjelettmuskulatur er en unik vev på grunn av sin struktur og funksjon, som krever spesifikke protokoller for vev samling for å oppnå optimale resultater fra funksjonelle, cellulære, molekylære, og patologiske evalueringer. På grunn av subtilitet av noen patologiske forandringer sett i medfødte muskelsykdommer og potensialet for fiksering å forstyrre med anerkjennelsen av disse funksjonene, er patologisk evaluering av frossen muskel foretrekke fremfor faste muskler ved vurdering av skjelettmuskulatur for medfødt muskelsykdom. I tillegg potensial til å produsere alvorlige frysing artefakter i muskel krever spesielle forholdsregler når man fryser skjelettmuskulatur for histologisk undersøkelse som ikke er allment brukt når man fryser andre vev. Dette manuskriptet beskriver en protokoll for hurtig frysing av skjelettmuskel ved hjelp av isopentan (2-metylbutan) avkjølt med flytende nitrogen for å opprettholde optimal skjelettmuskel morfologi. Denne fremgangsmåten er også effektiv for freezing vev beregnet for genetiske eller protein expression studier. Videre har vi integrert vår frysing protokollen inn i en bredere prosedyre som også beskriver foretrukne metoder for på kort sikt triage av vev for (1) enkelt fiber funksjonelle studier og (2) myoblast cellekultur, med fokus på minimal innsats er nødvendig for å samle vev og frakte den til spesialiserte forsknings-eller referanselaboratorier for å fullføre disse studiene. Samlet gir dette manuskriptet en oversikt over hvor frisk vev kan bli effektivt distribuert til en rekke fenotypiske studier og dermed gir standard operasjonsprosedyrer (SOP) for patologiske studier knyttet til medfødt muskelsykdom.
Protocol
Etiketten beholderne som skal brukes for lagring av muskel med passende identifikatorer for dyret og muskel høstet. Pre-kjøle poser / beholdere og apparater for å forhindre frysing / tining av vevet når den tilsettes.
En. Studie-design hensyn til muskelvev Collection
- For små dyr (murine) modeller av muskelsykdommer, bruke en hel muskel for studiet siden små dyremodeller krever ofte evaluering av en hel muskel til å gi tilstrekkelig myofiber prøvetaking for patologiske undersøkelser. For stort dyr (canine) modeller av muskelsykdommer, bruker muskel deler som er i det minste 0,3 x 0,3 cm eller mer i sin tverr-(tverrsnitt) aspekt.
MERK: Kjerne biopsier kan også brukes, men kan være suboptimal for primær karakterisering studiene på grunn av prøveuttakingen. - For studier som involverer sarcomere, kan ultrastructural måling av sarkomerlengde omfatte en kritisk endepunkt og kan require spesialisert håndtering. Dette er vanligvis bare aktuelt ved sykdommer der elementer av de sarcomere viser upassende lengder, som i noen årsaker til nemalin myopati. Noen laboratorier foretrekke å feste muskel i sin ikke-kontrahert eller strukket tilstand, i stedet for å utføre slike målinger på ikke-strukket eller ikke-strukket muskel.
- Hvis sarkomerlengde ikke vil bli målt, fikse muskelvev uten forhånds strekke muskelen ved å plassere den direkte inn i ønsket EM fiksativ (se reagenser).
- Hvis sarkomerlengda vil bli målt, kan flere teknikker for å forhånds strekke muskelen (se diskusjon) brukes:
- Bruk en klemanordning for å holde muskelen på sitt hvilespenning mens den fortsatt er i dyret, avgiftsdirektoratet muskelen rundt utsiden av klemmen, og legg den direkte i ønsket EM fiksativ (se reagenser).
- Strekk og pin muskelen til en overflate (for eksempel et stykke kork) til en lengde tilsvarende det som er observert
2. Under dele Isolert Skeletal Muscle inn Fragments som er aktuelle for ønsket Studies (Figur 1)
- For frossen muskel histologi:
- Inkluder så mye av en gitt muskel som mulig for å minimere prøvetaking skjevhet (se trinn 1.1), men prøver skal være <1,5 cm for å unngå å fryse gjenstander.
- Behandle alle muskler fra den samme studien på samme måte for å unngå kunstig forskjeller i fiber størrelse på grunn av forskjeller i håndtering.
- For elektronmikroskopi (EM):
- Skjær en ~ 0,5 x 0,2 x 0,2 cm strimmel av muskel fra prøven, med lengdeaksen av prøven parallelt med den langsgående aksen av den opprinnelige muskulatur.
MERK: fiksativ vil ikke tilstrekkelig trenge tykkere biter av vev, så opprettholde prøven tykkelse på 2 mm eller mindre er avgjørende i å skaffe riktige resultater. I tilleggsom orientering av slike små fragmenter av muskelen er ofte vanskelig, er det tilrådelig å bruke et fragment av vev som etterligner den faktiske retning av muskelen (dvs. er den lengste del av de faste prøven lengderetningen av muskel / myofibers) til minimere håndtering og forvirring under EM behandling.
- Skjær en ~ 0,5 x 0,2 x 0,2 cm strimmel av muskel fra prøven, med lengdeaksen av prøven parallelt med den langsgående aksen av den opprinnelige muskulatur.
- For cellekultur:
- Den ønskede celleKapasiteten kan påvirke mengden av muskelen som kreves for cellekultur anlegget. Enkelt muskler (eller deler av muskler) fra små dyr kan gi utilstrekkelig celle tall å etablere cellekulturer, så hvis det er nødvendig, basseng vev fra flere muskler.
Tre. Tissue Fiksering og Processing Elektronmikroskopi (EM)
- Plasser et fragment av muskel som ikke er større enn 2 mm i sin tynneste dimensjon direkte inn i den ønskede EM fiksativ (se Reagents).
- Plasser muskel i EM fiksativ buffer (se reagenser) etter 2-48 timer av fixatipå. Langvarig fiksering (i uker eller måneder) kan resultere i tap av ultrastructural detalj på EM-studier.
- Send til en EM kjerne anlegg for prosessering.
4. Muscle Frysing for Histologisk, biokjemiske og molekylære studier
- Fjern høy fuktighet i prøven ved grundig blotting av prøven med et papirhåndkle inntil vevet er svakt vedheftende til håndkle. For mye fuktighet vil gi betydelige frysing gjenstander i muskelen.
MERK: Tissue kan tørkes ytterligere ved å rulle den i babypudder. Dette trinn er vanligvis ikke nødvendig for musklene dersom de har vært i en overdrevent fuktig miljø. - Plasser oktober (eller et lignende klebemiddel som gummitragant) i bunnen av et grunt cryomold eller kork, med bare nok oktober å gi et grunnlag for den orienterte muskler (figur 2C). Merking av kork eller cryomold før frysing kan være nyttig for prøve sporing.
- Carefully plassere muskelen i formen i ønsket retning, med de fleste av muskelen stikker fra OCT slik at seksjonert muskelen ikke er i kontakt med OCT (figur 2C).
- Legg isopentan til en metallkopp til den når en dybde på ca 3-4 cm.
- Ta på termiske vernehansker og fjerne lokket av Dewar.
- Plasser eller holde metallkopp er i kontakt med flytende nitrogen, slik at nivået av flytende nitrogen på utsiden av koppen er høyere enn nivået ved det isopentan på innsiden av koppen. Strategier for å ordne disse beholderne er vist i figur 2..
- Ikke la flytende nitrogen for å gå inn i metall kopp, som det produserer en boblende skum som kan være tungvint å arbeide med (og er også tilstrekkelig kaldt for frysing).
- Observer isopentan å avgjøre når den har nådd riktig temperatur. Ved den passende temperatur (optimalt mellom -140 til -149 ° C), slik atlokk hvite småstein av frossen isopentan vil dannes (etter noen få minutter, og etter den innledende tåken har forsvunnet over isopentan) i bunnen av koppen, og løsningen vil generelt tykkere til konsistensen av melasse. Frysing før dette stadiet vil gi frysing atifacts.
- Hvis isopentan fryser helt fast, tine og chill det til minusgrader igjen før neste bruk.
- Ved hjelp av pre-kjølt tang, senke prøven og kork / mold inn i isopentan for ca 10-20 sek.
- Plasser de frosne prøven i et på forhånd avkjølt beholder.
- Hold prøven og beholderen på tørris til enhver tid frem til overføring til en -80 ° C fryser.
5. Hvis Frysing Artifact er til stede i allerede Frozen Tissue, er det mulig å øke graden av underkjølt Artifact ved hjelp av følgende "Thaw og fryses" Prosedyre
- Ta blokker ut av fryseren, en om gangen, Og holde dem på tørris. Tidspunktet for denne protokollen er kritisk. Bare tine og fryses ett kvartal om gangen.
- Flytt prøve fra tørris til RT.
- Hvis prøven var innebygd i oktober, fjerne rundt oktober så fullstendig som mulig ved hjelp av en skalpell.
- Tillat prøven å tine ved romtemperatur til et punkt der den er helt tint, men ikke til et punkt hvor den tørker ut.
- Forsiktig prod prøven med en tang for å sikre at prøven er fullstendig opptint før man går videre til neste trinn.
- Fryse muskelen som angitt i trinn 04.01 til 04.10.
6. Utarbeidelse av Muscle for Skinned Enkelt Fiber Functional Testing
- Lagrings fremgangsmåte for muskelen avhenger når muskelen / fiber blir brukt for eksperimenter.
- For bruk i løpet av få uker, legg muskelen i en løsning av 50% glycerol/50% avslappende løsning (se reagenser), og oppbevar ved -20 ° C.
- For bruk akteruteh noen uker, legg muskelen i en løsning av 75% glycerol/25% avslappende løsning (se reagenser), og oppbevar ved -80 ° C.
- Alternativt, la muskel tørr, pin til kork, og butikken på silika granulat ved -80 ° C. Disse dehydrerte muskler kan brukes i mange år.
7. Utarbeidelse av Fresh Muscle for forsendelse av Cell Culture til Outside Laboratories
Protokoller for etablering av cellekulturer har blitt godt beskrevet andre steder 4-7.
- Fyll en 50 ml steril konisk rør med steril komplett vekstmedier.
- Tilsett muskelvev til røret ved hjelp av en steril pinsett, fullstendig å nedsenke vevet i mediet.
- Fyll resten av røret med media for å hindre uttørking under transport.
- Legg isposer til isoporboksen og plassere den koniske røret nær flere isposer.
- Vær oppmerksom på at kun isposer (og ikke tørr is) bør brukesfor å hindre skader som følge av frysing av væsken og vev.
- Ship pakker O / N, men vev kan vare to dager under disse forholdene.
Representative Results
Å gi eksempler på gjenstander sett med uriktig frysing, ble flere muse quadriceps muskler frosset ved hjelp av ulike teknikker (figur 3) for å gjenskape vanlig-oppstått feil. Som vist på figur 3A, viser hensiktsmessig frosset skjelettmuskulatur en tett stilling over myofibers til det omgivende vev (vanligvis andre muskelfibre, men noen ganger endomysial rommet mellom myofibers er fylt med fibrose eller inflammatoriske celler i en rekke sykdommer eller skader prosesser) og en godt synlig cytoplasmatisk rommet. For patologisk analyse, er muligheten til å vise den intracellulære plass ofte viktigere enn endomysial rommet, så det er vanligvis viktig å tydelig identifisere tilstedeværelsen av degenerative forandringer, regenerative forandringer eller andre Patognomonisk funn (sentrale kjerner, intracellulære inneslutninger) i dette plass. Således nærvær av iskrystaller i den intracellulære avdeling representerer amajor problem i patologisk vurdering av muskel.
Riktig frysing av muskelvev krever både tilstrekkelig lave temperaturer, og en tilstrekkelig hastighet for frysing for å unngå dannelsen av iskrystaller. Selv når regnskap for begge faktorene, kan betydelig fryse artefakt fortsatt oppstå på grunn av høy fuktighet i muskelvev. Dette problemet er mest vanlig forekommende i muskelvevet som hadde vært tidligere fordypet i saltvann og utilstrekkelig tørket eller når muskelen har vært i direkte kontakt med oktober montering media på stedet av seksjonering (Figur 3B, 3E). Mens noen kontakt med oktober vanligvis er uunngåelig som følge av monteringsprosessen, skulle alt bli gjort for å unngå kontakt mellom områder som vil bli evaluert histologisk og oktober benyttes for montering. I kontrast, ble prøver frosset ved hjelp av en -80 ° C fryser (figur 3C) og flytende nitrogen (figur 3D) gir f.ekss for frysing artefakt som er produsert av suboptimal temperatur eller hastighet på frysepunktet. Den langsomme frysing støtt ved å plassere vev i en -80 ° C fryser gir et ekstremt eksempel på å fryse gjenstand. Ved bruk av flytende nitrogen, er hovedproblemet at kontakt mellom flytende nitrogen og vevet forårsaker en kappe av nitrogen i gassform for å danne på vev-væske-grensesnittet, og denne gassformede grensesnittet ikke er tilstrekkelig kald til å produsere hurtig muskel frysing 1.. Dette kan gi betydelige fryse gjenstand i nærheten av overflaten av prøven, men innvendige deler av prøven er mer sannsynlig at flash-frysing ved en passende hastighet, og kan bli helt skånet for frysing gjenstanden. Mens enkel nedsenking av muskelvev i flytende nitrogen er ikke på langt nær så nyttige som de isopentan-fryseprosessen, kan det være nyttig for frysing av store muskelprøver i situasjoner hvor isopentan ikke er tilgjengelig (for eksempel kliniske obduksjonsprøver på institusjonerut kliniske muskel patologi laboratorier). Resultater ved hjelp av denne strategien er generelt bedre når du bruker store deler av vev (> 2 cm i flere dimensjoner).
Mens unngåelse av fryse gjenstanden gir optimale histologiske resultater, har en teknikk som også blitt utviklet (og beskrevet heri), som i det vesentlige reverseres frysing gjenstander for å tillate evaluering av feil frosne vev. Vev som er feil frosset (figur 3E) kan tines og fryses igjen henhold tett kontrollerte forhold (figur 3F) for å tillate den omfordeling av vann i fibrene, og graden av morfologiske konservering som er oppnåelig kan være utmerket. Etter vår erfaring er bevarer denne prosessen den intracellulære morfologi av vevet i en bemerkelsesverdig grad, men det kan ofte gi en kunstig separering av fibrene innenfor den endomysial plass. Ettersom mange patologiske endepunkter er funnet i det intracellulære rom og de iden endomysial plass vises best ved bruk av spesielle flekker (enten for å markere fibrose eller å identifisere andre celletyper), disse artifactual endringene er usannsynlig å virkelig forringe patologisk evaluering av muskel.
Figur 1. Triage av vev for strukturelle, funksjonelle, og cellulære studier av skjelettmuskulatur. Avhengig av hvilke typer studier ønsket, kan samlet skjelettmuskelvevet bli behandlet på en rekke måter for optimale resultater. Protokollene er skissert i denne artikkelen beskriver metoder for triaging eller behandling skjelettmuskelprøver for off-site studier for å optimalisere resultatene oppnåelig fra ekspert kjernefasiliteter.
Figur 2. Eksempler på apparatur som benyttes for muskel frysing. Som beskrevet i protokollen, optimal muskel frysing krever nedsenkning av muskelvev i isopentan som på sin frysetemperatur. En sikker og effektiv måte for å oppnå is-kald isopentan innebærer bruk av en metallbeholder for det isopentan som blir avkjølt i et omgivende Dewar inneholdende flytende nitrogen. Som det ofte er fordelaktig å ha begge hender fri, er det mulig å bruke en spenne, for eksempel en ring stativ (A) for å holde isopentan beholderen i flytende nitrogen mens hindre blanding av de to væsker. Alternativt kan beholderen også holdes i flytende nitrogen manuelt (B). I begge tilfeller bør vevet ikke bringes inn i isopentan til isopentan er synlig frysing ved bunnen av beholderen (vanligvis som opake hvite småstein), og bør være nedsenket i 10-20 sekunder for å sikre fullstendig frysing. Isopentane ved frysetemperatur gir minimal "tåke", (dvs., er temperaturen utilstrekkelig hvis betydelig tåke er til stede). Straks vevet er frosset, plassere det direkte i forhånds avkjølte beholdere (og så direkte inn i en kjøler eller fryser) for å forhindre utilsiktet opptining etter frysing. (C) Hensiktsmessig montert frosne muskel bør ha mesteparten av muskelvev som rager ut fra en base av frossen oktober
Figur 3. Eksempler på iskaldt gjenstand, og med effektiv tining / gjenfrysing. Representative bilder av (A) hensiktsmessig isopentan frosset muskel, (B) muskel frosset hensiktsmessig i isopentan, men samtidig er i kontakt med oktober monteringsmedium, (c) muskelen frosset i en -80 ° C fryser, og (D (B), det høye væskeinnholdet i oktober produserer betydelig fryse gjenstand i muskelen som er i kontakt med den, slik at bare den minimale mengde som kreves for montering oktober skal brukes, og muskelen for histologisk evaluering bør være "stående ut "fra dets overflate. Den treghet av fryseprosessen ved hjelp av en (C) -80 ° C fryseren eller (D) for flytende nitrogen (i forhold til hastigheten for frysing i is-kald isopentan) kan føre til produksjon av betydelige fryse gjenstanden. Panel E og F viser muskel fra den samme prøven som var (E) i utgangspunktet suboptimalt i frossen tilstand (på grunn av overdreven kontakt med OCT), og deretter (F) tint og hvis ved hjelp av teknikken som er beskrevet her. Selv om man kan observere noen kunstig avstanden mellom fibrene i det refrozen prøven, hvor forbedringen in den intracellulære morfologi av muskelfibre er lett synlig. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Skjelettmuskel er strukturelt og funksjonelt unik vev, og spesialiserte forberedende tiltak er nødvendige for å tillate optimal vurdering av strukturelle og funksjonelle parametre. Mens en rekke vev er ofte frosset for patologiske studier i klinisk og forskningsmessig, frysing protokoller for ikke-muskel vev som regel innebære total nedsenking av vevet i oktober før frysing. Som vist i figur 3, er en slik protokoll uegnet for patologisk vurdering av skjelettmuskulatur, og likevel er like nok til protokollen som er beskrevet her at dette er en vanlig forekommende feil. Målet med denne artikkelen er å gi en enkel protokoll for riktig håndtering av muskler for å unngå problemer som dette. Råd har også blitt utarbeidet på forsvarlig håndtering av muskel for off-site fysiologiske og cellulære studier i et forsøk på å legge til rette for kjøp av data av høy kvalitet ved utenom kjerne laboratorier i tilfeller Where på stedet studier er ikke å foretrekke eller mulig.
Som angitt i denne protokoll, elementer som er helt avgjørende i riktig behandling av muskel for patologiske undersøkelser omfatter å redusere vanninnholdet i vevet, redusere den temperatur ved hvilken muskelen er frosset, og å øke hastigheten ved hvilken frysing er oppnådd. For mye fuktighet i vevet eller overdreven treghet av fryseprosessen (produsert av utilstrekkelig temperatur, eller mangel på direkte kontakt mellom frysemiddel og vev, som er påtruffet med flytende nitrogen) vil føre til frysing artefakter som kan svekke patologisk analyse. Som oktober gir en ekstra kilde til vevsfuktighet, mange laboratorier bruker andre lim som gummitragant som en embedding substrat. Selv i tilfeller der frysing er utført på riktig måte, bør man sørge for å unngå senere uhell tining prøver gjennom kontakt med RT containere eller instrumenter.Således krever en vellykket frysing en grad av planlegging som inneholder en pre-kjøling av alle instrumenter og beholdere som skal benyttes. Ved frysing gjenstander er oppstått, er det en fremgangsmåte som beskrives her for utvinning av vev som er tilstrekkelig for de fleste patologiske evalueringer. Men denne fryse / tine-syklus tilbyr ikke perfekt histologi, og har potensiale til å påvirke andre molekylære eller enzymatiske undersøkelser av vevet (i tillegg til den tid som kreves for å re-fryse vevet), slik at ved bruk av passende startfryse praksis er langt å foretrekke . I de tilfeller hvor frysing gjenstand er oppstått på pre-frosne vev kan imidlertid den teknikk som er beskrevet her, kan være meget nyttig.
Fiksering og behandling av vev for EM kan tilby spesifikke tekniske utfordringer som krever planlegging før vev samling. Den vanligste feilen når samle prøver for EM innebærer bruk av vev fragmenter som er for tykk for glutaraldehyde å trenge gjennom. Som glutaraldehyd kun penetrerer omtrent 0,1 cm inn i muskelvevet fra en gitt overflate, forsiktighet bør utvises for å sikre at en dimensjon av de elektromagnetiske prøvene ikke er tykkere enn 0,2 cm. I tillegg, som EM er et utmerket middel for direkte å evaluere den kontraktile apparat, har noen forskere utviklet strategier for å pre-spenning eller forstrekking muskelen før fiksering for å tillate måling av kontraktile elementer ved en fysiologisk relevant spenning. Det er ingen standard protokoll for forspenning, men to strategiene er kort beskrevet i denne protokollen. Det bør bemerkes at forsøk på å forspenning muskelen kan gi uforutsette resultater med mindre de er gjort på en veldig bestemt måte, og det kan være en fordel å fikse musklene i slakk tilstand for å hindre artifactual endringer i sarkomerlengde gjennom en ikke-standard forspenning prosedyre 8,9. For muskler der slike konkrete målinger er ikke nødvendig (inkludert de fleste biopsies utført for kliniske formål), er arbeidet med å forhånds spenning i muskelen generelt ikke gjort, og den viktigste effekten på muskel morfologi er en uensartet avstand på sarcomeres i muskelen.
Denne artikkelen er den første i en serie for å gi SOPer for utførelsen av tester i medfødt muskelsykdom feltet, og det representerer innsatsen til over 20 eksperter på medfødt muskelsykdom felt som rutinemessig utføre mobilnettet, molekylær, funksjonelle, fysiologiske, og patologisk forskning. En rekke publiserte SOPer vil bli gjort tilgjengelig i løpet av det kommende året, og de nødvendige protokoller og riktig bok formater for hvert ble diskutert på en medfødt muskelsykdom Consortium Workshop avholdt i april 2013 i Washington DC Målet med denne SOP innsats er å gi et veikart for den nødvendige testing og analyse av prøver i medfødt muskelsykdom feltet til en) standardisere praksis og endepunkter som brukes i vårt felt som mUCH som mulig, og 2) gi instruksjon på standard praksis for nye forskere i vårt felt. Vi mener at disse ressursene vil lette oppføring av nye etterforskere i vår under-studert feltet og dermed forbedre omfanget av forskning som kan utføres. I tillegg vil en standardisering av praksis være svært nyttig for å sammenligne data på tvers av studier og å identifisere endepunkter ved planlegging og gjennomføring prekliniske og kliniske studier.
Mens hovedfokus i denne artikkelen er relatert til den aktuelle frysing og utarbeidelse av vev for en rekke studier, vår samarbeidsgruppe diskuterte også de nyttige endepunkter for patologisk analyse av muskelprøver. I dag er det ingen offisiell enighet om tilnærmingen til å ta ved utføring av patologisk analyse, og en rekke forskjellige undersøkelser er utført for å relatere nye oppdagelsene til tidligere publikasjoner for hver respektive sykdom. Derfor tenkte vi at det ville være nyttig åforeslå noen generelle retningslinjer for planlegging av patologiske endepunkter i muskel patologi karakterisering. Før kvantifisere patologi i en undersøkelse, må betydelig tenkte bli satt inn 1) metoden for fiberstørrelse måling, 2) mulighet for fiber-type-spesifikke abnormaliteter eller behandlingsvirkninger, 3) mulighet for uregelmessigheter eller effekter som er begrenset til individuelle muskler, og 4) en strategi for å kvantifisere patologiske funn som er karakteristisk for sykdommen under studien. Fiber størrelse er en nødvendig endepunkt for de fleste studier, og dessverre er det omfattende variasjon i hvordan det er kvantifisert. Mange studier rapporterer disse resultatene ved hjelp av automatiserte kvantifisering metoder som tilbys av proprietære bildebehandlingsprogrammer, men mange av disse programmene ta snarveier (for eksempel anta at fibrene er sirkler eller ellipser) som kan gjengi disse automatiserte målingene unøyaktig. Det er nødvendig å forstå hvordan disse automatiske programmer gjør sine målinger before å ha tillit til målingene, og vi oppfordrer etterforskerne å inkludere disse detaljene i papir metoder. I tillegg er den spesifikke målingen som brukes til å betegne fiberstørrelsen er svært variabel, og enkelte målinger er å foretrekke fremfor andre, 10,11. En vanlig brukt måling av fiberstørrelsen er den fibertverrsnittsareal (CSA), særlig fordi undersøkere som utfører fysiologiske studier standardisere deres resultater for å CSA målinger innhentet ved hjelp av sine instrumenter. Dessverre, mens CSA målinger kan nøyaktig reflektere fiberstørrelse i perfekt tverrgående seksjoner, er de i stor utstrekning er avhengig av fiberretningen (i den utstrekning det langsgående eller skrått-delt fibrene vil ha kunstig høye CSA-måling), og er derfor ikke ideelt mål for fiberstørrelse. Et foretrukket måling av fiberstørrelse som er mindre avhengig av fibertverrsnittsareal er minimum Feret største diameter (MinFeret diameter), som er måling av the mindre diameter i muskelcellen 12. Denne måling er bare svakt avhengig av fiberorientering, og er generelt klinisk gull-standarden for fibermåling, og undersøkere oppfordres til å bevege seg mot bruken av denne teknikk. Disse målingene kan ofte gjøres ved hjelp av den samme programvaren som genererer CSA målinger 13, og er også grei å måle manuelt. Med hensyn til å vurdere patologiske data etter type fiber, bestemt muskel, og i sammenheng med patologiske funn knyttet til den spesifikke sykdommen, disse er mindre kontroversielle spørsmål som bør bare vurderes under planleggingen av en studie. Fibertype kan evalueres ved hjelp av immunhistokjemiske eller ATPase flekker, men det er nyttig å tenke på at spesifikke muskler og dyrearter har spesifikke blandinger av disse fibertyper (og dermed nødvendiggjør ulike forventninger og teststrategier). Muscle bestemt patologisk engasjement eller behandlingseffektenkan forekomme, og total muskelvekt sammenlignet med kontroller kan brukes for å identifisere graden av heterogenitet av sykdommen før de bestemmer på musklene til patologisk evaluere. Endelig, er det velkjent at mange muskel sykdommer er assosiert med spesifikke patologiske abnormiteter (f.eks nemalin stenger i nemalin myopati) 14,15, og så er det også nyttig å vurdere hvorvidt disse abnormiteter er funnet i en fiber-type-eller muskel -spesifikk fordeling for utførelse av analysen 16,17. Total, mens vi ikke foreslå en lite fleksibel sett med standarder for evaluering av muskel, tror vi at disse spørsmålene bør vurderes før utførelsen av patologiske undersøkelser i noen skjelettmuskelsykdommer.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For tissue freezing | |||
| Liquid nitrogen dewar with a liquid withdrawal device | Custom Biogenic Systems | Lab-5 Series | Any other liquid nitrogen dewar could substitute. |
| Cold-conductive container | Fisher | 02-583A | |
| Wide insulated container capable of holding liquid nitrogen | Nalgene | 4150-2000 | |
| Oakton Temp 10 Thermocouple Thermometer | Thomas Scientific | 1228Y01 | Optional, but can be very useful in identifying the point at which isopentane is freezing. |
| For single fiber functional testing | |||
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11 | |
| Sylgard coating | Ellsworth Adhesives | 3-6636 | |
| Dissection stereomicroscope | Harvard Apparatus | 693101 | Any other dissection microscope could substitute. |
| For cell culture | |||
| Sterile laminar flow hood | Thermo Scientific | 51022485 | Any other cell culture hood could substitute. |
| For tissue freezing | |||
| Plastic bags/containers | Nasco | B01009WA | |
| Thermal safety gloves | Denville | G4162 | |
| Face shield | Fisher Scientific | S47640 | |
| Long forceps | Fisher Scientific | 12-460-807 | |
| Marker | Staples | 125328 | |
| For cell culture | |||
| Sterile 50 ml conical tubes | Denville | C1060-P | |
| PES filter unit, 500 ml, 0.22 µm | Denville | F5227 | |
| Sterile forceps | Fisher Scientific | 644320 | |
| Ice packs | Fisher Scientific | NC9909223 | |
| Insulated styrofoam box | Polar Tech | 207F | |
| Packing tape | Staples | 795570 | |
| Tissue freezing | |||
| Liquid nitrogen | Airgas | NI NF160LT350 | Store liquid nitrogen in containers designed for low-temperature liquids |
| Isopentane (2-methylbutane) | Sigma | M32631-4L | Store Isopentane in a flammable materials cabinet. |
| EM fixative (choose one) | The buffers without fixative should also be available, as EM-fixed tissues should be transferred from fixative to buffer after several hours or days if they are not immediately processed for EM. | ||
| 2.5% glutaraldehyde in 0.1M cacodylate buffer | Electron Microscopy Sciences | 16537-15 | |
| Karnovsky's fixative (3% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.1M phosphate buffer) | Electron Microscopy Sciences | 15732-10 | |
| For functional studies (if desired) | |||
| Relaxing solution, containing (in mmol/L) | |||
| 40 BES | Sigma | B9879 | |
| 10 EGTA | Sigma | E4378 | |
| 6.56 MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| 5.88 Na-ATP | Sigma | A3377 | |
| 1.0 DTT | RPI | D11000 | |
| 46.35 K-propionate | Make a solution by mixing proprionic acid (Sigma P1386) and KOH (Fisher P250) 1:1 | ||
| 15 creatine phosphate, pH 7.0 | Sigma | P7936 | |
| 0.4 leupeptin | Calbiochem | 10895 | |
| 0.1 PMSF | Sigma | P7676 | |
| Skinning solution, containing | |||
| Relaxing solution (See Above) | |||
| 0.5% Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Indicating silica granules | |||
| Flat pieces of cork (1 x 1 inch) | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Glycerol | Sigma | G2025 | |
| For cell culture (if desired) | |||
| Complete Growth Medium, containing (for 500 ml) | Sterilize by filtering the solution through a 500 ml 0.22 µm PES filter unit. Store at 4°C and use within 1 month. | ||
| 395 ml of high glucose Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma | D5671 | |
| 100 ml of fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F6178 | |
| 5 ml of 100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine (PSG) | Sigma | G1146 | |
| See the materials safety data sheet (MSDS) for all other reagents for storage specifications |
References
- Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. 15, Elsevier. 407-442 (2007).
- Lawlor, M. W., et al. Enzyme replacement therapy rescues weakness and improves muscle pathology in mice with X-linked myotubular myopathy. Hum Mol Genet. 22, 1525-1538 (2013).
- Talmadge, R. J., Roy, R. R. Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms. J Appl Physiol. 75, 2337-2340 (1993).
- Blau, H. M., et al. Differentiation properties of pure populations of human dystrophic muscle cells. Exp Cell Res. 144, 495-503 (1983).
- Lawlor, M. W., et al. Myotubularin-deficient myoblasts display increased apoptosis, delayed proliferation, and poor cell engraftment. Am J Pathol. 181, 961-968 (2012).
- Pavlath, G. K., Gussoni, E. Human myoblasts and muscle-derived SP cells. Methods Mol Med. 107, 97-110 (2005).
- Webster, C., Blau, H. M. Accelerated age-related decline in replicative life-span of Duchenne muscular dystrophy myoblasts: implications for cell and gene therapy. Somat Cell Mol Genet. 16, 557-565 (1990).
- Ottenheijm, C. A., et al. Thin filament length dysregulation contributes to muscle weakness in nemaline myopathy patients with nebulin deficiency. Hum Mol Genet. 18, 2359-2369 (2009).
- Witt, C. C., et al. Nebulin regulates thin filament length, contractility, and Z-disk structure in vivo. EMBO J. 25, 3843-3855 (2006).
- Garton, F., et al. Validation of an automated computational method for skeletal muscle fibre morphometry analysis. Neuromuscul Disord. 20, 540-547 (2010).
- Kim, Y. J., et al. Fully automated segmentation and morphometrical analysis of muscle fiber images. Cytometry A. 71, 8-15 (2007).
- Lawlor, M. W., et al. Inhibition of activin receptor type IIb increases strength and lifespan in myotubularin-deficient mice. Am J Pathol. 178, 784-793 (2011).
- Mula, J., et al. Automated image analysis of skeletal muscle fiber cross-sectional area. J Appl Physiol. 114, 148-155 (2013).
- Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. , Elsevier. 407-442 (2007).
- Nance, J. R., et al. Congenital myopathies: an update. Curr Neurol Neurosci Rep. 12, 165-174 (2012).
- Clarke, N. F., et al. Mutations in TPM3 are a common cause of congenital fiber type disproportion. Ann Neurol. 63, 329-337 (2008).
- Lawlor, M. W., et al. Mutations of tropomyosin 3 (TPM3) are common and associated with type 1 myofiber hypotrophy in congenital fiber type disproportion. Hum Mutat. 31, 176-183 (2010).
