Summary
プロトコルの目的は、細胞およびインビボで細胞質DNAセンシング経路を刺激するための最適な方法を使用することである。これは、平滑末端ライゲーションの間に長い、二本鎖DNAの生成を改善することによって達成される。細胞またはマウスは、その後、脂質トランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトされる。
Abstract
効率的に先天性免疫応答を刺激するために、DNAは、十分な長さと純度でなければならない。私たちは、必要な特性を持つ二本鎖DNA（dsDNAのは）センシング経路が安価かつ容易に生成することができ細胞質DNAを刺激する手法を提案する。 （CpGモチーフを欠く）、短い合成オリゴヌクレオチドのコンカテマー化によって、二本鎖DNAは、細胞質DNAセンシング経路を活性化するのに十分な長さであるように生成することができる。このプロトコルは、効率的なライゲーションが起こるための環境を提供し、ポリエチレングリコール（PEG）の存在下でオリゴヌクレオチドの平滑末端ライゲーションを伴う。二本鎖DNAコンカテマーを、標準的なトランスフェクションプロトコールによるインビトロでの先天性免疫応答をシミュレートするために、フェノール/クロロホルム抽出により精製後、使用することができる。このDNAはまた、例えば、マウスの耳介に皮内注射することによってインビボでの先天性免疫を刺激するために使用することができる。バイコンカテマー化プロセスとその後の刺激プロトコルを標準化する、自然免疫系の信頼性と再現性の活性化は、製造することができる。
Introduction
DNAは、真核生物は、特定の区画に保つ全ての生物や細胞の重要な構成要素である。自然免疫系の1つの機能は、異物が物理的、外部障壁の違反を介して生物に導入されたときそのような区画化が故障したとき、または識別することである。人体では、正しい区画化を逃れることが少量のDNAを分解する手助けするために存在するタンパク質の数があります; DNA分解酵素I、II、およびIIIは、それぞれ、血漿、エンドソーム、および細胞質ゾル中のDNAを分解する。しかし、DNA分解酵素IIを欠くマウスは、自然免疫系は、外核DNAに応答することを示唆しているインターフェロン1の過剰産生に起因する重度の貧血で死ぬことが示されている。この応答はあっても、Toll様受容体シグナル伝達能力の完全に欠損しているマウスでは発生します。多くの研究は現在、インターフェロン遺伝子（STING）2およびTANK結合キナーゼ1（TBの刺激装置を示しているK1）3は、細胞質中のDNAの検出およびこのシグナル伝達経路は、インターフェロン調節因子（IRF）-3 4を活性化することに関与している。サイトカイン、ケモカイン、およびインターフェロン遺伝子のその後のIRF3依存性転写は、病原体や危険関連分子パターン（PAMPまたはDAMP）5のいずれかに先天性免疫応答の特徴である。
細胞内の核酸センシング経路を研究するための欲求が、他の先天性免疫応答を活性化することなく細胞内にDNAまたはRNAを導入することによって細胞を刺激するための堅牢かつ再現性のある方法を開発する必要性につながっている。 STING / TBK1 / IRF3経路を刺激することのできる一つの方法は、そのようなDNA-PK、IFI16、およびCGAS 6-8のようなDNAセンサによってアクセスすることができる細胞質内に核酸を送達するためにカチオン性脂質トランスフェクション試薬を使用することによるものである。
現在effのを可能にするように理解されているDNAの特性他の経路の刺激なしの細胞質先天性免疫応答のicient活性化は、その長さ、質量、純度であり、およびCpGの欠如は4,7,9をモチーフ。合成オリゴヌクレオチドは、それらがDNA配列は、純粋な化学種として最適化して調製することを可能にするように先天性免疫応答を生成するために非常に適している。 45塩基対の免疫刺激DNA（ISD）配列は、この目的に適しは、CpGのないシーケンスであるとステットソンら 4により同定された。この二本鎖DNAシーケンスは、そうでなければランダムであり、CpGモチーフの欠如を超えていない特定の機能を持っていません。私たちは、有意に長いストランドにISDオリゴヌクレオチドをconcatemerizingによる刺激7の大きさを増大させることを見出した。コンカテマーISDの生成は、細胞質先天性免疫応答を刺激するために有用である。ここでは、この試薬 を調製するためのプロトコルを提示し、それがDNA にセンシング経路を活性化する方法を試験管内だけでなく、in vivoで 。
注：すべての動物実験が承認制度プロトコルや動物のケアのガイドラインの下で行われている。
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Protocol
1コンカテマー
- 再懸 濁プライマーFWとRVが分子生物学グレードのH 2 O中10μg/μlの濃度に（プライマー配列のための材料の表を参照）その後、1.5mlのマイクロチューブにFwの5μlのとRVのプライマーの5μLを混ぜる。
- 15分間の正しいアニーリング温度（ここで説明するプライマーについて75℃）に加熱することによりアニールプライマーミックス。室温（RT）で冷却するベンチにしておきます。のddH 2 Oに溶解させることにより、このインキュベーション中に60％PEG8000を準備
- 10倍のポリヌクレオチドキナーゼ（PNK）緩衝液、H 2 O27μlの、およびプライマーミックスへPNKの3μlと10μlの60％PEG8000（30％の最終濃度を達成するために）の50を添加する。 2時間37℃でインキュベートする。
- RTでクールダウンし、DNAリガーゼ緩衝液11μlを加える。次に、DNAリガーゼの3 Uを追加し、37℃で一晩インキュベートする。
2 DNA精製と分析
- 連結混合量を増加させるために、H 2 Oを300μlを加える。注：フェノールの毒性によるドラフト内で進みます。クロロホルム蒸気。
- フェノール1容量（400μlの）追加：クロロホルムを激しく振とうすることにより混合します。
- 卓上マイクロにおける1分間最高速度で遠心。水性および溶剤の層が上に水層と2層の間の沈殿したタンパク質の白い層で分離されます。
- 慎重なピペッティングにより新しいチューブに上層を移し（中央の転送を回避するため、白色層）
- 繰り返します2.2と2.3倍以上または全く沈殿したタンパク質は、遠心分離後がなくなるまで繰り返します。
- クロロホルムの1容量（400μl）を添加し、ステップ2.3から2.4を繰り返します。
- 100％予冷2容量のエタノール（800μl）を添加し、少なくとも1時間、または一晩-20℃でインキュベートする。注：このステップは、DNAコンカテマーを沈殿させる。
- 最高速度と吸引Supeのでスピンダウンrnatant。 70％エタノール1mlを添加することにより、一回洗い、ドラフト内で空気乾燥させ。
- エンドトキシンを含まないのddH 2 O50μlの再懸濁DNA注：エンドトキシンを含まない試薬の使用は、細胞およびin vivoでの DNA-特異的先天性免疫応答の生成に重要である。
- 新しいチューブにコンカテマーDNAを2μlのアリコートを取り出し、1ミリリットルDNAゲルローディングバッファーを追加します。
- （オーブン容量の電源に適したまたは時間）で2分間、電子レンジでフルパワーで加熱することによりTAE緩衝液中の1％アガロースを溶解する。
- 鋳造装置にゲルを注ぎ、蛍光DNAキレート色素を4μlを追加、コームを挿入し、設定するためのゲルで約20分間、室温で残す。
- 一度設定し、コームを削除し、TAE緩衝液を含む電気泳動槽にゲルを置く。ロードウェルにDNAサンプルやサイズマーカーの3μlの。
- 定電流で90 Vで30〜40分間、ゲル電気泳動を実行します。 Visualiぜ紫外光下でDNAのコンカテマー化（ 図1A）を観察した。
- UV吸光度分光法によって試料の残りの部分でDNA濃度を測定する。 DNAを再懸濁し、200〜300ナノメートルの吸光度スペクトルを測定するために使用した同じのddH 2 Oブランク分析計。注：DNA、Aは吸光度で濃度がランベルト·ベールの法則を用いて計算することができ、A =イー·のc * lを、吸光係数をメール、およびlは光路の距離。 DNAを測定するために260nmにおける吸光度を測定し、0.027の吸光係数（μg/ ml）をすべきである-1 cm -1で使用される濃度。光路距離、lは、分光光度計に依存して変化する。濃度を測定しながら、DNA純度の指標として280分の260 nmの吸光度比をメモします。 2.00上記のこの比率の値が推奨されます。
VIに二本鎖DNAコンカテマーの3フェTRO
- 組織培養ディッシュまたはプレートにおける種子細胞は、刺激の時点で70％コンフルエントであった。
- 1-10μgの/ mlの最終濃度を用いて細胞を刺激するために必要なDNAの量を計算します。 DNAの必要な質量は、以下のXと表記されます。その後、DNAの2×5 = 10μgの質量が必要とされるの5μg/ mlのDNA濃度で培地2mlで6ウェルプレートの1ウェル中の細胞を刺激した場合の例である。
- 適切なサイズの滅菌チューブに無血清培地50 * Xを添加する。ピペットを慎重媒体の中心に、チューブの側面に触れることなく、陽イオン性脂質トランスフェクション試薬の2 * Xμlの5分間のままにしておきます。
- チューブとボルテックスを簡単にDNAののXμgのを追加します。少なくとも20分間RTでのままにします。 in vitroでのトランスフェクションのために細胞質DNAセンシング経路を刺激するために細胞に直接この混合物を追加します。
二本鎖DNAコンカテマー私の4トランスフェクションnは生体内
- 1μgのDNAを、2μlの脂質トランスフェクション試薬、及び刺激されるマウスの耳あたり18μlの無血清培地を用いて3.1から3.5で説明したように、トランスフェクションミックスを調製する。無菌の30 G針で無菌20μlのハミルトンシリンジ、キャップを用意し、DNAトランスフェクションミックスをロードします。
- 1〜2％イソフルランを使用して、C57BL / 6マウスを麻酔。必要に応じて、運動の損失と一定の呼吸数によってピンチ反射試験による麻酔を確認してください。麻酔中に動物の目を監視し、必要に応じて過度の乾燥を避けるために軟膏を使用しています。
- 無菌技術を使用して、耳の耳介に注意して、液体のシングル「バブル」が耳の皮膚層の間に形成されているように、トランスフェクション混合物10μlを注入する。注：、親指や人差し指にゴム製のシンブルを使用して、その上に耳を伸ばして、針が耳介の皮膚の最初の層を貫通して確保するために鋭角に注入します。
- 手綱troduceマウスが戻ってケージに、定期的にポスト麻酔回復を監視します。麻酔したマウスの過剰な冷却を避けるために、加熱ランプを使用してください。彼らは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまでは無人マウスを放置しないでください。
- フラッシュ2分間液体窒素中に浸漬することにより微小遠心管全体耳介をフリーズ。
定量的PCRによるDNA刺激のサンプルと分析5。処理（定量PCR）
- 細胞培養から：ピペットで吸引メディアと廃棄物を捨てる。
- 滅菌PBSを1mlを加える。 5.1および5.2を二回繰り返し、5.3に進みます
- 耳組織から：無菌セラミック乳棒と乳鉢を用いて液体窒素下で組織を挽く無菌スパチュラを用いてマイクロチューブにアース組織を転送し、5.4に進みます
- 350μlの溶解緩衝液を加えて、市販のRNA抽出キットプロトコールを進める。抽出キット精製からの溶出RNA40μlののddH 2 Oの列注：商業RNA抽出キット（材料/機器の表を参照してください）非常によく動作します。他の技術は、標準以下の結果でテストされている。
- （2.13節）上記のDNAについて説明したように、UV分光法によりRNAを定量化。注：RNAの吸光係数は0.025（μg/ ml）を-1 cm -1である。
- オリゴ1μlの（dT）プライマー、10mMのdNTPミックス1μlの、および250μgのRNAを滅菌したPCRチューブに追加します。無菌のddH 2 Oで11μlにボリュームを構成する
- 65℃で5分間インキュベートする。その後、4μlのファーストストランドバッファー、1μlの0.1Mのジチオスレイトールを追加、0.25μlをチューブに転写酵素および1.75μLのddH 2 Oを逆転。 15分間72℃、続いて1時間50℃でインキュベートする。のddH 2 Oを用いて、5：必要に応じて、cDNA産物1を希釈
- 定量的PCRのために、2μlののddH 2 O、5μlの定量PCRマスターミックス、および1を2μlのcDNAを使用してフォワード10μMのそれぞれをμlでと希望の遺伝子を増幅するためのプライマー株式を反転させます。 96ウェルプレート中で混合し、定量的PCR機（ 図1Bおよび1C）を用いて分析する。
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Representative Results
以下の結果は、コンカテマーDNAを比較的容易に生成され、細胞およびマウスにおける強固な先天性免疫応答を刺激することができることができることを示している。 PEG8000を用いて、それが明らかに発生しているDNAの長さはかなり長く、CXCL10の転写を誘導することも同様に可能であることが分かる。アガロースゲル分析によって見られるようにPEG8000を含むサンプルのために、DNAの長さが10,000 bpの（ 図1A）を超えるストランドを含むのに対し、標準的なコンカテマー化は、最大800塩基対（bp）のDNAの長さを有している。マウス胚性線維芽細胞（MEF）またはマウスへのこれらのDNAのトランスフェクションは、先天性免疫DNAセンシング機構（ 図1Bおよび1C）の刺激を示すqPCRにより測定することができるサイトカインおよびケモカインの強固な転写を誘導する。
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図1コンカテマーISD DNA（conDNA）の産生および線維芽細胞とマウスの刺激を示す代表的なデータ。（A）コンカテマーDNAのサンプルをアガロースゲル電気泳動により分析し、またはPEG8000の有無にかかわらず生じた。 （B）のMEFは、10μg/ mlのにさまざまなDNAを用いて刺激し、CXCL10およびIL-6のmRNAのレベルは、6時間後にqPCRにより測定した。 （C）マウスは、12時間後にqPCRにより測定しconDNA及びCXCL10およびIL-6のmRNAのレベルの耳介内に注射した。データは、HPRTのレベル（RQ）倍の増加と比較として示され、エラーバーは、±SEM（n = 3）である。
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Discussion
ここで説明するプロトコルは、広範囲の細胞型およびin vivoで再現性のある結果を持つ細胞質ゾル先天性免疫応答を刺激する二本鎖DNAを生成するために使用される。使用される主な基質試薬は合成オリゴヌクレオチドであるので、代わりのDNA配列または化学修飾を使用するためのこのシステムの柔軟性がある。それは、例えば、蛍光標識または局在化を追跡したり、他の生体分子との相互作用を評価するためのビオチン部分を含むもので、このプロトコルに記載フォワード鎖オリゴヌクレオチドを置換することが可能である。
DNAのコンカテマー化の主な利点の一つは、シーケンスを制御することができる方法で、dsDNAの長い鎖の産生である。 C：この反応の生成物は、市販のRNAアナログポリ（Iと同様の異なる長さのDNA（の混合物が常にあるので、DNAの長さは正確に監視することができないことであるここつの制限がある））。この技術の別の利点は、（量のmgまで）免疫刺激DNAの大きな塊量の生産を可能にすることである。必要に応じて、それはその後の精製工程は、プロトコルにおいて概説スケールのアリコートで行われるべきであることに留意すべきであるが、コンカテマー化工程は、容易にスケールアップすることができる。
DNAをconcatemerizing他の方法に比べて、主付加はライゲーション効率を向上させるために、ライゲーションミックスにPEG8000を使用することである。 PEG8000を60％（w / v）のストックを作るために溶解させることは困難であることに注意が、ボルテックスし、穏やかに可溶化を助けるために加熱することができる。ライゲーションは、示されているより長い期間インキュベートしておくことができ、これは生成されるDNAの長さに影響を与えるとは思われない。これらは発癌性、腐食性であることができるようにフェノールおよびクロロホルムを取り扱う際にいくつかのケアのニーズも観察すること。私たちの手では遺伝子は、商業用ポリ他の合成DNA（（DAにより上方制御：DT））コンカテマーISDによって上方制御とは異なっている。しかし、他の細胞タイプ間の変動が分析されて反映することができるような差異10は 、見つかっていない。商業ソースからシーケンスや修正の選択を経由してより大きな柔軟性を可能にする：そのような矛盾にもかかわらず、コンカテマーISDは、ポリ（dTをDA）を購入すると比較した場合に生成することが大幅に安いです。
下に研究されているDNAセンシングの一態様は、刺激に対するインビボでの応答である。私たちは、このプロトコルは、 インビボ実験7適したDNAを生成するために使用できることを示した。二本鎖DNA産物は、マウスへの注射および自然免疫シグナル伝達過程の事後測定を可能にするために、純粋な十分に高い濃度である。ここに記載されているプロトコルでは、ケアはエンドトキシン、リボヌクレアーゼ、およびDNA分解酵素がフリーである最終DNAペレットを溶解するために使用する水を確保するために注意する必要があります。遊離DNAまたはDNA-の注射のような、DNA検出法に期待されるとして、インターフェロン応答の脂質複合体の結果は、コンカテマーDNAは、DNAセンシングin vivoでの複数の側面をプローブするために使用することができる。
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Acknowledgments
著者らは、確認応答がありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | TACAGATCTACTAGTGATCTATGA CTGATCTGTACATGATCTACA |
| Reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | TGTAGATCATGTACAGATCAGT CATAGATCACTAGTAGATCTGTA |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | P-4463 | |
| Molecular biology grade water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| T4 polynucleotide kinase | Promega | M4101 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| Phenol:chloroform | Fisher Chemical | BPE1752p-400 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | C/4960/PB08 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | |
| DNA gel loading buffer | New England Biolabs | B7021S | |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Optimem | Life Technologies | 11058021 | |
| TransIT-LT1 | Mirus Bioscience | MIR 2300 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80901 Model 1705 | |
| 30 G needles | BD Bioscience | 304000 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Life Technologies | S33102 | |
| Rneasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Oligo(dT) primer | Thermo Scientific | SO131 | |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | |
| Super Script III reverse transcriptase | Life Technologies | 56575 | |
| First strand cDNA synthesis buffer | Life Technologies | y02321 | |
| SybrGreen qPCR Fast master mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| cxcl10 murine forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | ACTGCATCCATATCGATGAC |
| cxcl10 murine reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | TTCATCGTGGCAATGATCTC |
| il6 murine forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC |
| il6 murine forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC |
References
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