Целью протокола является использование оптимальные способы стимулирования цитоплазматические пути зондирования ДНК в клетках и в естественных условиях. Это достигается за счет улучшения поколение долгого, двухцепочечной ДНК во тупым концом перевязки. Клетки или мышей затем трансфицируют с использованием реагента для трансфекции липидов.
Для того чтобы эффективно стимулировать врожденную иммунную реакцию, ДНК должна быть достаточной длины и чистоты. Мы представляем метод, где двухцепочечной ДНК (дц), который имеет все необходимые характеристики, чтобы стимулировать цитоплазматический ДНК пути зондирования могут быть сгенерированы дешево и с легкостью. К concatemerization коротких синтетических олигонуклеотидов, которые не имеют (CpG мотивы), дцДНК могут быть получены, чтобы иметь достаточную длину, чтобы активировать цитозольного зондирования ДНК пути. Этот протокол включает в себя тупым концом лигирование олигонуклеотидов в присутствии полиэтиленгликоля (ПЭГ), который обеспечивает среду для эффективного лигирования произойти. В concatemers дцДНК могут быть использованы, следующие очистки экстракцией фенолом / хлороформом, чтобы имитировать врожденного иммунного ответа в пробирке с помощью стандартных протоколов трансфекции. Эта ДНК может быть также использован для стимуляции врожденного иммунитета в естественных условиях внутрикожной инъекцией в ушной раковины мыши, например. Постандартизации процесса concatemerization и последующие протоколы стимуляции, надежным и воспроизводимым активации иммунной системы могут быть получены.
ДНК является жизненно важным компонентом всех организмов и клеток, которые эукариоты держать в определенных отсеков. Одна из функций иммунной системы, чтобы определить, когда такое компартментализация ломается или когда инородный материал вводится в организм через нарушение физических, внешних барьеров. В человеческом организме существует целый ряд белков, которые существуют, чтобы помочь ухудшить небольших количеств ДНК, которые могут избежать правильный дробления; ДНКазы I, II и III, сломать ДНК в плазме, эндосомы и цитозоле, соответственно. Тем не менее, было показано, что мыши, лишенные ДНКазу II умирает от тяжелой анемии, вызванной чрезмерным продукции интерферонов 1, предполагая, что врожденная иммунная система реагирует на экстра-ядерная ДНК. Этот ответ имеет место даже у мышей, которые полностью дефицит платной, как мощности передачи сигнала рецептором. Многочисленные исследования показали, что в настоящее время стимулятор генов интерферона (жало) 2 и БАК-связывания киназы 1 (ТБК1) 3 участвуют в обнаружении ДНК в цитоплазму и что этот сигнальный путь включает интерферон регуляторного фактора (МАФ) -3 4. Последующее IRF3-зависимой транскрипции цитокина, хемокина, и генов интерферона характерна для врожденного иммунного ответа к любой патогена или опасности, связанной молекулярной картины (ПАМП или влажные) 5.
Желание изучать внутриклеточные пути нуклеиновые кислоты зондирования привело к требованию, чтобы разработать надежные и воспроизводимые способы стимулирования клеток путем введения ДНК или РНК в клетки без активации другие врожденные иммунные ответы. Один из способов, с помощью которых жало / TBK1 / IRF3 путь может быть стимулировано путем использование катионных липидов реагентов трансфекции для доставки нуклеиновой кислоты в цитоплазму, где он может получить доступ с помощью датчиков, таких как ДНК, ДНК-ПК, IFI16, и CGAS 6-8.
Характеристики ДНК, которая в настоящее время поняты, чтобы позволить эффАктивация циент цитоплазматической врожденного иммунного ответа без стимуляции других путей являются его длина, масса, чистота, и отсутствие CpG мотивы 4,7,9. Синтетические олигонуклеотиды хорошо подходит для цели получения врожденной иммунной реакции, поскольку они позволяют последовательность ДНК, чтобы быть оптимизированы и получают в виде чистых химических соединений. 45 пар оснований иммуно-стимулирующий ДНК (ИСД) последовательность была определена Стетсоном и соавт. 4 как подходит, CpG-последовательности, свободной для этой цели. Эта последовательность двухцепочечной ДНК является в противном случае случайный и не имеет особенностей вне его отсутствия CpG мотивов. Мы обнаружили, что по concatemerizing ИСД олигонуклеотида в значительно более нитей увеличивает величину стимуляции 7. Генерация concatemerized ИСД Поэтому полезно для стимулирования цитоплазматический врожденный иммунный ответ. Здесь мы представляем протоколы за подготовку этого реагента и как он может быть использован для активации зондирования ДНК путь впробирке, а также в естественных условиях.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все исследования на животных проводятся по утвержденным институциональных протоколов и руководств по уходу за животными.
Протоколы, описанные здесь, используются для создания двухцепочечной ДНК, чтобы стимулировать цитозольного врожденной иммунной реакции с воспроизводимые результаты в широком диапазоне типов клеток и в естественных условиях. Так как основной реагент субстрат используется синте…
The authors have nothing to disclose.
Авторы не имеют подтверждения.
Forward Primer | Integrated DNA technologies | n/a | TACAGATCTACTAGTGATCTATGACTGATCTGTACATGATCTACA |
Reverse Primer | Integrated DNA technologies | n/a | TGTAGATCATGTACAGATCAGTCATAGATCACTAGTAGATCTGTA |
PEG8000 | Sigma-Aldrich | P-4463 | |
Molecular biology grade water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
T4 Polynucleotide Kinase | Promega | M4101 | |
T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | |
Phenol:Chloroform | Fisher Chemical | BPE1752p-400 | |
Chloroform | Fisher Chemical | C/4960/PB08 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | |
DNA gel loading buffer | New England biolabs | B7021S | |
Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
Optimem | Life Technologies | 11058021 | |
TransIT-LT1 | Mirus Bioscience | MIR 2300 | |
Hamilton Syringe | Hamilton | 80901 Model 1705 | |
30G needles | BD bioscience | 304000 | |
SYBR Safe DNA gel stain | Life Technologies | S33102 | |
Rneasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
Oligo(dT) primer | Thermo Scientific | SO131 | |
dNTP mix | Fermentas | R0192 | |
Super Script III reverse transcriptase | Life Technologies | 56575 | |
First strand cDNA synthesis buffer | Life Technologies | y02321 | |
SybrGreen qPCR Fast master mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
cxcl10 murine forward primer | Integrated DNA technologies | n/a | ACTGCATCCATATCGATGAC |
cxcl10 murine reverse primer | Integrated DNA technologies | n/a | TTCATCGTGGCAATGATCTC |
il6 murine forward primer | Integrated DNA technologies | n/a | GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC |
il6 murine forward primer | Integrated DNA technologies | n/a | GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC |