Summary
该协议的目的是要使用的最佳方法用于刺激细胞质DNA传感途径在细胞和体内 。这是通过平末端连接时改善长时间，双链DNA的生成来实现的。细胞或小鼠用脂质转染试剂转染。
Abstract
为了有效地刺激先天免疫应答的DNA必须具有足够的长度和纯度。我们提出了一个方法，其中双链DNA（dsDNA）的有必要的特性，刺激细胞质DNA的检测途径可以廉价且容易产生。由短的，合成的寡核苷酸（其缺乏CpG基序）的concatemerization，双链DNA可产生具有足够的长度，以激活细胞内的DNA检测途径。这个协议包括在聚乙二醇的存在下（PEG），它提供了有效的连接，以产生一个环境的寡核苷酸的平端连接。该双链DNA连环体，可以使用以下的纯化通过苯酚/氯仿萃取，以模拟由标准转染方案在体外的先天免疫应答。该DNA也可以用来刺激先天免疫在体内通过皮内注射到小鼠的耳廓，例如。由规范concatemerization过程和随后的刺激方案中，先天性免疫系统的可靠和可重复的活化可以生产。
Introduction
DNA是所有生物和细胞，真核细胞保持在特定车厢的重要组成部分。先天免疫系统的一个功能是确定当这种隔离发生故障或当异物经由违反物理，外部屏障引入到生物体中。在人体内有大量存在，以帮助降低少量的DNA，它可能逃过了正确的条块分割的蛋白质; DNA酶I，II和III分解的DNA在等离子体中，核内体，和胞质溶胶，分别。然而，已经证明，缺乏DNA酶II的小鼠免受过量产生干扰素1表明的严重贫血死了先天免疫系统响应外核DNA。这个反应发生时，即使在小鼠这是在Toll样受体信号转导的能力完全缺失。现在许多研究表明干扰素基因（STING）2和坦克结合激酶1（结核病的刺激K1）3顷涉及在细胞质中的DNA的检测，并且此信号转导途径激活干扰素调节因子（IRF）-3 4。细胞因子，趋化因子和干扰素基因的后续IRF3依赖性转录是要么病原体或危险相关分子模式（PAMP或者DAMP）5先天免疫应答的特性。
来研究细胞内的核酸检测通路的愿望已经导致要求开发可再生的方法，通过将DNA或RNA导入细胞中，而不激活其它先天免疫反应刺激细胞。一种方法，通过它的刺痛/ TBK1 / IRF3途径可刺激是通过使用阳离子脂质体转染试剂来递送核酸进入其中它可以通过DNA的传感器，如DNA-PK，IFI16，和C气体6-8被访问的细胞质中。
的DNA是目前的理解，让EFF的特点没有其他途径的刺激细胞质先天免疫应答的icient活化是其长度，质量，纯度和缺乏的CpG基序4,7,9。合成的寡核苷酸是高度适合于产生先天免疫应答，因为它们允许所述DNA序列进行优化，并制备成纯化学物种的目的。 A 45个碱基对的免疫刺激DNA（ISD）的序列进行鉴定的Stetson 等 4为是合适的，CpG的自由序列用于此目的。该双链DNA序列是随机的，否则，没有具体的功能超出了其缺乏CpG基序的。我们已经发现，通过concatemerizing的ISD寡成显著长链增加刺激7的大小。 concatemerized新闻处的产生，因此刺激细胞质先天免疫反应。这里，我们提出的协议用 于制备该试剂，以及它如何被用来激活该DNA传感通路在体外和体内 。
注：所有动物研究是根据批准的机构的协议和动物保健指导进行。
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Protocol
1 Concatemerization
- 引物悬浮FW和RV（见表材料的引物序列），以10微克/微升的分子生物学级别H 2 O的浓度然后，将5微升的FW和5微升旅行车底的1.5 ml离心管中。
- 退火引物混合物通过加热到正确的退火温度（75℃，此处描述的引物）15分钟。离开板凳上冷静下来，在室温（RT）。通过溶解在DDH 2 O准备孵育期间，60％的PEG8000
- 加入50μl的60％PEG8000（达到30％的终浓度），10微升的10倍多核苷酸激酶（PNK）缓冲液，27微升H 2 O和3微升PNK向引物混合物。在37℃下搅拌2小时。
- 冷却室温，加入11微升DNA连接酶缓冲液中。再加入DNA连接酶3 U和孵化，在37°C过夜。
2，DNA纯化与分析
- 加入300微升H 2 O的以增加连接混合物的体积。注：氯仿蒸汽：在通风橱中，由于酚的毒性继续。
- 加入1倍体积的苯酚（400微升）：氯仿并通过摇动剧烈混合。
- 离心机中以最大速度在台式离心1分钟。水性和溶剂层将分离在最上面的水层和沉淀的蛋白的两个层之间的白色层。
- 传送上层至新管通过小心移液（避免传输中，白层）
- 重复步骤2.2和2.3的至少两倍或直到没有沉淀的蛋白质离心后。
- 加入1体积的氯仿（400微升），然后重复步骤2.3-2.4。
- 添加100％预冷乙醇2卷（800微升），并培育在-20℃至少1小时或过夜。注：此步骤沉淀DNA的连环体。
- 降速以最大的速度和吸苏培rnatant。加入1ml的70％乙醇洗一次，并允许在空气中干燥在通风橱中。
- 重悬的DNA在50μl不含内毒素的DDH 2 O。注意：使用不含内毒素的试剂，是发生在细胞和体内的DNA特异性先天免疫反应的关键。
- 取下concatemerized DNA的2微升等分到一个新的管加入1 ml的DNA凝胶上样缓冲液。
- 溶解在TAE缓冲液的1％琼脂糖进行加热全功率在微波炉中2分钟（或时间，这是合适的烘箱和体积的功率）。
- 倾入凝胶浇注装置，加入4微升荧光DNA螯合染料，插入梳子，并在室温下离开的凝胶来设置大约20分钟。
- 一旦设定，取出梳子和地点的凝胶到含TAE缓冲液电泳槽。负载3微升的DNA样品或尺寸标记成井。
- 跑电泳30-40分钟，在90 V与恒定电流。 Visuali泽下紫外光将DNA观察concatemerization（ 图1A）。
- 测量在样品由UV吸收光谱的其余部分的DNA浓度。空白分光计具有相同的DDH 2 O的，是用来重悬DNA和从200-300纳米测量的吸收光谱。注：DNA浓度可以使用比尔 - 朗伯定律，A = E * C * L，其中A是吸光率来计算，e为消光系数，并且升的光路的距离。用于测量浓度DNA -1 -1所用的260nm处的吸光度应测定和0.027（微克/毫升）的消光系数。光路距离，升，将根据分光光度计变化。在测量浓度，注意到260/280吸光度比值作为DNA的纯度的指示;建议对上述2.00这个比例值。
3，转双链DNA连环中的Vi卓
- 种子细胞在组织培养皿或板为70％汇合，在刺激的时间。
- 计算DNA的需要使用的1-10微克/毫升的最终浓度的细胞的刺激物质。 DNA的所需的质量将会注意到为X以下。例如，如果在5微克/毫升的DNA的浓度则质量为2×5 = 10微克的DNA在6孔板中以2毫升培养基的单井刺激细胞是必需的。
- 添加50 * X微升无血清培养基中成适当大小的无菌管中。移液管小心地插入介质的中心位置，而不接触管，2 * X微升阳离子脂质转染试剂和离开5分钟的一侧。
- 添加DNA的第X微克到管和涡简要介绍。发表于室温至少20分钟。 体外转染直接添加该混合物的细胞，刺激细胞质DNA的检测途径。
4，转双链DNA连环I的Ñ体内
- 如在使用3.1-3.5 1微克的DNA，2微升的脂质转染试剂和18微升血清每只小鼠耳培养基被刺激描述制备转染混合物。准备一个无菌的20微升Hamilton注射器，瓶盖用无菌地下30针，并加载用DNA转染混合物。
- 麻醉来源于C57BL / 6小鼠用1-2％的异氟醚。通过移动和固定呼吸频率的损耗和捏反射测试，如果有必要确认麻醉。麻醉过程中监测动物的眼睛，用药膏的要求，以避免过度干燥。
- 使用无菌技术，注入小心到耳廓10微升转染混合物，使得液体的单个“泡沫”是耳朵的真皮层之间形成的。注意：使用的橡胶套管上的拇指或食指，伸展耳过它，并注入成锐角，以确保针穿透耳廓皮肤只有第一层。
- 收服troduce鼠标放回笼子，并定期监测后麻醉复苏。使用加热灯，以避免麻醉小鼠的过度冷却。不要让老鼠无人看管，直到他们重新获得足够的意识来维持胸骨斜卧。
- 闪光通过浸入液氮中2分钟，冻结在微量离心管中，整个耳廓。
5，处理的DNA刺激的样品和分析定量PCR技术（定量PCR）
- 从细胞培养：中吸用吸管和丢弃垃圾。
- 加入1 ml无菌PBS。重复5.1和5.2的两倍，并继续执行步骤5.3
- 从耳组织：使用无菌陶瓷杵和研钵在液氮下研磨组织，用消毒压舌板地组织转移到离心管中，并继续执行步骤5.4
- 添加350μL裂解液，并继续与商业RNA提取试剂盒的协议。洗脱RNA的提取纯化试剂盒在40微升DDH 2 O列注：商业RNA提取试剂盒（见材料/设备表）工作得很好;其他技术进行了测试与欠佳的结果。
- 如对以上的DNA（第2.13）量化紫外光谱的RNA。注意：消光系数为RNA是0.025（微克/毫升）-1厘米-1。
- 加入到无菌的PCR管中加入1μl的寡聚（dT）引物，1微升的10mM dNTP混合物，和250微克的RNA。补足体积至11微升用无菌DDH 2 O。
- 孵育5分钟，在65℃下。再加入4微升第一链缓冲液，1μl的0.1M的二硫苏糖醇，0.25微升反转录酶和1.75微升DDH 2 O的到所述管。孵育在50℃下进行1小时，随后在72℃下15分钟。使用DDH 2 O 5：可选，稀释cDNA产物1
- 对于定量PCR使用2微升的cDNA，2微升DDH 2 O 5微升的qPCR预混液和1μL每10 uM的正向和反向引物储备来扩增所选择的基因（次）。混合，在96孔板中，并使用定量PCR仪（ 图1B和图1C）进行分析。
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Representative Results
下面的结果表明，可以相对容易地产生concatemerized DNA和能够刺激在细胞和小鼠健壮的先天免疫应答。与使用PEG8000的，它可以清楚地看出，DNA的生成长度为显著较长，同样能够诱导CXCL10的转录。所看到的琼脂糖凝胶分析中，标准concatemerization具有高达800个碱基对（bp）的DNA的长度，而对于与PEG8000的样品，DNA的长度，包括在超过10,000 bp的（ 图1A）链。这些DNA插入小鼠胚胎成纤维细胞（MEF中）或小鼠的转染诱导细胞因子和趋化因子的转录强劲，可以通过定量PCR进行测量，指示先天免疫的DNA检测设备（ 图1B和1C）的刺激。
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图1：典型的数据表明的concatemerized新闻处的DNA（conDNA）生产的成纤维细胞和小鼠和刺激。（一）concatemerized DNA的样品制作带或不带PEG8000用琼脂糖凝胶电泳分析。 （B）中的MEF刺激与各种的DNA在10微克/毫升和CXCL10和IL-6的mRNA水平通过qPCR测定6小时后。 （C）给小鼠注射12小时后通过qPCR测定的耳朵羽片与conDNA和CXCL10的水平和IL-6的mRNA。数据显示为相对于HPRT（RQ）和误差棒的水平倍增加是+/- SEM（n = 3时）。
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Discussion
这里所述的协议被用于产生双链DNA，以刺激与在广泛的细胞类型并在体内可再现的结果胞质先天免疫应答。因为所用的主要底物的试剂是人工合成的寡核苷酸，存在于该系统中，使用替代性的DNA序列或化学修饰的灵活性。这是可能的，例如，以取代在本协议与一个包含荧光标记或生物素部分跟踪定位或评估与其它生物分子的相互作用所描述的正向链寡核苷酸。
之一的DNA concatemerization的主要优点是生产的dsDNA的方式长链的序列可以被控制的。有一个限制在这里它是DNA的长度不能被精确地监测，以便该反应的产物是总是不同长度的DNA（类似于商业的RNA类似物的聚（Ⅰ的混合物：C））。该技术的另一个优点是，它允许生产的免疫刺激DNA（最多毫克的量）大的质量的数量。该concatemerization步骤可以容易地按比例放大的要求，但应当注意的是，随后的纯化步骤，然后应在协议中列出的比例的等分试样进行。
相比concatemerizing DNA的其它方法，主要的加成是使用PEG8000到连接混合物来提高连接效率。需要注意的是PEG8000可能难以溶解，使60％（重量/体积）的库存，但可涡旋并温和加热以帮助溶解。结扎可以留给孵育较长时间比表示，但这似乎不影响所产生的DNA的长度。一些护理的需求也处理苯酚和氯仿的时候，因为这些可致癌和腐蚀性观察。我们手中的基因被上调等合成的DNA（如商业聚（DA：dT）的）是从那些由concatemerized ISD上调不同。然而，其他人发现，这样的差异10，其可反映细胞类型之间的变化被分析。尽管有这样的冲突，concatemerized ISD是显著便宜，以产生时相比购买的聚（dA的：dT）的从商业来源，并且允许通过选择序列和修改的更大的灵活性。
DNA检测的一个方面是在深入研究的是在体内刺激反应。我们已经表明，这个协议可以被用于产生适合于在体内实验7的DNA。该双链DNA的产品是纯足够高的浓度，并允许注射到小鼠和先天免疫信号传导过程进行后续计量。在这里描述的方案，必须小心，以确保用于溶解的最终DNA沉淀的水是内毒素，核糖核酸酶，脱氧核糖核酸酶和游离。注入的游离DNA或DNA-脂质复合物的结果如预期的DNA检测过程，并且作为这样的干扰素响应，concatemerized DNA可以用于探查的DNA检测体内的多个方面。
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Acknowledgments
作者没有确认。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | TACAGATCTACTAGTGATCTATGA CTGATCTGTACATGATCTACA |
| Reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | TGTAGATCATGTACAGATCAGT CATAGATCACTAGTAGATCTGTA |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | P-4463 | |
| Molecular biology grade water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| T4 polynucleotide kinase | Promega | M4101 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| Phenol:chloroform | Fisher Chemical | BPE1752p-400 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | C/4960/PB08 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | |
| DNA gel loading buffer | New England Biolabs | B7021S | |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Optimem | Life Technologies | 11058021 | |
| TransIT-LT1 | Mirus Bioscience | MIR 2300 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80901 Model 1705 | |
| 30 G needles | BD Bioscience | 304000 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Life Technologies | S33102 | |
| Rneasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Oligo(dT) primer | Thermo Scientific | SO131 | |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | |
| Super Script III reverse transcriptase | Life Technologies | 56575 | |
| First strand cDNA synthesis buffer | Life Technologies | y02321 | |
| SybrGreen qPCR Fast master mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| cxcl10 murine forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | ACTGCATCCATATCGATGAC |
| cxcl10 murine reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | TTCATCGTGGCAATGATCTC |
| il6 murine forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC |
| il6 murine forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC |
References
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